Genetischer Screen zur Identifizierung von Multicopy-Suppressoren in Schizosaccharomyces pombe

Suppressor-Screens identifizieren genetische Interaktionen, die Aufschluss über die Funktionen des interessierenden Gens sowie über die Wege und biologischen Prozesse geben, an denen sie in vivo beteiligt sein könnten. Diese Technik kann eine genetische Verwandtschaft zwischen zwei Genprodukten identifizieren, die mit anderen Ansätzen möglicherweise nicht nachgewiesen wurde. Die Ergebnisse solcher Screens in Hefe können auf hocheukaryotische Organismen ausgedehnt werden, da die meisten grundlegenden biologischen Wege und Prozesse in der Evolution erhalten bleiben.

Der Erfolg des Programms hängt von der Verfügbarkeit von hoher Qualität und der hohen Effizienz seiner Umwandlung in Hefezellen ab. So wird das Transformationsprotokoll mit dem Plasmid vor dem Wachsen des Schizosaccharomyces pombe ell1-Deletionsstamms bei 32 Grad Celsius auf YE-Mediumplatte durchgeführt. Nehmen Sie eine Schlaufe voller ell1-Mutantenstamm von der Platte, impfen Sie fünf Milliliter ergänztes YE-Medium und inkubieren Sie dann die Durchstechflasche, während Sie über Nacht bei 32 Grad Celsius schütteln.

Nach der Inkubation verdünnen Sie die Wachstumskultur über Nacht in 100 Milliliter frischem YE-Medium, das die gewünschten Ergänzungen enthält, um eine optische Dichte von 0,3 bei 600 Nanometern zu erreichen. Inkubieren Sie das Medium bei 32 Grad Celsius und schütteln Sie es bei 200 bis 550 U/min, bis die optische Dichte bei 600 Nanometern die Mid-Log-Phase erreicht. Nach der Aufteilung der 100 Milliliter Kultur in zwei 50-Milliliter-Zentrifugenröhrchen pelletieren Sie die Zellen bei 4.000 mal G für 10 Minuten bei Raumtemperatur.

Sobald der Überstand verworfen ist, resuspendieren Sie das Zellpellet in einem Milliliter sterilem Wasser. Zentrifugieren und verwerfen Sie den Überstand erneut und resuspendieren Sie dann das Zellpellet in einem Milliliter Lithiumacetat TE. Pelletieren Sie die Zelle durch Zentrifugation und resuspendieren Sie jedes Zellpellet in 250 Mikroliter Lithiumacetat TE. Anschließend werden 125 Mikroliter der kompetenten Zellen in vier verschiedene sterile Mikrozentrifugenröhrchen für nachfolgende Transformationsschritte überführt. Kochen Sie Träger-DNA aus Lachshoden oder Heringssperma für eine Minute und legen Sie die Röhre sofort auf Eis.

Für jede Transformation 10 Mikroliter einzelsträngige Träger-DNA in das Mikrozentrifugenröhrchen mit 125 Mikrolitern der kompetenten Zellen geben und vorsichtig durch Pipettieren mischen. Anschließend werden 50 Mikrogramm der Schizosaccharomyces pombe cDNA-Bibliothek in das Röhrchen mit kompetenten Zellen und Träger-DNA-Mischung gegeben. Nach 10-minütiger Inkubation des Röhrchens bei Raumtemperatur 260 Mikroliter Polyethylenglykol-Lithiumacetat-Lösung hinzufügen und durch Pipettieren mischen.

Das Röhrchen mit dem Transformationsgemisch bei 32 Grad Celsius zwei Stunden lang ohne Schütteln inkubieren. 43 Mikroliter vorgewärmtes Dimethylsulfoxid in die Tube geben und vorsichtig mischen. Setzen Sie den Schlauch nun fünf Minuten lang einem Hitzeschock bei 42 Grad Celsius aus.

