Rapid Optical Clearing für die Semi-Hochdurchsatzanalyse von Tumorsphäroiden

Mein Labor ist spezialisiert auf die drei- und vierdimensionale Tumormodellierung. Tumor-Sphäroid-Modelle sind in der gesamten Biologie und Arzneimittelforschung weit verbreitet. Bestehende Protokolle zum Sammeln von Daten aus diesen Experimenten sind jedoch teuer, schwierig und begrenzt.

Dieses Protokoll erfordert leicht zugängliche Chemikalien und Ausrüstungen und ist im Vergleich zu aktuellen Methoden, die ähnliche Ergebnisse liefern, nicht sehr arbeitsintensiv. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um für Anfänger relativ einfach zu implementieren und robust gegenüber kleinen Fehlern zu sein, da viele der Schritte reversibel sind. Beginnen Sie mit einem Gewicht von 0,5 Gramm niedrigschmelzender Agarose in einer Glasflasche.

Und fügen Sie 25 Milliliter PBS hinzu. Schmelzen Sie die Agarose, indem Sie die Lösung 30 bis 60 Sekunden lang bei geschlossenem Deckel in der Mikrowelle kochen und ständig schwenken. Wiegen Sie neun Gramm N, N, N'N'Tetrakis (2-hydroxypropyl) ethylendiamin, 22 Gramm Harnstoff, 44 Gramm Saccharose, 0,1 Gramm Triton X-100 und 24,9 Gramm entionisiertes Wasser.

Erhitzen Sie die Lösung in einem 56 Grad Celsius heißen Wasserbad mit konstantem Mischen. Nachdem die Kristalle aufgelöst sind, ruhen Sie die Lösung bei Raumtemperatur, damit die beim Mischen gebildeten Blasen an die Oberfläche aufsteigen können. Erzeugen Sie Sphäroide mit der im Textmanuskript beschriebenen Agarose-Overlay-Methode.

Schneiden Sie die Spitze einer Ein-Milliliter-Pipettenspitze mit einem Skalpell ab, um die Öffnung zu vergrößern. Mit der Pipette saugen Sie die Sphäroide aus den Vertiefungen ab und geben Sie sie in ein klares 1,5-Milliliter-konisches Rohr. Mehrere Sphäroide aus den gleichen Bedingungen können in derselben Röhre kombiniert werden.

Waschen Sie die Sphäroide zweimal in einem Milliliter PBS, fügen Sie dann neutrale 4% vorgewärmte Paraformaldehydlösung hinzu und inkubieren Sie die Sphäroide bei 37 Grad Celsius. Nach 20 Minuten die Paraformaldehydlösung entfernen und die Sphäroide zweimal mit einem Milliliter PBS waschen. Dann zum Färben bis zu 15 Sphäroide mit einer Pipette in ein 200-Mikroliter-PCR-Röhrchen übertragen.

Permeabilisieren Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern 0,5% Triton X-100 in PBS. Legen Sie die PCR-Röhrchen in 50 Milliliter, verschrauben Sie die Röhrchen und bedecken Sie die Röhrchen mit Aluminiumfolie und inkubieren Sie die Sphäroide bei Raumtemperatur mit leichtem Rühren. Nach zwei Stunden die Lösung durch 200 Mikroliter Antikörper-Verdünnungspuffer ersetzen und über Nacht bei Raumtemperatur inkubieren.

Am nächsten Tag entfernen Sie den Antikörper-Verdünnungspuffer, bevor Sie 75 Mikroliter primären Antikörper hinzufügen und zweieinhalb Tage bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation den Überstand entfernen und die Sphäroide zweimal mit 200 Mikrolitern PBS waschen, die 0,1% Tween und 0,1% Triton X-100 oder PBS-TT enthalten. Anschließend mit 200 Mikrolitern PBS-TT vier Stunden bei Raumtemperatur inkubieren.

Als nächstes entfernen Sie PBS-TT, bevor Sie 100 Mikroliter des sekundären Antikörpers hinzufügen und zweieinhalb Tage bei vier Grad Celsius inkubieren. Nach der Inkubation den Überstand entfernen und zweimal mit PBS-TT waschen, bevor Sie vier Stunden lang mit 200 Mikrolitern PBS-TT inkubieren. Verwenden Sie für die Montage eine 200-Mikroliter-Pipette, übertragen Sie feste und gefärbte Sphäroide auf 500-Mikroliter-PCR-Röhrchen bei einem Röhrchen pro Zustand.

