Techniken für die Entwicklung von robusten Pentose-gärenden Hefe für Biokonversion von Lignocellulose zu Ethanol

Das übergeordnete Ziel dieses adaptiven Evolutionsverfahrens ist es, robuste Stämme der nativen Xylose-Fermentierhefe Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 zu gewinnen, die die Hexose- und Pentosezucker in unentgifteten Hydrolysaten schneller zu wirtschaftlich rückgewinnbarem Ethanol fermentieren können. Diese Methode bringt die Lignocellulose in die Ethanolindustrie voran, indem sie eine Roadmap für Stämme mit komplexen Modifikationen bereitstellt, die die Fermentation von Zuckern in Hydrolysaten ermöglicht, die mikrobielle Inhibitoren enthalten. Hier besteht der Hauptvorteil der gezielten Evolution darin, dass robuste Stämme aus einer nativen Hefe geformt werden, die in der Lage ist, Xylose zu fermentieren, wodurch die Notwendigkeit entfällt, industrielle Saccharomyces-Stämme zu entwickeln.

Wir stellten fest, dass es unwahrscheinlich war, dass ein einzelner Hefestamm in verschiedenen Arten von Hydrolysaten, wie z. B. AFEX vorbehandeltem Maisstroh oder verdünntem säurevorbehandeltem Rutenhirse, robust ist. Die Fähigkeit von scheffersomyces stipitis, einen sexuellen Fortpflanzungszyklus zu durchlaufen, ist für die weitere Ausbeutung in der vorliegenden Arbeit von Vorteil, da die verschiedenen entwickelten Stämme durch Verpaarung von Stämmen mit diesen verschiedenen Merkmalen zu einem einzigen, robusteren Stamm kombiniert werden können. Das Verfahren wird von den Co-Autorinnen Stephanie Thomson und Maureen Shea-Andersh demonstriert, die in meinem Labor als Biotechniker tätig sind.

Vor Beginn dieses Anreicherungsverfahrens ist eine Vorkultur des Stammes NRRL Y-7124 in einem 125-Milliliter-Kolben und eine Verdünnungsreihe des enzymverzuckerten Ammoniakfaserexpansions-vorbehandelten Maisstrohhydrolysats oder AFEX CSH herzustellen. Verwenden Sie eine Repeating-Pipette, um eine 96-Well-Mikroplatte mit 15 Mikrolitern pro Well und acht Wells pro Hydrolysatverdünnung zu füllen. Beimpfen Sie mit einigen Mikrolitern Vorkultur pro Vertiefung, um eine anfängliche Absorption bei 620 Nanometern oder A620 von mindestens 0,1 zu ermöglichen.

Legen Sie die Mikroplatte in eine Plastikbox mit einem feuchten Papiertuch für Feuchtigkeit und inkubieren Sie sie 24 bis 28 Stunden lang statisch bei 25 Grad Celsius. Verwenden Sie als Nächstes ein Mikroplatten-Dostrophotometer, um die Kulturen zu identifizieren, die in der konzentriertesten Hydrolysatverdünnung physikalisch zu einem A620 von mehr als 1,0 angewachsen sind. Die identifizierten Vertiefungen werden in einem Mikrofuge-Röhrchen zusammengefasst und auf eine Füllplatte verteilt.

Übertragen Sie ein bis fünf Mikroliter von der Füllplatte in jede Vertiefung einer neuen Hydrolysat-Verdünnungsreihe, um einen anfänglichen A620-Wert von mindestens 0,1 zu erreichen, und inkubieren Sie die Platte wie zuvor. Überwachen Sie das Wachstum der Kulturen in der Mikroplatte mit einem Mikroplatten-Ablese-Spektrophotometer. Bereiten Sie regelmäßig Glycerinbestände von Anpassungskulturen vor.

Füllen Sie vier Vertiefungen mit der höchsten Hydrolysatkonzentration, die in einer Kryodatei kolonisiert ist, und mischen Sie sie eins zu eins mit 20 % sterilem Glycerin. Frieren Sie die Zellen bei minus 80 Grad Celsius ein. Wiederholen Sie diesen Anreicherungsvorgang, bis das Wachstum von 12%igem Glucan AFEX CSH nach 24 Stunden konsistent sichtbar ist.

