Visualisierung und Quantifizierung der TGFβ/BMP/SMAD-Signalisierung unter verschiedenen Fluidscherspannungsbedingungen mittels Proximity-Ligation-Assay

Hier etablieren wir ein Protokoll zur gleichzeitigen Visualisierung und Analyse mehrerer SMAD-Komplexe mittels Proximity Ligation Assay (PLA) in Endothelzellen, die pathologischen und physiologischen Flüssigkeitsscherstressbedingungen ausgesetzt sind.

Dieses Protokoll ermöglicht es Wissenschaftlern, die Anzahl der Transkriptionsfaktorkomplexe unter verschiedenen Scherstressbedingungen quantitativ zu vergleichen, und wird für die Forschung in der Gefäßbiologie von Vorteil sein. Der Hauptvorteil dieses Protokolls ist die Verwendung von mikrofluidischen Flusskanälen, die Untersuchungen mehrerer Antikörperpaare einschließlich der jeweiligen Kontrollen gleichzeitig ermöglichen. Um zu beginnen, beschichten Sie den Sechs-Kanal-Objektträger, indem Sie 0,1% Schweinehautgelatine, die in PBS hergestellt wurde, für 30 Minuten bei 37 Grad Celsius in die Kanäle geben.

Entleeren Sie die Kanäle aus der Gelatinelösung und säen Sie Huvecs in die vorcodierten sechs Kanalobjektträger mit einer Dichte von 2,5 mal 10 bis zu den sechsten Zellen pro Milliliter in 30 Mikroliter M199-Gesamtmedium. Lassen Sie die Zellen eine Stunde lang bei 37 Grad Celsius im befeuchteten Inkubator haften. Fügen Sie jedem der Reservoirs 60 Mikroliter vorgewarntes M199-Komplettmedium hinzu.

Kultivieren Sie die Zellen bei 37 Grad Celsius für zwei Tage in einem befeuchteten Inkubator mit mittlerem Ersatz nach 24 Stunden. Montieren Sie den Silikonschlauch auf den fluidischen Einheiten, füllen Sie die Behälter mit mindestens 10 Millilitern vorgewarntem M199-Komplettmedium. Schließen Sie die fluidischen Einheiten mit Schläuchen an das Pumpensystem an und führen Sie den Vorlauf ohne Zellen durch, um das Medium auszugleichen und die verbleibende Luft zu entfernen.

Verbinden Sie die einzelnen Kanäle auf dem Sechs-Kanal-Dia mit dem seriellen Anschlussschlauch. Verbinden Sie den ersten und letzten Kanal auf dem Schlitten mit den an der Fluidikeinheit montierten Rohren. Für die Exposition der Zellen gegenüber einem hohen Grad an reinem Stress erhöhen Sie den schieren Stress schrittweise mit Anpassungsphasen und stellen Sie die Schritte in Schritten von fünf Dynes pro Quadratzentimeter pro 30 Minuten ein.

Verwenden Sie die Klumpen am Schlauch, um die Schlitten nach der Belastung durch Flüssigkeitsscherung von den Pumpen zu lösen, um ein mittleres Verschütten im Inkubator zu vermeiden und Strömungsschieber auf Eis zu übertragen. Während Sie den Schlauch von den Behältern lösen, verwenden Sie den Finger, um die andere Seite des Reservoirs zu schließen, um zu vermeiden, dass die Luftblasen im Kanal eingeschlossen werden. Halten Sie den Strömungsrutsch auf Eis und saugen Sie das Medium vorsichtig aus den Reservoirs ab, aber nicht aus dem Kanal, in dem sich die Zellen befinden.

Waschen Sie die Proben mit 90 Mikrolitern kaltem sterilem PBS, indem Sie PBS zu einem Reservoir hinzufügen und vorsichtig aus dem anderen Reservoir absaugen, dann wiederholen Sie es für alle Kanäle. Fixieren Sie die Zellen, indem Sie 90 Mikroliter gepufferte 4% PFA-Lösung in dasselbe Reservoir geben, in dem das PBS hinzugefügt wurde, und aspirieren Sie die Flüssigkeit aus dem anderen Reservoir, wie gezeigt. Nachdem Sie die Zellen in allen sechs Kanälen fixiert haben, übertragen Sie die Proben von Eis auf Raumtemperatur und inkubieren Sie für 20 Minuten.

Waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS, indem Sie PBS zu einem Reservoir hinzufügen und es vorsichtig aus dem anderen Reservoir in allen Kanälen absaugen, wobei sie darauf achten, die Kanäle nicht auszutrocknen. Quench-Zugang PFA durch Zugabe von 90 Mikrolitern 15 Millimolar Ammoniumchlorid in der Umgebung, das in PBS hergestellt wurde, zu einem der Reservoirs. Aspirieren Sie aus dem anderen Reservoir und inkubieren Sie die Zellen für 10 Minuten.

