Charakterisierung komplexer Systeme Mit dem Design of Experiments Ansatz: Transient Protein Expression in Tabak als Case Study

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments ist es, Vorhersagemodelle für die transiente Expression von Proteinen in Pflanzenblättern zu generieren. Dies wird durch die Einrichtung eines Versuchsdesigns erreicht, um die wichtigsten Parameter für die transiente Expression zu identifizieren und ihren Einfluss auf die Proteinakkumulation zu quantifizieren. In einem zweiten Schritt werden Gene kloniert und in Agrobakterien übertragen, die dann in Blätter injiziert werden, was zu einer vorübergehenden Proteinexpression führt.

Als nächstes werden Blattproben analysiert, um die Proteinexpression zu bestimmen. Es werden Ergebnisse erhalten, die das Muster der transienten Proteinexpressionsniveaus in Blättern unterschiedlichen Alters und für verschiedene Inkubationsbedingungen zeigen, basierend auf der Auswertung eines Versuchsmodells. Der Hauptvorteil dieser Technik gegenüber bestehenden Methoden, wie z.B. einem Faktor nach dem anderen, besteht darin, dass Wechselwirkungen zwischen verschiedenen Parametern wie dem Blattalter oder der Blattposition erkannt und quantifiziert werden können.

Der One-Factor-at-a-Time-Ansatz, der häufig verwendet wird, um die Wirkung bestimmter Faktoren auf das Ergebnis eines Experiments zu charakterisieren, ist suboptimal, da die einzelnen Durchläufe während eines Experiments wie Perlen an einer Schnur ausgerichtet sind, wodurch eine geringe Abdeckung des Designraums erreicht wird. Im Gegensatz zur Versuchsplanung der DOE-Strategie erhöht die Variation von mehr als einem Faktor gleichzeitig die Abdeckung und damit die Präzision der resultierenden Modelle. Darüber hinaus ist die verzerrte Abdeckung des Bauraums jeweils ein Faktor.

Experimente können auch nicht in der Lage sein, optimale Betriebsbereiche zu identifizieren und suboptimale Lösungen vorherzusagen, während DOE-Strategien mit größerer Wahrscheinlichkeit bevorzugte Bedingungen identifizieren. Dieses Flussdiagramm veranschaulicht den Prozess für die Planung einer DOE-Strategie. Der erste Schritt besteht darin, relevante Faktoren und Reaktionen für die Aufnahme in das Design zu identifizieren.

In dieser Demonstration werden die Expressionsniveaus eines monoklonalen Anti-HIV-Antikörpers, zwei G 12, und eines Fluoreszenzmarkers, des Proteins DS rot, auf der Grundlage früherer Experimente gemessen. Die als relevant erachtete minimale nachweisbare Differenz beträgt 10 Mikrogramm pro Milliliter für zwei G 12 und 20 Mikrogramm pro Milliliter für DS-Rot. Darüber hinaus betragen die ungefähren Werte für die geschätzte Standardabweichung des Systems für zwei G 12 und DS rot vier bzw. acht Mikrogramm pro Milliliter.

Die restlichen Schritte zur Planung dieser DOE-Strategie werden hier nicht behandelt, Details finden Sie jedoch im begleitenden Manuskript. Zwei G 12 und DS Rot werden in Tabakpflanzen vorübergehend exprimiert. Um mit dem Verfahren für die Pflanzenkultivierung zu beginnen, bereiten Sie 10 x 10 x acht Zentimeter große Gesteinsmauerblöcke vor, indem Sie sie ausgiebig mit deionisiertem Wasser bestreichen, um Rückstände von Chemikalien zu entfernen.

Danach werden die Blöcke mit einer frisch zubereiteten Lösung aus Düngersamen von Tabakpflanzen äquilibriert, indem Sie ein bis zwei Tabaksamen auf jeden Steinwandblock legen, gefolgt von einer kurzen Spülung mit Dünger. Achten Sie darauf, die Samen nicht wegzuwaschen, keimen und kultivieren Sie die Tabakpflanzen 42 Tage lang in einem Gewächshaus unter geeigneten Bedingungen. Bereiten Sie das AUM FASS vor, indem Sie eine Kultur auf einen OD von 600 Nanometern von 5,0 züchten.

