Bildgebung von Ca2⁺ -Signalen in kleinen Lungenvenen bei physiologischem intraluminalem Druck

In diesem Protokoll stellen wir eine neuartige Technik zur Aufzeichnung und Analyse von Ca2⁺ -Signalen in intrapulmonalen Venen (kleine Lungenvenen oder PVs) bei physiologischem intraluminalem Druck vor. Die Technik umfasst die Isolierung kleiner PVs, deren Inkubation mit einem Ca2⁺ -Indikator, ihre Kanülierung und Druckbeaufschlagung, die konfokale Bildgebung von Ca2⁺ -Signalen und die Datenanalyse.

Kalziumsignale regulieren die Funktion der Blutgefäße, die in Quelle und Rolle variieren. Unser Ziel ist es, ihre spezifischen Funktionen in der Gefäßwand zu verstehen und Anomalien zu identifizieren, die mit der Krankheit verbunden sind. Die meisten Untersuchungen an Lungenblutgefäßen konzentrieren sich auf Arterien oder Kapillaren, nicht auf Lungenvenen.

Trotz ihrer physiologischen Relevanz gibt es keine Studien, die Kalziumsignale in Lungenvenen unter normalem intraluminalem Druck untersucht haben. Lungenvenen unterliegen während der Herz-Kreislauf-Zyklen einer Druckänderung, deren Einfluss auf die Kalziumsignale jedoch nicht untersucht wurde. Unser Protokoll ermöglicht die Erfassung und automatische Analyse von Kalziumsignalen in kleinen Lungenvenen bei normalem Druck.

Unser Protokoll ermöglicht zukünftige Studien darüber, wie der intraluminale Druck die Kalziumsignale in kleinen Lungenvenen beeinflusst, und verbessert das Verständnis ihrer Regulation und Rolle bei Gesundheit und Krankheit. Reinigen Sie zunächst die Sezierwerkzeuge und das Präpariergeschirr in 100%igem Ethanol und waschen Sie sie dann in entionisiertem Wasser. Mit einer Schere.

Öffnen Sie die Brusthöhle einer euthanasierten Maus. Verwenden Sie eine Pinzette, um das Herz und die Lunge vorsichtig und mit minimaler Berührung der Lunge aus der Brusthöhle zu entfernen. Legen Sie anschließend das Gewebe auf eine mit Siegelschutz beschichtete Platte, die kalte, gepufferte physiologische Salzlösung von HEPES enthält.

Befestigen Sie Herz und Lunge mit Präpariernadeln so, dass die großen Lungenvenen und Lungenarterien gut sichtbar sind und der linke Lungenlappen leicht gedehnt ist. Anhand der großen Lungenvenen als Referenzpunkte entfernen Sie vorsichtig mit Hilfe einer feinen Schere das Gewebe, das die kleinen Interpulmonalvenen umgibt. Isolieren Sie dann die kleinen Lungenvenen vorsichtig vom umliegenden Gewebe.

Als nächstes wird eine Stammkonzentration von 2,5 millimolar Fluo-4 AM mit DMSO hergestellt. Bereiten Sie die Ladelösung mit der Stammlösung vor. Legen Sie die kleinen Lungenvenen in ein 1,5-Milliliter-Röhrchen mit der Belastungslösung.

Decken Sie die Tube mit Alufolie ab und inkubieren Sie sie eine Stunde lang in einem Wasserbad bei 37 Grad Celsius. Um die kleinen Lungenvenen zu kanülieren, entfernen Sie eine Vene aus der Waschlösung. Legen Sie es in eine vorbereitete Druckmyographiekammer.

Kanülieren Sie mit einer Pinzette mit feiner Spitze vorsichtig ein Ende der kleinen Lungenvene auf eine der Kanülen und binden Sie dann mit einem Nylonfaden-Mikrofilament einen Knoten um das kanülierte Ende der kleinen Lungenvene und die Spitze der Kanüle, um sie zu sichern. Schieben Sie die physiologische Salzlösung vorsichtig durch die Kanüle, um das Blut in der Lungenvene zu entfernen. Das andere Ende mit einer Glaskanüle mit Mikrofilamenten mit Nylonfaden abbinden.

Für die Kalziumbildgebung schließen Sie zunächst einen Servodruckregler an einen Schlauch an, der gepufferte physiologische Salzlösung von HEPES enthält. Verwenden Sie den Controller, um die kleine Lungenvene von einem Ende aus unter Druck zu setzen. Schließen Sie nun eine Schlauchpumpe an einen Einlass und einen Auslass und einen Auslass an und übergründen Sie die Lösung.

Verwenden Sie nach der Gleichgewichtsphase das 40-fache Wassertauchobjektiv und ein konfokales Bildgebungssystem mit Spinning-Disc, um Kalziumbilder für 1.000 Bilder aufzunehmen. Um eine Bildanalyse durchzuführen, starten Sie das benutzerdefinierte Spark und die Software. Verwenden Sie den Fünf-mal-Fünf-Filter und den Medianfilter, um die Bilder zu glätten, gefolgt von einem Rahmen, der einen flachen Bereich der Lungenvene mit mehreren Zellen für die automatische Ereigniserkennung umreißt.

Klicken Sie auf Ansicht und Automatische Ereigniserkennung. Legen Sie den Ereignisschwellenwert auf eine Amplitude von 1,3 F über F0, die Toleranz auf 20 %, das Scanfeld auf sieben x sieben Pixel und den laufenden Durchschnitt auf sieben Bilder fest. Klicken Sie auf Suche starten oder auf das Augensymbol.

Suchen Sie die Ereignistabelle, indem Sie im Ansichtsmenü auf eine kleine Ereignistabelle klicken, und berechnen Sie dann die Ereignisse pro Mikrometerquadrat, indem Sie die Anzahl der erkannten Kalziumionensignale durch die Fläche des ausgewählten Rahmens dividieren. Die Anzahl der spontan auftretenden Kalziumsignale in kleinen Lungenvenen bei fünf Millimeter Quecksilber-Intraluminaldruck betrug unter basalen Bedingungen 0,73 plus oder minus 0,2 Ereignisse pro Minute und Quadratmikrometer. Die Zugabe von Ryanodin reduzierte die Kalziumsignalaktivität drastisch.