Permeabilisieren Sie die Zellen durch Zugabe von 90 Mikrolitern von 0,3% Triton X 100, die in PBS in dem leeren Reservoir hergestellt wurden. Für jeden Kanal aus dem anderen Reservoir absaugen und 10 Minuten inkubieren, dann dreimal mit PBS gewaschen, wie zuvor gezeigt. Bei 90 Mikrolitern steriler PLA-Blockierlösung zu einem Reservoir.

Für jeden Kanal von der anderen Seite absaugen und eine Stunde bei 37 Grad Celsius in einer befeuchteten Kammer inkubieren. Fügen Sie primäre Antikörper in PLA-Antikörperverdünner und Wirbel hinzu. Aspirieren Sie die blockierende Lösung vorsichtig aus den Reservoirs und Kanälen.

30 Mikroliter der primären Antikörperlösung sofort in den leeren Kanal geben, indem sie den Objektträger kippen, während die Lösung hinzugefügt wird. Für alle Kanäle wiederholen und bei vier Grad Celsius in der befeuchteten Kammer über Nacht oder bei 37 Grad Celsius für eine Stunde inkubieren. Verdünnen Minus Kaninchen und plus Maus PLA Sonden ein bis fünf im PLA Antikörperverdünnungsmittel.

Waschen Sie alle Kanäle zweimal, indem Sie 90 Mikroliter Waschpuffer A hinzufügen und wie gezeigt absaugen. Nach dem Absaugen des Waschpuffers 30 Mikroliter PLA-Sondenlösung zugeben und in der befeuchteten Kammer inkubieren. Verdünnen Sie den Ligationspuffer ein bis fünf in D ionisiertem Wasser und verdünnen Sie das Lygusenzym eins auf 40 im verdünnten Ligationspuffer.

Nach dem Waschen und vollständigen Absaugen des Waschpuffers A 30 Mikroliter Ligationslösung in die leeren Kanäle geben, während sie den Objektträger kippen, und in der befeuchteten Kammer inkubieren. Verdünnen Sie den Amplifikationspuffer ein bis fünf in entionisiertem Wasser, dann verdünnen Sie das Polymerase-Enzym eins auf 80 im verdünnten Amplifikationspuffer auf Eis. Nach dem Waschen und vollständigen Absaugen des Waschpuffers A 30 Mikroliter Verstärkungslösung in die leeren Kanäle geben, während sie den Objektträger kippen, und inkubieren Sie ihn in der befeuchteten Kammer.

Verdünnen Sie das DAPI eins auf 500 in Waschpuffer B und waschen Sie alle Kanäle einmal, indem Sie 90 Mikroliter DAPI, die Waschpuffer B enthalten, hinzufügen und absaugen, wie gezeigt, um die Kerne zu dämpfen. Waschen Sie dann alle Kanäle einmalig mit Waschpuffer B ohne DAPI. Verdünnen Sie den Waschpuffer B eins bis 10 in entionisiertem Wasser und waschen Sie alle Kanäle einmal mit 90 Mikrolitern verdünntem Waschpuffer B.Nach dem Ansaugen von Waschpuffer B sofort zwei bis drei Tropfen des flüssigen Montagemediums zu einem Reservoir geben und den Schlitten neigen, um das Montagemedium in allen Kanälen zu verteilen.

Lagern Sie die Proben bei vier Grad Celsius in einer befeuchteten Umgebung bis zur Bildgebung. Huvecs waren hohem und niedrigem Stress ausgesetzt. Der geringe Scherstress erhöhte die SMAD-Proteininteraktionen im Zytosol und in den Kernen.

Einzelne Antikörperkontrollen zeigten keine bis sehr wenige Signale, was den Erfolg des Experiments beweist. Eine erhöhte Antikörperkonzentration führte zu einer höheren Anzahl von PLA-Ereignissen pro Zelle, aber der Unterschied in den PLA-Signalen zwischen Hoch- und Niedrigstress-exponierten Zellen wurde reduziert. Selbst hergestellte Puffer zur Blockierung und Antikörperverdünnung können als Alternative für kommerzielle Puffer verwendet werden.

Die Quantifizierung von PLA-Ereignissen für kommerzielle und selbst hergestellte Verdünnungs- und Blockierungslösungen zeigte das gleiche Muster von PLA-Signalen im zytosolischen und nuklearen Bereich. Die Gesamtzahl der PLA-Ereignisse pro Zelle war jedoch bei kommerziellen Lösungen höher. Eine Kombination aus SMAD Two/Three, SMAD Four Antikörpern wurde verwendet, wo der SMAD Four Antikörper nicht für Immunfluoreszenzexperimente geeignet war.

Es gab keinen Unterschied zwischen den PLA-Ereignissen in der experimentellen versus Kontrollbedingung, was darauf hindeutet, wie wichtig es ist, die richtige Antikörperkombination zum Nachweis der PLA-Ereignisse auszuwählen. Das beschriebene Protokoll kann angepasst werden, um die Wechselwirkungen von Transkriptionsfaktorkomplexen, die sich von SMADs unterscheiden, zu erkennen und somit die Genregulation unter athero- und atheroprotektiven Bedingungen zu verstehen.