Name: Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Fettendothelzellen und Adipozyten im menschlichen subkutanen Fettgewebe (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-04-05T14:35:00.000+00:00
Duration: 6 min 35 s
Description: Erfahren Sie die Isolierung und Charakterisierung mikrovaskulärer Endothelzellen aus humanem subkutanem Fettgewebe zur Untersuchung der Zell-Zell-Kommunikation mit Adipozyten. Diese Methode ermöglicht kardiometabolische Forschung an patientenbezogenem Gewebe.

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<meta charset="utf8"></head><body>SATMVECs beim Menschen: Isolations- und Adipozyten-Crosstalk-Studien

<ol><li>Bierhansl, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+of+metabolism+in+endothelial+cell+function+and+vascular+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Physiology%22%5BJournal%5D)">Central role of metabolism in endothelial cell function and vascular disease.</a> Physiology. 32 (2), 126-140 (2017).</li>
<li>Aird, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+cell+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Perspect+Med%22%5BJournal%5D)">Endothelial cell heterogeneity.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2 (1), a006429(2012).</li>
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<li>Luk, C., Haywood, N. J., Bridge, K. I., Kearney, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paracrine+role+of+the+endothelium+in+metabolic+homeostasis+in+health+and+nutrient+excess%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cardiovasc+Med%22%5BJournal%5D)">Paracrine role of the endothelium in metabolic homeostasis in health and nutrient excess.</a> Front Cardiovasc Med. 26 (9), 882923(2022).</li>
<li>Click-iT EdU Imaging Kits. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fmp10338.pdf">https://www.thermofisher.com/document-connect/document-connect.html?url=https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets%2FLSG%2Fmanuals%2Fmp10338.pdf</a> (2024).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>170L CO2 Inkubator</td><td>GS Biotech</td><td>170G-014</td><td></td></tr><tr><td>2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Desoxyglucose)</td><td>Invitrogen</td><td>N13195</td><td></td></tr><tr><td>4% PARAFIX gepuffertes histologisches Fixiermittel</td><td>VWR Chemicals</td><td>PRC/R/38/1</td><td></td></tr><tr><td>Akt (tAkt) Kaninchen&nbsp; 1:1000</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>9272</td><td></td></tr><tr><td>BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm, Orange, 50/pk</td><td>Medisave</td><td>393230</td><td></td></tr><tr><td>Rinderserumalbuminlösung, 7,5%</td><td>Merck</td><td>A8412-100ML</td><td></td></tr><tr><td>CD144&nbsp;( VE-Cadherin) Antikörper, anti-human, PE, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-118-495</td><td></td></tr><tr><td>CD31 Antikörper, anti-human, PerCP-Vio 700, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-811</td><td></td></tr><tr><td>CD31 MicroBead Kit, human, 1 Kit</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-935</td><td></td></tr><tr><td>CD45 Antikörper, anti-human, FITC, REAfinity</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-110-769</td><td></td></tr><tr><td>Zellextraktion Puffer</td><td>Invitrogen</td><td>FNN0011</td><td></td></tr><tr><td>Zentrifuge 5804 R</td><td>Eppendorf</td><td>5805000060</td><td></td></tr><tr><td>Click-iT EdU Zellproliferationskit für die Bildgebung, Alexa Fluor 488 Farbstoff</td><td>Invitrogen</td><td>C10337</td><td>Zellproliferation Bildgebungskit</td></tr><tr><td>Kollagenase/Dispase, 500 mg</td><td>Roche/Merck</td><td>11097113001</td><td></td></tr><tr><td>Corning Matrigel Wachstumsfaktor reduziert (GFR) Basalmembranmatrix</td><td>Corning&nbsp;</td><td>354230</td><td>Basalmembran-Matrix</td></tr><tr><td>Corning 100 mm TC-behandelte Kulturschale</td><td>Corning&nbsp;</td><td></td><td></td>430167</tr><tr><td>Costar 24-Well-Clear-TC-behandelte Multi-Well-Platten, einzeln verpackt, steril</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3526</td><td></td></tr><tr><td>Costar 6-Well-Clear-TC-behandelte Multi-Well-Platten, einzeln verpackt, steril</td><td>Corning&nbsp;</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>CytoFLEX S &ndash; 4 