Optimierte Methode zur Kultivierung und mikrobiellen Bioaugmentation von Typha latifolia (Rohrkolben)

Unsere Arbeit bezieht sich auf das Fehlen von Protokollen zum Anbau von Rohrkolben aus Samen. Wir entwickelten reproduzierbare Methoden zur Keimung von Samen, Frühwachstum und mikrobieller Bioaugmentation, um zukünftige Pflanzenmikrobenforschung zu unterstützen. Nur wenige Studien züchten Rohrkolben aus Samen oder verfolgen sie bis zur Reife, dennoch werden Rohrkolben häufig in der Forschung zur Sanierung von Feuchtgebieten verwendet.

Die meiste Rohrkolbenforschung beinhaltet den Kauf von Rhizomen zur Vermehrung von Rohrkolben in Laborstudien. Nur wenige Studien züchten Rohrkolben aus Samen, sodass es keine standardisierten Methoden gibt. Die Erreichung einer beständigen Keimung und anhaltenden Besiedlung eingeführter Mikroben war eine große Herausforderung.

Wir haben reproduzierbare Methoden für die Keimung von Samen und mikrobielle Bio-Augmentation entwickelt und gezeigt, wie frühe Impfungen eine langfristige Besiedlung unterstützen. Zunächst verwenden Sie eine Gartenscher, um den Stängel einer Typha-Latifolia-Pflanze etwa zwei Zentimeter vom Blütenstand entfernt zu schneiden. Ziehen Sie die Samen vom Blütenstand und geben Sie die Samen in einen Labormixer, bis der Mixer etwa zu einem Viertel voll ist, was etwa 250 Millilitern unverdichteter Samen entspricht.

Füllen Sie den Mixer nun mit 500 Millilitern Leitungswasser und sorgen Sie dafür, dass ein Kopfraum von 10 Zentimetern erhalten bleibt. Mischen Sie die Mischung bei mittlerer niedriger Geschwindigkeit für 20 Sekunden und geben Sie den viskosen Inhalt sofort in einen Ein-Liter-Becher um. Geben Sie etwa 100 Milliliter der Saatwassermischung zurück in den Mixer.

Dann 400 bis 600 Milliliter frisches Leitungswasser hinzufügen und 20 Sekunden lang bei mittlerer hoher Geschwindigkeit mixen. Gieße den Inhalt in einen frischen Ein-Liter-Becher. Füllen Sie den Becher nun mit Leitungswasser bis zu 800 Millilitern.

Nachdem Sie es 60 Sekunden einwirken lassen, schöpfen Sie den schwimmenden Schlamm von oben ab, ohne die am Boden liegenden Samen zu stören. Gießen Sie langsam das restliche Wasser aus und füllen Sie die Samen in einen 100-Milliliter-Becher. Wiederholen Sie den Mischvorgang für den verbleibenden Saatwasserschlamm. Als Nächstes legen Sie das Becherglas mit den getrennten Samen auf eine Rührplatte.

Nach dem Umrühren schöpfen Sie das schwimmende Pflanzenmaterial von der Oberfläche des Bechers. Gießen Sie die Samen in einen Buchner-Trichter mit Filterpapier, das an ein Vakuum angeschlossen ist, und lassen Sie sie über Nacht trocknen. Lagern Sie die getrockneten Samen bei 20 Grad Celsius in 50-Milliliter-konischen Polypropylenröhren.

Bereite halbstarke Murashige- und Skoog-Medienplatten mit 1 % Phytoagar vor. Geben Sie etwa ein Milligramm der getrockneten Samen in ein 15-Milliliter-konisches Polypropylenrohr. Dann geben Sie 10 Milliliter steriles, doppelt destilliertes Wasser in die Tube.

Setzen Sie das Rohr für 10 Minuten mit mittlerer hoher Geschwindigkeit auf einen Orbitalshaker. Entferne nun das Wasser aus dem Rohr und gib fünf Milliliter 0,1%-Polysorbat-20-Lösung in sterilem doppelt destilliertem Wasser hinzu. Schüttle das Rohr 10 Minuten lang mit mittlerer hoher Geschwindigkeit.

Entferne die Polysorbat-20-Lösung. Führen Sie alle weiteren Schritte vor einer Flammen- oder laminarer Flusshaube durch. Ersetzen Sie die Lösung durch fünf Milliliter 30 % kommerzielles Bleichmittel und 0,025 % Polysorbat-20-Lösung, die in sterilem doppelt destilliertem Wasser hergestellt werden.

Ersetzen Sie das Supernatant durch steriles, doppelt destilliertes Wasser. Dann schütteln Sie das Rohr fünf Minuten lang bei mittlerer hoher Geschwindigkeit. Nach der dritten Spülung drehen Sie den Tub 24 Stunden lang mit niedriger Geschwindigkeit, um die Keimung einzuleiten.