Pelletieren Sie die Zellen und verwerfen Sie den Überstand, wie zuvor gezeigt, und pipettieren Sie dann die verbleibende Polyethylenglykol-Lithiumacetat-TE-Lösung. Resuspendieren Sie die Zellen in 100 Mikrolitern sterilem Wasser und legen Sie sie auf eine EMM2-Platte, die die erforderlichen Ergänzungen und 0,2 Mikrogramm pro Milliliter 4-NQO enthält. Lassen Sie dann Kolonien auf den Platten erscheinen, indem Sie die Platten fünf bis sechs Tage lang bei 32 Grad Celsius inkubieren.

Für das weitere Screening streifen Sie die erhaltenen Kolonien auf derselben mittleren Platte in Gegenwart von 0,2 Mikrogramm pro Milliliter 4-NQO. Für ein Bibliothekstransformationsexperiment verwenden Sie 500 Mikroliter kompetenter Zellen für die Transformation und Platte 1 x 10 der Transformationsmischung auf EMM2-Platte mit erforderlichen Ergänzungen ohne 4-NQO, um die Gesamtzahl der Bibliothekskone zu berechnen, die nach der Transformation erhalten wurden, und suchen Sie nach den Suppressorklonen. Fügen Sie 100 bis 200 Mikroliter steriles Wasser in jede Vertiefung einer sterilen 96-Well-Mikrotiterplatte hinzu.

Nehmen Sie mit einem sterilen Zahnstocher oder einer 20- bis 200-Mikroliter-Mikropipettenspitze eine kleine Menge Inokulum aus jeder Kolonie heraus, die nach der Transformation der cDNA-Bibliothek auf der Platte mit 4-NQO erhalten wurde. Fügen Sie das Inokulum aus jeder der verschiedenen Kolonien in jede Vertiefung der Platte mit sterilem Wasser hinzu und mischen Sie gründlich. Erkennen Sie drei Mikroliter der Zellsuspension aus jeder Vertiefung auf EMM2-Agarplatten und fügen Sie den Platten entsprechende Konzentrationen von 4-NQO hinzu.

Nachdem Sie die Zellen drei bis vier Tage lang bei 32 Grad Celsius wachsen lassen, identifizieren Sie die Kolonien, die Wachstum in verschiedenen Konzentrationen von 4-NQO als mutmaßliche Suppressoren zeigen. Um die Suppressoren weiter zu validieren, züchten Sie die ausgewählten Suppressoren und geeigneten Kontrollstämme in EMM2-Medium, das 225 Mikrogramm pro Milliliter Adenin und Uracil enthält, bei 32 Grad Celsius über Nacht mit Schütteln. Nach dem Ende der Inkubation verdünnen Sie die Zellen auf eine optische Dichte von 0,3 in frischem EMM2-Medium und züchten sie unter Schütteln bei 32 Grad Celsius bis zur mittleren Log-Phase.

Erkennen Sie geeignete serielle Verdünnungen von Kulturen auf EMM2-Platten mit erforderlichen Ergänzungen, die entweder 0,4 Mikromolare 4-NQO oder 0,01% MMS enthalten. Zur Kontrolle erkennen Sie die Stämme auf einer EMM2-Platte mit den erforderlichen Ergänzungen, aber ohne DNA-schädigendes Mittel. Inkubieren Sie die Platten bei 32 Grad Celsius für drei bis fünf Tage, um das Wachstum zu überwachen.

Erkennen Sie die mutierten Stämme, die mit dem interessierenden Gen in voller Länge oder dem leeren Vektor als positive bzw. negative Kontrollen transformiert wurden, zusammen mit den Bibliothekstransformanten. Beimpfen Sie eine einzelne Hefekolonie in EMM2-Medium, das 225 Mikrogramm Adenin und Uracil pro Milliliter enthält, und züchten Sie die Zellen bei 32 Grad Celsius über Nacht mit Schütteln bei 200 bis 250 U/min. Am Ende der Inkubation ernten Sie 10 Milliliter Kultur der optischen Dichte 0,5 durch Zentrifugieren bei 4.000 mal G für zwei Minuten bei Raumtemperatur.

Entfernen Sie den Überstand und resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,2 Milliliter Lysepuffer. 0,2 Milliliter Phenolchloroform-Isoamylalkohol und 0,3 Gramm säuregewaschene Glasperlen in das Mikrozentrifugenröhrchen geben. Mischen Sie, indem Sie das Rohr zwei Minuten lang vortexen, gefolgt von einer Minute Inkubieren auf Eis.