Ersetzen Sie die Lösung durch 200 Mikroliter 2% flüssiges Agarosegel und zentrifugieren Sie 30 Sekunden lang bei der schnellen Drehung bei der festen Höchstgeschwindigkeit bei Raumtemperatur. Die Sphäroide in 50 Mikroliter flüssiges Agarosegel einsaugen und in die Vertiefung einer 24-Well-Glasbodenplatte dosieren. Bevor das Gel aushärtet, trennen Sie die Sphäroide mit einer Pipettenspitze im umgebenden Gel und stellen Sie sicher, dass die Sphäroide mit Gel bedeckt sind.

Als nächstes tauchen Sie das Gel ein, indem Sie 500 Mikroliter Reinigungslösung pro Vertiefung hinzufügen, und inkubieren Sie bei Raumtemperatur im Dunkeln für 24 Stunden vor der Bildgebung. Wählen Sie für die Bildgebung ein Objektiv mit einem Arbeitsabstand, der lang genug ist, um das gesamte Sphäroid einschließlich der Montagehöhe des Sphäroides im Gefäß zu erfassen. Um die Äquatorebene zu identifizieren, passen Sie den Fokus an, bis die größte Oberfläche in der XY-Ebene erreicht ist, und bilden Sie mit dem erforderlichen Laserleistungsprozentsatz, der Detektorspannung, der Verstärkung und dem Offset ab.

Stellen Sie für dreidimensionale Bilder den Anfang und das Ende der Sphäroide ein und wählen Sie die entsprechende Signalintensität in verschiedenen Z-Tiefen mithilfe der Einstellungen für die Z-Intensitätskorrektur. Diese Studie zeigt einen Vergleich von geklärten und nicht geklärten humanen Melanom-Sphäroiden von FUCCI im Vergleich zu PBS-montierten Sphäroide. Die Clearing-Lösung liefert Bilder mit hoher Klarheit und minimaler Größenverzerrung.

Die Clearing-Lösung ermöglicht außerdem eine hochauflösende Bildgebung von Details auf zellulärer Ebene tiefer in die Sphäroide ohne histologische Schnitte. Mit dreidimensionalen konfokalen Bildern können Details auf zellulärer Ebene in einer Tiefe von 200 Mikrometern erhalten werden. Weiterhin wird ein Vergleich zwischen kryogeschnittenem und geklärtem Lochsphäroid, gefärbt für Pimonidazol und p27kip1, gezeigt.

Die Pimonidazol-Färbung zeigt die hypoxische Region des Sphäroides, und die p27kip1-Färbung markiert den Zellzyklusstillstand und die DAPI-Kernfärbung. Tiefere Penetration und weniger Streuung ermöglichen eine verbesserte dreidimensionale Sphäroidstrukturdarstellung mit minimalem Lichtverlust. Die dreidimensionale Darstellung der mit DRAQ7 gefärbten FUCCI-Sphäroide wird gezeigt.

Die Clearing-Lösung hat nur minimale Auswirkungen auf die Sphäroidgröße. Der Durchmesser des Sphäroides wurde anhand einer Kugel mit der gleichen Querschnittsfläche wie das Sphäroid definiert. Es wurde beobachtet, dass die Sphäroide in den ersten sechs Stunden leicht an Größe zunahmen, was durch eine Umfangsfaltenänderung zwischen 2% und 6% angezeigt wird.Im Gegensatz dazu kehrten die Sphäroide nach 24 bis 72 Stunden zu einer Größe zurück, die ungefähr der entsprechenden Größe bei PBS-postparaformaldehyd-Fixierung entspricht.

Es ist wichtig, mindestens 24 Stunden vor der Bildgebung zu warten, damit die Reinigungslösung mit den Sphäroiden und dem Gel ausgeglichen ist. Dieses Protokoll ermöglicht es Praktikern, schnell Daten von einer großen Anzahl von Sphäroiden zu sammeln, was eine detaillierte quantitative mathematische und statistische Analyse ermöglicht, die detaillierte Einblicke in die Biologie bietet.