Laser-Durchflusszytometer</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Kit zur Entfernung toter Zellen</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-101</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&prime; s Phosphatgepufferte Kochsalzlösung</td><td>Merck</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>EASYstrainer Zellsieb für 50 mL Röhrchen, 70 & Mikro; m mesh, Blau, steril, 50/pk</td><td>Greiner Bio-One</td><td>542070</td><td></td></tr><tr><td>Endotheliales Zellwachstumsmedium MV</td><td>PromoCell</td><td>C-22020</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Safe-Lock Mikroreagenzgläser</td><td>Merck</td><td>EP0030120094</td><td></td></tr><tr><td>Ethylendiamintetraessigsäurelösung</td><td>Merck</td><td>E8008-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 24 Well TC-behandelte zellige Polystyrol-permeable Stützplatte, mit Deckel, Steril, 1/Pack, 50/Karton</td><td>Appleton Woods</td><td>CF537</td><td></td></tr><tr><td>Falcon Permeable Support für 24-Well-Platten mit 0,4 &; Mikro; m Transparente PET-Membran, steril, 1/Pack, 48/Karton</td><td>Appleton Woods</td><td>CF521</td><td></td></tr><tr><td>Gefriermedium Cryo-SFM</td><td>PromoCell</td><td>C-29912</td><td></td></tr><tr><td>Gelatinelösung, 2% in Wasser</td><td>Merck</td><td>G1393-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Antibiotikum-Antimykotikum (100x), 100mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>11570486</td><td></td></tr><tr><td>Gibco TrypLE Select Enzym (1x), kein Phenolrot</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td>12563029</tr><tr><td>Hanks&prime; Saldo Salzlösung</td><td>Merck</td><td>H6648-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Humane subkutane Präadipozytenzellen</td><td>Lonza</td><td>PT-5020</td><td></td></tr><tr><td>Inzozyten ZOOM</td><td>Essen BioScience</td><td></td><td>Lebendzellanalysesystem</td></tr><tr><td>Insulinlösung human</td><td>Merck</td><td>I9278-5ML</td><td></td></tr><tr><td>LS Säulen, 25/pk</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td></td></tr><tr><td>MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td></td></tr><tr><td>MACS Aufbewahrungslösung für Gewebe</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-100-008</td><td></td></tr><tr><td>MACSmix Röhrchenrotator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-753</td><td>Röhrchenrotator</td></tr><tr><td>MS Säulen, 25/pk</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE 4&ndash; 12% Bis-Tris Gel</td><td>Invitrogen</td><td>NP0322BOX</td><td></td></tr><tr><td>OctoMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-109</td><td></td></tr><tr><td>PGM-2 Präadipozyten-Wachstumsmedium-2 BulletKit</td><td>Lonza</td><td>PT-8002</td><td></td></tr><tr><td>Phospho (Ser1177) eNOS Kaninchen 1:1000</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>9570</td><td></td></tr><tr><td>Phospho-Akt (Ser473) Kaninchen&nbsp; 1:1000</td><td>Zellsignaltechnologie</td><td>4060</td><td></td></tr><tr><td>Vorabscheidefilter 30 & Mikro m, 50/pk</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td></td></tr><tr><td>Propidiumiodid (PI)/RNase Färbelösung</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>4087</td><td></td></tr><tr><td>QuadroMACS Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-976</td><td></td></tr><tr><td>Skalpell Steril Einweg Style 10</td><td>VWRI</td><td>501</td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschlussröhrchen, 15 ml, (Lx&Oslash;): 120 x 17 mm, PP, mit Aufdruck</td><td>Sarstetd</td><td>62.554.502</td><td></td></tr><tr><td>Schraubverschlussröhrchen, 50 ml, (Lx&Oslash;): 114 x 28 mm, PP, mit Aufdruck</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Schraubröhrchen, 50 ml, (Lx&Oslash;): 114 x 28 mm, PP, mit Aufdruck</td><td>Sarstetd</td><td>62.547.254</td><td></td></tr><tr><td>Gesamt eNOS Maus 1:1000</td><td>BD Biosciences</td><td>610297</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100, BioUltra, für Molekularbiologie</td><td>Merck</td><td>93443-500ML</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-Aktin (C4) Maus 1:5000</td><td>Santa Cruz Biotechnologie</td><td>&nbsp; Nr. SC-47778</td><td></td></tr></tbody></table>

untersuchung der wechselwirkung zwischen fettendothelzellen und adipozyten im menschlichen subkutanen fettgewebe