Am nächsten Tag entfernen Sie das überschüssige Wasser und sorgen Sie dafür, dass noch drei Milliliter Flüssigkeit im Röhrchen verbleiben. Jetzt aseptisch die Spitze einer 1000-Mikroliter-Kunststoffpipettenspitze abschneiden. Verwenden Sie die Spitze der geschnittenen Pipetten, um kräftig zu pipetten und die Samen in der Spitze aufzuhängen.

Richten Sie die Samen und die Flüssigkeit auf eine halbstarke Murashige- und Skoog-Agar-Teller. Rühren Sie den Teller vorsichtig, um die Samen gleichmäßig zu verteilen. Wickle die Platten mit Labor-Versiegelungsfolie und setze sie dann in eine Wachstumskammer mit einem 16-Stunden-Licht- und 8-Stunden-Dunkelzyklus bei 23 Grad Celsius und 70 % Luftfeuchtigkeit.

Um Rohrkolbensamen zu inokulieren, sterilisieren Sie die Samen mit Polysorbat 20 Bleichmittel und doppelt destilliertem Wasser, wie demonstriert. Messen Sie die optische Dichte einer über Nacht durchgeführten Kultur von Luteimonas-Isolat bei 600 Nanometern. Normalisieren Sie die Kultur auf einen Absorptionswert von 1,0, indem Sie im Kulturmedium verdünnen.

Zentrifugiere jetzt einen Milliliter der Kultur bei 9.300 G für zwei Minuten. Entfernen Sie das Supernatant und lassen Sie das Pellet in einem Milliliter PBS wieder suspendieren. Nach der Zentrifugierung und erneuter Entfernung des Überstandsmittels wird das bakterielle Pellet in einem Milliliter steriles, doppelt destilliertes Wasser wieder aufgehängt.

Verwenden Sie sterilisierte Samen und verdünnen Sie das Inokulum dann mit einer Verdünnung von eins bis zehn % mit 0,025 % Organosilikon-Tensid im selben Rohr. Schütteln Sie die Suspension bei niedriger Geschwindigkeit 24 Stunden vor der Keimung. Beginnen Sie damit, eine sterile Pflanzenwachstumskammer mit einem bevorzugten Boden zu füllen, der mit Leitungswasser vorbenetzt ist.

Decken Sie die Luer-Lock-Spitze mit Alufolie ab und autoklavieren Sie das Gerät 20 Minuten lang in einem flüssigen Zyklus. Anschließend wird unter sterilen Bedingungen eine 0,2-Mikrometer-Filtereinheit am Luer-Lock-Anschluss an der Wachstumskammer befestigt. Öffnen Sie die Kammer und geben Sie 500 Mikroliter Filter, sterilisierter 1 % mal 20 mal 20 x 20 Dünger in den Boden ein.

Mische den Boden mit einem sterilen Pfannenwender und gib gleichzeitig steriles doppelt destilliertes Wasser hinzu, um die Hydratation zu erhalten und den Boden nicht zu übersättigen. Jetzt benutze eine sterile Rasierklinge, um Murashige und Skoog Agar von Platten mit einem schwachen alten Setzling in Vierteln zu schneiden. Mit einem sterilen Spatel wird ein Agarabschnitt mit Setzling auf den vorbereiteten Boden in der Wachstumskammer übertragen.

Übertragen Sie die Wachstumskammereinheit in einen Pflanzeninkubator, der auf einen 16-Stunden-Licht- und 8-Stunden-Dunkelzyklus bei 23 Grad Celsius und 70 % Luftfeuchtigkeit eingestellt ist. Die vollständige Narbenbildung der Typha-Samen führte zu sichtbar getrennten Samenkomponenten, während die unvollständige Narbenbildung den Schnabel haften ließ und die nicht vernarbten Samen intakt blieben. Das sterile Hydroponiksystem hat gezeigt, dass es das Wachstum von Rohrkolben- und Juncus-Arten, hier als Juncus dargestellt, unterstützt und bis zu einem Jahr im sterilen System erhalten blieb.

Die höchste Keimrate von 20,8 % wurde mit der 30 %-Bleichmittel-und-Polysorbat-20-Methode beobachtet, was signifikant höher war als bei allen anderen Sterilisationsbehandlungen außer der 1-stündigen Chlorgasmethode, die keine vollständige Samensterilisation erreichte. Sieben Tage nach der Narbenbildung entwickelten keimende Typha-Setzlinge sichtbare Radikale und Triebgewebe in der nicht-sterilen Petriplatten-Umgebung. Nach der Umpflanzung in den Boden etablierte sich ein Teil der Typha-Setzlinge erfolgreich und produzierte innerhalb von ein bis zwei Wochen neues Triebgewebe.

Nach der Impfung mit Luteimones-Arten, die ein DsRed-Plasmid tragen, wurde eine rote fluoreszierende bakterielle Besiedlung in den Wurzeln des Typha-Setzlings 16 Tage nach der Impfung beobachtet.