Verdünnen Sie die Kultur mit Wasser und zweifachem Infiltrationsmedium, das dem für die Injektion vor der Injektion erforderlichen OD 600 Nanometer entspricht. Der OD 600 Nanometer des Atums der Fasionssuspension wird bestätigt, um die Blätter für die Injektion vorzubereiten. Kratzen Sie die Epidermis an der Injektionsstelle vorsichtig mit einer Pipettenspitze ein, um den Zufluss der AUM Fasion-Lösung zu erleichtern.

Vermeide es, dabei die Blattspreite zu zerreißen. Halten Sie die Spritze mit der AUM-Fasionssuspension senkrecht zur Blattklinge, berühren Sie den Zylinder gegen das zu behandelnde Interkostalfeld und drücken Sie den Auslass vorsichtig auf die Unterseite des Blattes. Drücken Sie gleichzeitig vorsichtig auf die Oberseite des Blattes, um zu verhindern, dass sich die Blattspreite verschiebt oder reißt.

Drücken Sie den Kolben der Spritze vorsichtig nach unten. Die AUM-Modelösung dringt in die Interzellularräume innerhalb der Blattspreite ein, was sich darin zeigt, dass die behandelten Bereiche dunkler, grüner und feuchter erscheinen. Stellen Sie sicher, dass die Spritze während der Injektion senkrecht zum Blatt bleibt.

Andernfalls kann es zu einem Ausstoß der Bakteriensuspension unter hohem Druck kommen. Wiederholen Sie diesen Vorgang an mehreren Positionen, bis das gesamte Interkostalfeld mit aum, aum, fass infiltriert ist. Fahren Sie dann mit dem nächsten Interkostalfeld nach der Injektion fort und inkubieren Sie die Pflanzen unter Bedingungen, die vom DOE festgelegt werden, wenn die Inkubationszeit abgeschlossen ist.

Beginnen Sie mit der Probenahme. Stabilisieren Sie das Blatt mit einem Handtuch und verwenden Sie einen Korkleiher, um vier bis fünf Blattscheiben aus den behandelten Interkostalfeldern an den vom DOE angegebenen Positionen und Zeiten zu entfernen. Entfernen Sie während der Probenahme nicht das ganze Blatt von der Pflanze.

Bestimmen Sie die Masse jeder Probe und geben Sie sie in ein 1,5-Milliliter-Reaktionsgefäß aus Kunststoff, das mit dem Namen und der Masse der Probe beschriftet ist. Lagern Sie die Proben bei minus 20 Grad Celsius oder minus 80 Grad Celsius, bevor sie quantifiziert werden. Der Prozess kann in diesem Stadium für mehrere Monate unterbrochen werden, abhängig von der Stabilität der Probe und der Lagertemperatur, um Proteine aus den Blattscheibenproben zu extrahieren.

Drei Milliliter Extraktionspuffer pro Milligramm Probenmasse zugeben und die Blattscheiben im Reaktionsröhrchen mit einem elektrischen Stößel zerkleinern, bis keine großen Fragmente mehr übrig sind. Um eine Überhitzung der Probe zu vermeiden, stellen Sie das Röhrchen immer dann auf Eis, wenn sich das Röhrchen nach der Zentrifugation warm anfühlt. Um dispergierte Feststoffe zu entfernen, wird der Überstand in ein sauberes 1,5-Millimeter-Reaktionsröhrchen überführt.

Messen Sie die DS-Rotfluoreszenz zweimal hintereinander. In einem gut gespielten 96-Reader, der mit 530 25-Nanometer-Anregungs- und 590 35-Nanometer-Emissionsfiltern für jede Probe ausgestattet ist. Die Fluoreszenz wird über die beiden Reads und die drei technischen Replikate gemittelt und der für die Blindkontrolle aufgezeichnete Wert mit null Mikrogramm pro Milliliter DS red subtrahiert.

Subtrahieren Sie diesen Wert auch von den Zungen der Standardverdünnungen und verwenden Sie diese blank korrigierten Werte für eine lineare Regression, die eine Referenzkurve ergibt. Die Steigung der Referenzkurve wird dann verwendet, um die für die Proben gemessene Fluoreszenz in DS-Rot-Konzentrationen umzurechnen. Das Verfahren zur Bestimmung der Konzentration der beiden G 12-Antikörper soll hier nicht dargestellt werden, wird aber im begleitenden Manuskript ausführlich beschrieben.

