Design von Festkörperfermentationssystemen für die polymerhydrolytische extrazelluläre Enzymproduktion durch filamentöse Pilze

Wir entwerfen vielseitige Feststofffermentationssysteme, Kochbananen, Enzymproduktion durch Pilze. Es wird untersucht, wie verschiedene Induktoren, inokulare Typen und rotierende Systeme die Skalierbarkeit und das Gel verbessern.

Die Skalierung von rotierenden Festkörperfermentationssystemen unter Beibehaltung homogener Bedingungen, Sauerstofftransfers und konsistenter Enzymausbeuten bleibt eine zentrale experimentelle Herausforderung.

Wir haben gezeigt, dass rotierende Festkörperfermentationssysteme bei gleichen Ausbeuten vier- bis sechsmal höhere Erträge erzielen als submerse Fermentation, was ihre Vielseitigkeit und Skalierbarkeit für mehrere Enzyme unter Beweis stellt.

Unser Protokoll integriert rotierendes Mischen, verschiedene Protokolltypen und eine Vielzahl spezifischer Induktoren und gewährleistet so High-End-Enzymgele, homogenes Wachstum und Anwendbarkeit über mehrere Enzymsysteme hinweg.

Wir werden uns auf die Skalierung von rotatorischen Festkörper-Fermentationssystemen konzentrieren, um ihre Anwendung für die Herstellung neuartiger Enzyme in den Bereichen Lebensmittel, Bioenergie und Umwelt zu erforschen.

[Erzähler] Waschen Sie die Weizenkleie zu Beginn dreimal mit sterilem destilliertem Wasser, um Rückstände von organischen Stoffen, Schmutz und Staub zu entfernen. Die gewaschene Weizenkleie auf einem Aluminiumblech verteilen und in einem auf 60 Grad Celsius eingestellten Ofen 24 Stunden trocknen. Um die Sporensuspension herzustellen, übertragen Sie eine mit Myzel gesättigte Schneckenscheibe mit fünf Millimetern Durchmesser auf eine frische Kartoffel-Dextrose-Schneckenplatte. Inkubieren Sie die Platte fünf bis sieben Tage lang bei 28 Grad Celsius oder bis das Myzel das Medium gesättigt hat. Geben Sie dann fünf Milliliter steriles destilliertes Wasser auf die Platte und lösen Sie die Sporen mit einer sterilen Schlaufe von der Oberfläche. Bereiten Sie nun eine Verdünnung der Sporensuspension von 1 bis 100 mit sterilem destilliertem Wasser vor. Geben Sie 10 Mikroliter der Suspension in die Neubauer-Kammer und zählen Sie die Sporen mit einem Mikroskop. Für die Flüssigkultur verwenden Sie eine sterile Pinzette, um eine mit Myzel gesättigte Schneckenscheibe auf eine frische Kartoffel-Dextrose-Schneckenplatte zu übertragen. Inkubieren Sie die Platte bei 28 Grad Celsius, bis das Medium vollständig gesättigt ist. 25 Milliliter Kartoffel-Dextrose-Brühe in einem sterilen 125-Milliliter-Erlenmeyerkolben zubereiten und den Kolben autoklavieren, um das Medium zu sterilisieren. Übertragen Sie als Nächstes eine fünf Millimeter große Scheibe Myzel von der gesättigten PDA-Platte in die sterile Brühe. Inkubieren Sie den Kolben 24 bis 48 Stunden lang auf einem Schüttler bei 125 U/min und passen Sie die Zeit je nach Pilzstamm an. Sammeln Sie zwei Milliliter der kultivierten Brühe für die Inokulumvorbereitung und weitere zwei Milliliter für die Bestimmung des Trockengewichts. Für die direkte Inokulation von Myzelscheiben legen Sie die mit Myzel gesättigte Schneckenscheibe auf eine frische Kartoffel-Dextrose-Schneckenplatte und inkubieren Sie sie bei 28 Grad Celsius, bis das Medium vollständig gesättigt ist. Bereiten Sie das Substratröhrchen mit fünf Gramm Weizenkleie, 0,5 Gramm des Induktors und 5,5 Millilitern Wasser vor und autoklavieren Sie das Rohr 15 Minuten lang bei 15 Pfund pro Quadratzoll. Führen Sie die Elektrodensonde nach dem Abkühlen in unterschiedlichen Tiefen direkt in den Reaktor ein, um die relative Luftfeuchtigkeit mit einem elektrodenbasierten Hygrometer zu messen. Beimpfen Sie das Substrat mit einem Milliliter Sporensuspension, die 10 hoch sechs bis 10 hoch sieben Sporen pro Milliliter enthält. Wirbeln Sie die Rohre fünf Minuten lang bei maximaler Geschwindigkeit in Ein-Minuten-Zyklen vor, um ein Verklumpen des Substrats zu vermeiden. Legen Sie dann die Röhrchen in einen Rotationsmischer mit horizontaler Achse. Inkubieren Sie den Rotationsmischer in einem Inkubator, der auf die optimale Wachstumstemperatur des Mikroorganismus eingestellt ist. Für die Enzymextraktion resuspendieren Sie das Substrat in 20 Millilitern vorgekühltem Puffer nach der gewünschten Fermentationszeit. Wirbeln Sie die Rohre in Zyklen von einer Minute bei maximaler Geschwindigkeit, gefolgt von einer Minute auf Eis. Filtrieren Sie die Suspension mit Papierfiltern und drücken Sie, um den Überstand mechanisch zu extrahieren. Zum Schluss zentrifugieren Sie den Überstand bei 3.000 g für 15 Minuten bei vier Grad Celsius, um die Flüssigkeit zu klären. Nach sechstägiger Festkörperfermentation zeigte das Substrat eine sichtbare Pilzbesiedlung mit einem fibrösen Myzelnetzwerk, das die Oberfläche bedeckte. Die Glucosaminbildung durch die Hydrolyse von Chitosan war in Trichoderma harzianum unter Festkörperfermentation signifikant höher, was darauf hindeutet, dass die Chitinaseaktivität in diesem Fall viel höher war als in der submersen Fermentation. In ähnlicher Weise war die Amylaseaktivität von Aspergillus lentulus in der Festkörperfermentation im Vergleich zu der in der submersen Fermentation signifikant erhöht.