Studying Adipose Endothelial Cell/Adipocyte Cross-Talk in Human Subcutaneous Adipose Tissue

hSATMVEC Reinheit und Phänotyp Isolierte hSATMVEC von Kontrollpatienten (d. h. Patienten ohne kardiometabolische Erkrankungen in der Vorgeschichte) betrugen in der Durchflusszytometrie 99,5 % CD31+CD144+CD45- (Abbildung 2). Isolierte hSATMVEC wiesen eine kopfsteinpflasterartige Morphologie auf, die für ECs typisch ist (Abbildung 3A). hSATMVECs hatten eine mittlere Verdopplungszeit der Population von 56,6 h ± 8,1 h (mittlere ± SEM, n = 10) (Abbildung 3B), und die aktive DNA-Replikation in hSATMVECs wurde mit einem Bildgebungskit zur Zellproliferation bestätigt (Abbildung 3C).
hSATMVEC verhielt sich wie funktionierende MVECs und bildete Röhren in Matrigel (Abbildung 3D). Die relative Expression von Schlüsselproteinen, die am Akt-eNOS-Signalweg des Insulins beteiligt sind, ist in Abbildung 3E dargestellt. Sowohl eNOs als auch Akt zeigten eine Zunahme der insulininduzierten Phosphorylierung, dargestellt als das Verhältnis von phosphoryliertem Protein/Gesamtprotein, das auf ß-Aktin normalisiert ist (Abbildung 3E).
hSATMVEC-Adipozyten-Co-Kultur Ein illustratives Modell der hSATMVEC-Adipozyten-Kokultur ist in Abbildung 4A zu sehen. Mit zunehmender Differenzierung der menschlichen subkutanen weißen Präadipozyten wird man die Entwicklung von Lipidvakuolen bemerken (Abbildung 4B), die durch Ölrot-O-Färbung quantifiziert werden kann (Abbildung 4B).
Eine illustrative Phasenkontrast- und Fluoreszenzbildgebung (Anregung 440-480 nm/Emission 504-544 nm) von differenzierten Adipozyten nach 30-minütiger Inkubation mit 20 μM 2-NBD-Glukose ist in Abbildung 4C dargestellt. Die Glukoseaufnahme kann quantifiziert werden, indem die grüne Fläche als Prozentsatz der gesamten Zellfläche gemessen wird.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig01v2.jpg"> Abbildung 1: Schematische Darstellung der Gewinnung und Verarbeitung von hSATMVECs <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig01large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig02.jpg"> Abbildung 2: Typisches Ergebnis der Durchflusszytometrie-Analyse von kultivierten hSATMVECs. (A) Streudiagramm der seitlichen Streufläche (SSC-A) und der vorderen Streufläche (FSC-A), das das Gating (roter Kasten) von kultivierten hSATMVECs um die spezifische Zellpopulationsdichte zeigt. (B) Streudiagramm der Vorwärtsstreubreite (FSC-Breite) und FSC-A, das das Gating (roter Kasten) von kultivierten hSATMVECs um die spezifische Zellpopulationsdichte zeigt. (C) Histogramm, das die Fluoreszenz von Gated Zellen zu CD45-FITC zeigt. (D) Streudiagramm der Fluoreszenzintensität von CD144-PE (x-Achse) und CD31-PerCP (y-Achse). (E) Histogramm, das die Fluoreszenz von Gated Cells zu CD144-PE zeigt. (F) Histogramm, das die Fluoreszenz von Gated Cells zu CD31-PerCP zeigt. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig02large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig03.jpg"> Abbildung 3: hSATMVEC-Phänotyp. (A) Lichtmikroskopische Aufnahme von hSATMVEC in der Nähe des Konfluenzes mit kopfsteinpflasterartigem Aussehen. (B) hSATMVEC-Verdopplungszeit - Lichtmikroskopie von HATEC im Abstand von 24 Stunden, die das Ausmaß der Zellproliferation zeigt. (C) hSATMVEC-Proliferation. Fluoreszenzmikroskopie von hSATMVEC mit Propidiumiodid und EdU/Alexa-Fluor 488 von Kontrollpersonen. (D) hSATMVEC-Röhrenbildung von Kontrollpersonen (Bilder mit 4-facher Vergrößerung). (E) Insulinstimulation von HATECs - zeigt die relative Expression von phosphoryliertem Akt (Serin 473) zu Gesamt-Akt (linkes Bild), phosphoryliertem eNOS (Serin 1177) zu Gesamt-eNOS (rechtes Bild) bei steigenden Insulinkonzentrationen mit illustrativen Western Blots unterhalb des standardisierten auf B-Aktin. Die Daten werden als Mittelwert ± SEM angezeigt. Die Stichprobengrößen befinden sich unter jedem Panel. Abkürzungen: 5-Ethynyl-2'-Desoxyuridin (EdU), humanes subkutanes Fettgewebe, mikrovaskuläre Endothelzellen (hSATMVEC), Standardfehler des Mittelwerts (REM). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig03large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/66608/66608fig04.jpg"> Abbildung 4: hSATMVEC-Adipozyten-Kokultur. (A) Schematische Darstellung der hSATMVEC-Adipozyten-Kokultur. (B) Differenzierung der Adipozyten. Das linke Feld zeigt die Präadipozyten an Tag 0 und das rechte Feld zeigt die differenzierten Adipozyten am Tag 10 nach der Zugabe von PDM. Die untere Abbildung zeigt die Menge an Lipiden, die in Adipozyten und Präadipozyten gespeichert sind, die mit Oil Red O. (C) Glukoseaufnahme-Assay gefärbt wurden. Das linke Bild zeigt die Phasenbildgebung von Adipozyten nach Co-Kultur und Inkubation mit 20 μM 2-NBD-Glukose für 30 Minuten. Das rechte Feld zeigt eine grüne Bildgebung, aus der die Glukoseaufnahme (in % Grün der Gesamtfläche) quantifiziert werden kann. Die Daten sind als Mittelwert ± SEM dargestellt. Abkürzungen: Tag 10 (D10), humanes subkutanes Fettgewebe, mikrovaskuläre Endothelzellen (hSATMVEC), Präadipozyten-Differenzierungsmedien (PDM) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/66608fig04large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung anzuzeigen.</a>
Ergänzende Tabelle 1: Färbecocktail für die Durchflusszytometrie. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/66608/Supplementary%20Table%201.zip" target="_blank">Bitte klicken Sie hier, um diese Datei herunterzuladen.</a>

Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Fettendothelzellen und Adipozyten im menschlichen subkutanen Fettgewebe

Microvascular endothelial cells (MVECs) have many critical roles, including control of vascular tone, regulation of thrombosis, and angiogenesis. ...

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Fettgewebe (AT) kann die Homöostase des ganzen Körpers beeinflussen, daher ist es wichtig, die molekularen Mechanismen der Adipozytendifferenzierung und -funktion zu verstehen. Wir stellen ein Protokoll zur Verfügung, um neue Einblicke in diese Prozesse zu gewinnen, indem wir die Homöostase, die Differenzierung und die Hypoxie-Exposition der Adipozyten als Modell für die induzierte Apoptose der Adipozyten analysieren.

Mechanismus der Regulierung der Adipocyte Zahlen in adulten Organismen durch Differenzierung und Apoptosis Homöostase

Hier berichten wir über eine Methode zur Isolierung von Adipozyten-Progenitor-Zellen (APC) -Populationen aus perivaskulärem Adipositus (PVAT) mittels magnetisch-aktivierter Zellsortierung (MCS). Diese Methode ermöglicht eine erhöhte Isolierung von APC pro Gramm Fettgewebe im Vergleich zu Fluoreszenz-aktivierter Zellsortierung (FACS).

Expansion und Adipogenese Induktion von Adipozyten-Progenitoren aus perivaskulärem Fettgewebe, isoliert durch magnetisch aktivierte Zellsortierung

Die Unterscheidung von weiß und Beige Adipozyten aus Fettgewebe vaskulären Stammeltern trägt metabolische Verbesserungspotenzial bei Adipositas. Protokolle beschrieben für eine CD34 + CD31 + Endothelzellen losgelöst von menschlichen Fett und für eine spätere in-vitro- Erweiterung und Differenzierung in weiß und Beige Adipozyten. Mehrere downstream-Anwendungen werden diskutiert.