Die Software Design Expert wird für die Datenanalyse und -auswertung im Analyseknoten eingesetzt. Wählen Sie die zu analysierende Antwort aus und wählen Sie zunächst keine auf der Registerkarte Transformation. Fahren Sie mit der Registerkarte "Zusammenfassung der Anpassung" fort, die allgemeine Informationen zu Faktoren enthält, die für das zu untersuchende System wichtig sind.

Die Software schlägt ein erstes Modell vor, das auf der Registerkarte "Modell" auf seiner Bedeutung basiert. Ein anfängliches Modell wird basierend auf den Ergebnissen der Anpassungszusammenfassung vorausgewählt. Verwenden Sie den automatisierten Modus, um dieses Modell auf der Registerkarte Innova zu bearbeiten.

Untersuchen Sie das vorgeschlagene Modell und ggf. die eingeschlossenen Faktoren. Entfernen Sie manuell alle Faktoren, deren P-Werte über einem vordefinierten Schwellenwert liegen oder die aufgrund mechanistischer Überlegungen unwahrscheinlich sind, indem Sie zurück zur Registerkarte Modell wechseln, die Auswahl auf manuell ändern und die entsprechenden Faktoren aus dem Modell entfernen. Fahren Sie mit der Registerkarte Diagnose fort, um die Qualität des Modells zu bestätigen und potenzielle Ausreißer im Datensatz zu erkennen, die einen starken Einfluss auf das Modell haben.

Wenn Sie alle Registerkarten im Diagnosetool untersuchen, passen Sie den Transformationstyp auf der entsprechenden Registerkarte an, wenn dies durch das Feld Cox-Diagramm vorgeschlagen wird, und starten Sie das Analyseverfahren auf der Registerkarte Modelldiagramme neu. Visualisieren Sie das ausgewertete Modell für eine begrenzte Anzahl numerischer Faktoren, z. B. drei. Die Darstellung der Ansprechfläche ist nützlich, um optimale Eigenschaften zu beurteilen.

Manuell Antwortflächen veranschaulichen nur die Auswirkungen von zwei Faktoren auf die zu untersuchende Antwortvariable. Die Auswirkung eines zusätzlichen Faktors auf die Antwortvariablen wird durch Ändern des Werts oder der Stufe im Werkzeugfenster "Faktoren" angezeigt. Alternativ können Faktoren der Diagrammachse zugewiesen werden, indem Sie mit der rechten Maustaste im Werkzeugfenster "Faktoren" darauf klicken und die gewünschte Achse der unabhängigen Variablen auswählen.

Bearbeiten Sie die Faktorstufen und weisen Sie sie den Diagrammkoordinaten mit dem Faktorenwerkzeug zu. Exportieren Sie Diagramme mit dem Befehl Diagramm in Datei exportieren auf der Registerkarte Datei. Verwenden Sie den numerischen Unterknoten im Optimierungsknoten, um die gewünschte Antwortvariablen numerisch zu optimieren, abhängig von den Modellfaktoren, auf die wiederum bestimmte Einschränkungen über die Registerkarte Kriterien angewendet werden können.

Berechnen und untersuchen Sie numerische Lösungen auf der Registerkarte "Lösungen" auf der Grundlage der Eingaben auf der Registerkarte "Kriterien". Exportieren Sie diese Lösungen zur weiteren Analyse in eine andere Software, z. B. in eine Tabelle, in der die Faktoreinstellungen für hohe oder niedrige Antwortwerte angezeigt werden. Dies ist hilfreich, wenn mehr als drei numerische Faktoren untersucht werden und die 3D-Darstellung in dieser repräsentativen Studie schwierig ist.

Die DOE-Strategie wurde verwendet, um die Auswirkungen verschiedener Promotoren und fünf Prime-RS auf die transiente Expression von ds zu untersuchen. In dieser Tabelle sind die roten Faktoren, die im transienten Expressionsmodell enthalten sind, und die untersuchten Bereiche aufgeführt. Die fett gedruckten Faktoren sind einzigartig für dieses Experiment.