Um dieses Verfahren zu beginnen, wurden ausgewählte Glycerinbestände von Anpassungskulturen an Hefemalz, Pepton, Dextrose oder YM-Agar ausgewählt. Nach dem Wachstum beimpfen Sie dann mit Streifen 50 Mikroliter 3 % oder 6 % Glucan AFEX CSH in jeder der drei Mikrotiterplatten-Vertiefungen. Inkubieren Sie die Mikroplatte 24 Stunden lang bei 25 Grad Celsius.

Pool repliziert kolonisierte Bohrlöcher mit höchster Hydrolysatstärke und starkem Wachstum. Und Verdünnungsplatte zu YM oder 6%Glucan AFEX CSH-Agar. Inkubieren Sie die Platten in einem 25 Grad Celsius heißen Inkubator für 24 bis 48 Stunden.

Entnehmen Sie fünf Einzelkolonien aus der Platte mit der höchsten Verdünnungsplatte, die als Glycerin-Stammkulturen einfrieren können. Streichen Sie jede Kolonie auf eine YM-Platte und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang. Übertragen Sie mit einer sterilen Schleife einen entwickelten Zellstreifen auf ein kleines Volumen von 10 % Glycerin, das gemischt ist, um die Zellen zu suspendieren, und verteilen Sie es auf zwei bis drei Kryofeilen zum Einfrieren bei minus 80 Grad Celsius.

Um Isolate in einfachen 6%igen Glucan-AFEX CSH-Chargenkulturen zu testen, übertragen Sie Zellen von 48-Stunden-Platten, die aus Glycerinbeständen gestreift wurden, auf Kaliumphosphatpuffer mit pH 7, um Zellsuspensionen herzustellen. Nachdem Sie die optische Dichte jeder Zellsuspension gemessen haben, passen Sie das Volumen mit zusätzlichem Puffer an, um einen A620 von zehn zu erreichen. Verwenden Sie einen Mikroliter jeder Suspension, um jede der vier Vertiefungen mit 50 Mikrolitern 3%igem Glucanhydrolysat auf einen anfänglichen A620-Wert von 0,2 zu impfen.

Inkubieren Sie die Mikroplatte 24 Stunden lang. Als nächstes übertragen Sie zwei 24-Stunden-Mikrotiterplatten-Wells, um 25-Milliliter-Vorkulturen mit 6 %igem Glucan AFEX CSH bei pH 5 zu beimpfen. Verschließen Sie die Kolben mit Silikonschwammverschlüssen und inkubieren Sie sie 24 Stunden lang bei 25 Grad Celsius und 150 U/min.

Verwenden Sie die 6%igen Glucan-AFEX CSH-Vorkulturen, um ähnliche 25-Milliliter-Wachstumskulturen in Duplikaten mit einem anfänglichen A620-Wert von 0,1 zu beimpfen. Inkubieren Sie die Wachstumskulturen 24 Stunden lang bei 25 Grad Celsius und 150 U/min. Um den dioxischen Mangel an Isolaten in Chargenkulturen mit optimal definiertem Medium (ODM) mit Mischzuckern zu testen, werden Vorkulturen von 75 Millilitern ODM mit 150 Gramm pro Liter Xylose in 125-Milliliter-Kolben mit Silikonschwammverschlüssen inokuliert.

Inkubieren Sie 24 Stunden lang bei 25 Grad Celsius und 150 U/min. Verwenden Sie die Vorkulturen, um auf ein A620 von 0,1 ähnlichen doppelten 75-Milliliter-Testkulturen mit ODM zu impfen, die 75 Gramm pro Liter Glukose und 75 Gramm pro Liter Xylose bei einem pH-Wert von 6,5 enthalten. Schütteln Sie die Kolben bei 25 Grad Celsius und 150 U/min.