Isolation, Expansion und Adipogenen Induktion von CD34 + CD31 + Endothelial Zellen aus menschlichen Omentalis und subkutanem Fettgewebe

Aufgrund der hohen Fettgehalt hat Fettgewebe herausgefordert, mit traditionellen histologischen Methoden zu visualisieren. Adipo-Clear ist ein Gewebe, Technik, robuste Kennzeichnung und hohe Volumetrische fluoreszierende Abbildungsleistung des Fettgewebes können, löschen. Hier beschreiben wir die Methoden für die Probenvorbereitung, Vorbehandlung, Beizen, clearing und Montage für die Bildgebung.

Adipo-Clear: Ein Gewebe Clearing-Methode für die dreidimensionale Darstellung von Fettgewebe

Wir beschreiben ein 3D-Human-Human-Extrazellmatrix-Adipozyten-In-vitro-Kultursystem, das die Zerlegung der Rollen der Matrix und der Adipozyten bei der Kodipierung des metabolischen Phänotyps des Fettgewebes ermöglicht.

Ein menschliches 3D extrazelluläres Matrix-Adipozyten-Kulturmodell zum Studium der Matrix-Zell Metabolischen Crosstalk

Wir präsentieren ein Protokoll zur Isolierung, Kultur und adipogene Induktion von neuronalen Kamm abgeleiteten Adipose-abgeleiteten Stammzellen (NCADSCs) aus dem periaortischen Fettgewebe von Wnt-1 Cre+/-; Rosa26RFP/+ Mäuse. Die NCADSCs können eine leicht zugängliche Quelle von ADSCs zur Modellierung von Adipogenese oder Lipogenese in vitro sein.

Isolation, Kultur und adipogene Induktion von Neural Crest Original Adipose-Derived Stem Cells from Periaortic Adipose Tissue

Dieses Protokoll beschreibt den technischen Ansatz zur Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Depots aus weißem Fettgewebe (WAT) durch fluoreszenzaktivierte Zellsortierung oder immunomagnetische Kügelchentrennung.

Isolierung von adipogenen und fibro-inflammatorischen Stromazell-Subpopulationen aus murinen intraabdominalen Fettdepots

Dieses Protokoll bietet eine effiziente Kollagenase-Verdauungsmethode für die Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktions-SVF-Zellen aus menschlichem viszeralem Fett in einem einzigen Prozess, einschließlich einer Methodik zur Gewinnung hochwertiger RNA aus Adipozyten und einer Phänotypisierung von SVF-Makrophagen durch Färbung mehrerer membrangebundener Marker für die Analyse durch Durchflusszytometrie.

Isolierung lebensfähiger Adipozyten und stromaler vaskulärer Fraktion aus menschlichem viszeralem Fettgewebe, geeignet für RNA-Analyse und Makrophagen-Phänotypisierung

Das Manuskript und das zugehörige Video demonstrieren eine perkutane Biopsietechnik, um Proben von subkutanem Fettgewebe aus Bereichen um den Nabel zu gewinnen. Diese Methode ist eine risikoarme und effiziente Methode, um eine Reihe von Parametern (z. B. Gen- oder Proteinexpression, Enzymaktivität, Lipidgehalt) im Fettgewebe zu untersuchen.

Probenahme von subkutanem Fettgewebe beim Menschen mit einer Mini-Fettabsaugungstechnik

Dieses Protokoll beschreibt die halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion (SVF) aus murinem Fettgewebe, um Präadipozyten zu erhalten und eine Adipozytendifferenzierung in vitro zu erreichen. Die Verwendung eines Gewebedissoziators für den Kollagenaseverdau reduziert die experimentelle Variation und erhöht die Reproduzierbarkeit.

Halbautomatische Isolierung der stromalen vaskulären Fraktion aus murinem weißem Fettgewebe mit Hilfe eines Gewebedissoziators

Erfahren Sie die Isolierung und Charakterisierung mikrovaskulärer Endothelzellen aus humanem subkutanem Fettgewebe zur Untersuchung der Zell-Zell-Kommunikation mit Adipozyten. Diese Methode ermöglicht kardiometabolische Forschung an patientenbezogenem Gewebe.

Untersuchung der Wechselwirkung zwischen Fettendothelzellen und Adipozyten im menschlichen subkutanen Fettgewebe

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