Die kursiv gedruckten Faktoren beziehen sich auf ein anderes Experiment, das später beschrieben wird. Für alle diskreten numerischen Faktoren wurden mindestens drei Stufen gewählt, um die Berechnung eines quadratischen Basismodells zu ermöglichen. Für die Auswahl der DOE-Läufe wurde ein deoptimaler Auswahlalgorithmus gewählt, um die genauesten Schätzungen für die Koeffizienten des Regressionsmodells zu erhalten.

Das ursprünglich von einem Designexperten vorgeschlagene Design bestand aus 90 Durchläufen, aber das FDS reichte nicht aus, um einen Standardvorhersagefehler von 1 % zu erreichen. Die optimale Erweiterung des Designs auf insgesamt 210 Durchläufe löste dieses Problem und führte zu einem FDS von 100 % mit einer gleichmäßigeren Vorhersagegenauigkeit über den durch die flache Kurve angezeigten Designraum, die DS-Rot-Konzentrationen wurden für alle 210 Durchläufe bestimmt und die Daten wurden log 10 transformiert. Die Modellfaktoren wurden durch automatisierte Rückwärtsselektion aus einem kubischen Modell mit einem Alpha-Level von 0,100 ausgewählt.

Das Ergebnis war ein signifikantes Modell mit unbedeutender mangelnder Anpassung und hohen Werten für die multiplen Korrelationskoeffizienten. Der P-Wert aller Modellfaktoren lag unter 0,05, so dass keine weitere manuelle Manipulation des Modells erforderlich war. Das Modell enthielt drei fett hervorgehobene Faktorwechselwirkungen, die nicht Teil der ursprünglichen Neubewertung des FDS-Diagramms durch das quadratische Basismodell waren.

Die Verwendung aller Faktoren, die im endgültigen Vorhersagemodell enthalten waren, zeigte, dass sich die FDS für den Standardvorhersagefehler durch die Einbeziehung der zusätzlichen Drei-Faktoren-Wechselwirkungen nicht signifikant verringert hatte. Die Diagnosewerkzeuge für die Modellqualität in Design Expert zeigten, dass die Datentransformation nützlich war und es keine fehlenden Faktoren im Modell gab, da der Normalplot der Residuen ein lineares Verhalten zeigte und kein spezifisches Muster in den Residuen im Vergleich zum vorhergesagten Plot beobachtet wurde. Es gab auch keinen Trend im Verlauf des Experiments, der auf eine versteckte zeitabhängige Variable hindeutete.

Stattdessen stimmten die Modellvorhersagen sehr gut mit der beobachteten Diaz-Rotfluoreszenz überein, da alle Punkte nahe der Diagonalen liegen. Es wurde daher angenommen, dass das ausgewählte Modell nützlich ist, um die vorübergehende Expression von DS-Rot in nicht bleihaltigen Tabakblättern vorherzusagen, die von verschiedenen Promotor-Fünf-Prime-UTR-Kombinationen während einer achttägigen Inkubationszeit nach der Infiltration abgeleitet wurden, und es wurde auch ein künstliches lineares Regressionsmodell ohne Datentransformation ausgewählt, um die Folgen einer falschen Faktorenauswahl und -transformation zu veranschaulichen. Wie hier deutlich zu sehen ist, weicht das normale Diagramm der Residuen vom erwarteten linearen Verhalten ab, und es gibt ein V-förmiges Muster im Diagramm der Residuen im Vergleich zum vorhergesagten Diagramm anstelle einer zufälligen Streuung.

Darüber hinaus werden im Diagramm der Residuen im Vergleich zum Lauf zwei Extremwerte hervorgehoben. Während die Vorhersagen sowohl für kleine als auch für hohe, von der Diagonale abweichende Werte schlecht waren, werden hier die optimalen Modellantwortflächen für die transiente DS-Rotexpression in Tabakblättern gezeigt. Das Modell sagte voraus, dass das Blattalter ein signifikanter Faktor war, da die Expressionsniveaus in alten Blättern niedriger waren, z. B. Blatt zwei in Parzelle A und Parzelle B im Vergleich zu jungen Blättern wie Blatt sechs in Parzelle C und Parzelle D. Der Verlauf der Akkumulation von DS-Rot in den Blättern war nicht linear oder exponentiell, sondern folgte einer sigmoidalen Kurve während der acht Tage der Inkubation nach der Infiltration.