Zentrifugieren Sie das Röhrchen bei 10.000 mal G für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Die obere wässrige Schicht in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen geben und 200 Mikroliter Phenolchloroform-Isoamylalkohol hinzufügen. Nach erneutem Zentrifugieren bei 10.000 mal G für 10 Minuten wird die obere wässrige Schicht in ein frisches Röhrchen überführt.

Dann fügen Sie zwei Volumina 100% Ethanol und 1 x 10 Volumen Natriumacetat in das Röhrchen und inkubieren Sie bei minus 70 Grad Celsius für eine Stunde. Die DNA durch Zentrifugation bei 10.000 mal G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius ausfällt und den Überstand entfernen. Waschen Sie das DNA-Pellet mit 70% Ethanol und trocknen Sie es an der Luft bei Raumtemperatur.

Resuspendieren Sie die DNA in 20 Mikrolitern sterilem Wasser und verwenden Sie drei bis fünf Mikroliter Plasmid-DNA, um kompetente Escherichia coli-Zellen zu transformieren. Unter Verwendung des Standardprotokolls die isolierten Hefeplasmide in Escherichia coli TOP10-Stamm umwandeln und die Zellen mit den erforderlichen Antibiotika auf LB-Platten verteilen. Nach der Isolierung des Plasmids aus Escherichia coli-Transformanten unter Verwendung des alkalischen Standard-Lyseprotokolls folgen Sie den entsprechenden Kombinationen von Restriktionsenzymen, um die Freisetzung des DNA-Fragments durch Restriktionsaufschluss zu überprüfen.

Als nächstes retransformieren Sie die Plasmide, die eine Insertfreisetzung nach Restriktionsaufschluss im ell1-Deletionsstamm zeigen, um ihre Fähigkeit zu überprüfen, den genotoxischen stresssensitiven Phänotyp des ell1-Deletionsstamms zu retten. Der ell1-gelöschte Schizosaccharomyces-pombe-Stamm zeigte im Vergleich zum Wildtyp-Stamm eine Empfindlichkeit gegenüber 4-NQO. Eine große Anzahl von Kolonien wird auf der Platte ohne 4-NQO erhalten.

Auf der 4-NQO-Platte wurden jedoch weniger Transformanten erhalten, da sie als Strafsuppressoren der 4-NQO-Empfindlichkeit der ell1-Nullmutante wirken. Von den 620 Transformanten zeigten 74 ein Wachstum auf 0,4-Mikromolar 4-NQO. Es wurde beobachtet, dass nur 16 von 74 ein Wachstum in Gegenwart von 0,8-Mikromolar 4-NQO zeigten.

Der ell1-Deletionsstamm transformierte sich mit einem leeren Vektor und alle 16 Transformanten zeigten Wachstum auf der Platte ohne 4-NQO. Die ell1-Deletionsmutante, die nur den leeren Vektor enthielt, zeigte kein Wachstum bei 0,8-Mikromolar 4-NQO und sechs Transformanten zeigten Wachstum bei 0,8-Mikromolar 4-NQO, was darauf hindeutet, dass die in ihnen vorhandenen Bibliothekskone den genotoxischen Stressphänotyp der ell1-Nullmutante unterdrücken könnten. Der Restriktionsaufschluss des Suppressorplasmids 84 und 104 setzte einen Einsatz von einer Kilobase bzw. 800 Basenpaaren frei.

Die Wiedereinführung der Suppressorplasmidklone in die ell1-Nullmutante führte zur Unterdrückung der 4-NQO-assoziierten Wachstumssensitivität. In Gegenwart von MMS zeigten die Suppressorplasmide, die ell1-Deletionsmutanten enthielten, jedoch mehr Wachstum als diejenigen mit leerem Vektor. Diese genetischen Screens können potenzielle Resistenzmechanismen abgrenzen und Proteinziele neuer antibakterieller, antimykotischer, antiparasitärer oder krebshemmender Verbindungen identifizieren.

Sie können auch den Wirkmechanismus von Arzneimitteln identifizieren.