24 Stunden vor der Inokulation einer kontinuierlichen Kultur ist eine Vorkultur einer repräsentativen AFEX CSH-toleranten Kolonie in ethanolfreiem ODM in einem 125-Milliliter-Kolben vorzubereiten. Verwenden Sie fünf bis 10 Milliliter der AFEX CSH-toleranten Isolat-Vorkultur, um 100 Milliliter ODM in einem ummantelten 100-Milliliter-Spinnerkolben zu impfen, um ein anfängliches A620 von 0,5 zu erhalten. Halten Sie das Haltevolumen der Kultur auf 25 Grad Celsius.

Rühren Sie es bei 200 U/min um und statten Sie es mit einer sterilisierbaren pH-Elektrode, einem pH-Regler und einem temperaturgesteuerten zirkulierenden Wasserbad aus. Da das Zellwachstum aufgrund der Ethanolexposition langsam ist, richten Sie zunächst eine pH-gesteuerte Pumpe ein, so dass die Pumpe bei Senkung des pH-Werts auf 5,4 durch die Kulturfermentation einen pH-Wert von 6,3 ODM mit 100 Gramm pro Liter Xylose und 50 Gramm pro Liter Ethanol speist, um eine weitere pH-Senkung zu verhindern. Halten Sie das Volumen bei 100 Millilitern mit einer Abwasserpumpe, die die Kulturoberfläche kontinuierlich abschöpft.

Messen Sie das gesammelte Abwasservolumen und entnehmen Sie alle 48 bis 72 Stunden Proben aus kontinuierlichen Kulturen zur Analyse der Konzentration, der Produkte und Substrate lebensfähiger Zellen, wie im Manuskript beschrieben. Sparen Sie regelmäßig Glycerinbestände, indem Sie die Kolonien aus Viabilitätsplatten mit gepufferten Probenverdünnungen isolieren, die 30 bis 100 Kolonien bilden, was zu diesem Zeitpunkt die am weitesten verbreiteten robusten Kolonien in der Anreicherung darstellt. Fluten Sie die Platten mit fünf Millilitern 10%igem Glycerin, um die Vorbereitung doppelter Kryodateien zu ermöglichen.

Wenn Kulturen in Gegenwart von mehr als 25 Gramm Ethanol mit spezifischen Raten von mehr als 0,01 pro Stunde auf Xylose stetig wachsen können, beginnen Sie die kontinuierliche Kulturzuführung mit einer niedrigen Verdünnungsrate von etwa 0,01 pro Stunde auf das Haltevolumen von 100 Millilitern. Erhöhen Sie im Laufe der Zeit das Ethanol im Zulauf in Richtung 50 Gramm pro Liter. Die ultraviolette Bestrahlung von Inokula zur Wiederaufnahme kontinuierlicher Kulturen ist eine Option, um die Mutationsrate zu beschleunigen.

Erfassen Sie fortgeschrittene Populationen in Glycerin-Aktien. Vor der Isolierung einzelner Zellkolonien werden Glycerinstammpopulationen mit verbesserter Xylosefermentation in Gegenwart von Ethanol identifiziert, wie im Textprotokoll beschrieben. Verwenden Sie diese überlegenen Populationen, um Teller zu streifen.

Die gestreiften Platten werden verwendet, um dichte gepufferte Zellsuspensionen eines A620 gleich fünf herzustellen. Anschließend werden Zellsuspensionen verwendet, um Vorkulturen in 96 Deep-Well-Platten zu inokulieren. Inkubieren Sie 48 Stunden lang bei 25 Grad Celsius, 400 U/min und einer Umdrehung von einem Zoll.

Als nächstes reichern Sie tolerante Völker an, indem Sie mit jeder Vorkultur 16 Ein-Milliliter-Replikatkulturen auf ein anfängliches A620 von 0,5 in säurevorbehandelter Rutenhirse-Hydrolysat-Flüssigkeit impfen, eins zu eins gemischt mit ODM plus 50 Gramm pro Liter Xylose und genug Ethanol, um eine Ethanol-Herausforderung von 20, 30 oder 40 Gramm pro Liter zu erzielen. Inkubieren Sie 48 Stunden lang bei 25 Grad Celsius, 400 U/min und einer Umdrehung von einem Zoll. Ernten Sie für jeden einzelnen Glycerinbestand die Kulturvertiefungen mit der höchsten Ethanolkonzentration, die Wachstum und die Verwendung von Xylose ermöglichen.