Die fünf Prime-UTR-Kombinationen mit dem CAMV 35 SS-Promotor führten zu einer stärkeren DS-Rot-Expression als Kombinationen mit dem NOS-Promotor. Obwohl die fünf Primzahlen UTR auch einen signifikanten Einfluss auf die DS-Rechtsexpression hatten, wie der Vergleich zwischen TL und CHS zeigte, hing die Expressionsstärke vom begleitenden Promotor ab. Das Vorhersagemodell zeigte auch, dass bestimmte Paare von Promotor-Fünf-Prime-UTR-Kombinationen wie nas-CHS und CAMV 35 SS-CHS zu ausgewogenen Expressionsniveaus führten, die sich um weniger als 30% von einem definierten Verhältnis über alle Blätter und Inkubationszeiten von mehr als zwei Tagen unterschieden.

Eine solche ausgewogene Expression wäre nützlich für die Expression von multimeren Proteinen mit einer definierten Stöchiometrie. Der DOE-Ansatz wurde auch verwendet, um die Inkubationsbedingungen und Ernteschemata für die gleichzeitige Produktion von zwei G 12 und DS Red im Tabak zu optimieren. Die Faktoren, die die transiente Expression beeinflussen und in dieses Experiment einbezogen wurden, sind kursiv von 600 Nanometern und Inkubationszeit angegeben.

Es wurde ein Vorhersagemodell für die Expression jedes Proteins in Pflanzen unterschiedlichen Alters etabliert. Junge Blätter wurden 40 Tage nach der Aussaat geerntet, alte Blätter wurden 47 Tage nach der Aussaat geerntet. Diese vier Modelle wurden dann evaluiert und ein Konsensusmodell erstellt, das jeden Faktor berücksichtigte, der in den einzelnen Modellen als signifikant befunden wurde.

Später wurde bestätigt, dass das Konsensusmodell immer noch eine gute Abbildung aller ursprünglichen Datensätze darstellt. Das Konsensusmodell wurde anschließend verwendet, um optimale Inkubationstemperaturen und bakterielle OD 600 Nanometer für beide Proteine zu identifizieren, um die Proteinkonzentrationen in allen Blättern und Blattpositionen bei jungen und alten Pflanzen vorherzusagen. Die Integration der Konzentrationsprofile mit Biomassedaten führte dann zu einer absoluten Proteinausbeute.

Die absoluten Proteinmengen wurden dann mit den damit verbundenen nachgelagerten Kosten korreliert, was eine Kosten-Nutzen-Analyse für die Verarbeitung jedes Blattes pro Pflanzenalter ermöglichte. Die gleiche Menge an DS-Rot und etwa 65 % von zwei G 12 wurde in jungen Pflanzen im Vergleich zu alten Pflanzen gefunden, obwohl die durchschnittliche Biomasse um etwa 50 % niedriger war, was die höhere spezifische Proteinexpression in jungen Pflanzen widerspiegelt. Dabei zeigte sich, dass junge Pflanzen für die transiente Expression von Vorteil waren, da die Proteine trotz der geringeren Gesamtbiomasse im Vergleich zu alten Pflanzen während kürzerer Wachstumsperioden höhere Konzentrationen erreichten.

Schließlich wurde auch festgestellt, dass die Verarbeitung aller Blätter alter Pflanzen teurer war, als die Blätter eins bis drei zu verwerfen und stattdessen die Anzahl der Pflanzen pro Charge zu erhöhen. Daher eignen sich DOE-basierte Modelle nicht nur zur Markierung des letzten Schritts eines Experiments, sondern auch zur Kombination mit anderen Daten, um komplexere Aspekte der Prozessanalyse zu erleichtern. Nachdem Sie sich dieses Video angesehen haben, sollten Sie ein gutes Verständnis dafür haben, wie Sie ein DOE einrichten, durchführen und analysieren, um die transiente Proteinexpression in Pflanzen zu untersuchen.