Plattieren Sie jede Zelllinie mit YM-Agar, um vorherrschende Einzelkolonien zu erhalten, die in Glycerin konserviert werden. Entnehmen Sie 10 Kolonien pro Zelllinie und streichen Sie jede auf eine YM-Agarplatte für die Glycerinstammvorbereitung. Nach der Anpassung an AFEX CSH zeigt ein Vergleich der Fermentationsleistungen in ODM zwischen dem Elternstamm und angepassten Populationen, dass die angepassten Populationen Xylose effizienter nutzen, um Ethanol schneller und in höheren Mengen herzustellen.

Eine hydrolysattolerante Kolonie wurde weiterentwickelt, um die Ethanoltoleranz durch kontinuierliche Kulturselektion auf ODM mit Xylose und hohem Ethanolgehalt zu verbessern. Alle angepassten Populationen übertrafen den Elternteil in der Fähigkeit, den Xylosestoffwechsel in Gegenwart von 40 Gramm pro Liter Ethanol zu induzieren. Diese Diagramme fassen die Leistungen überlegener toleranter Isolate zusammen, die in Bezug auf die Xyloseaufnahmeraten und die Ethanolausbeuten im Vergleich zum Elternstamm für jede PSGHL-Formulierung bewertet wurden.

Die besten Stämme, die aus dem Primärscreening auf xylosereichem PSGHL ausgewählt wurden, wurden anschließend auf drei vollständige Hydrolysate gescreent und der relative Leistungsindex (RPI) für die Fermentation jedes Isolats innerhalb jedes Hydrolysats berechnet. Als nächstes wurden die kombinierten Gesamtleistungsindizes für jedes Isolat berechnet. Fünf Isolate, drei, 14, 27, 28 und 33, wiesen Gesamt-RPIs von über 60 auf, was sie als die robustesten gegenüber allen Variationen der Hydrolysat- und Nährstoffbedingungen zusammen einstufte.

Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie wissen, wie Sie eine Xylose-Fermentationshefe wie Scheffersomyces stipitis NRRL Y-7124 in einem gezielten Evolutionsprozess herausfordern, robustere Derivate anreichern, isolieren und bewerten können, die Mischzucker in nicht entgifteten Hydrolysaten effektiver fermentieren. Einmal gemeistert, kann diese Technik mit einem täglichen Zeitaufwand von durchschnittlich etwa einer Stunde pro Tag angewendet werden. Signifikante Veränderungen im Evolutionsprozess können in nur vier Monaten dokumentiert werden.

Bei diesem Verfahren ist es wichtig, die fortschreitende Bevölkerung regelmäßig zu retten, indem man die Glycerinvorräte so vorbereitet, dass sie bei minus 80 Grad Celsius einfrieren. Dies ermöglicht die Wiederherstellung der Population, die periodische Bewertung, die Isolierung oder den Neustart des Evolutionsprozesses. Um verschiedene Mutationen zu behandeln, denken Sie daran, die Hefe regelmäßig unter prozessspezifischen Bedingungen auf eine Reihe von Phänotypen zu untersuchen.

Die Berechnung von insgesamt dimensionslosen relativen Leistungsindizes (RPIs) auf der Grundlage kinetischer Parameter ermöglicht die Bewertung des Stammrangs und der Robustheit gegenüber Schwankungen der Fermentationsbedingungen wie Hydrolysattyp und Nährstoffergänzung. Überlegene Hefen, die aus jeder Phase des Evolutionsprozesses hervorgehen, sind Kandidaten für die Genomsequenzierung, so dass die Art der Verbesserungen, wie z. B. die Inhibitortoleranz, reduziert wird und die dioxische Verzögerung verstanden und für das Design biokatalytischer Stämme der nächsten Generation genutzt werden kann.