1. que la fase móvil
- Para preparar la fase móvil, agregar 400 mL de acetonitrilo a aproximadamente 1,5 L de agua purificada de la DI.
- Cuidadosamente añadir 2,4 mL de ácido acético glacial a esta solución.
- Diluir la solución hasta un volumen total de 2.0 L en un matraz aforado con agua purificada de la DI. La solución resultante debe tener un pH entre 2.8 a 3.2.
- Ajustar el pH a 4.2 agregando hidróxido de sodio 40%, mediante goteo con el uso de un medidor de pH digital calibrado. Agregue muy lentamente una vez que el pH llegue a 4.0. Esto debe tomar alrededor de 50 gotas para llevar a cabo.
- Filtrar la fase móvil a través de un filtro de membrana de Nylon 66 de 0.47 μm bajo vacío para desgasificar la solución y eliminar sólidos que podrían conectar la columna cromatográfica. Es importante la fase móvil para evitar que una burbuja, que podría causar un vacío en la fase estacionaria en la entrada de la columna o su forma de trabajo en la célula del detector, causando inestabilidad con la absorbancia de UV de desgasificación.
2. crear las soluciones de componentes
Los tres componentes que deben hacerse son cafeína (0,8 mg/mL), benzoato de potasio (1,4 mg/mL) y aspartamo (éster metílico de L-aspartil-L-fenilalanina) (6,0 mg/mL). Estas concentraciones, una vez diluidas de la misma manera, ponen los estándares en los niveles encontrados en las muestras de soda.
- Añadir 0,40 g de cafeína a un matraz aforado de 500 mL y diluir hasta la marca de 500 mL con agua desionizada.
- Añadir a un matraz aforado de 500 mL 0,70 g de benzoato y luego diluir a la marca de 500 mL con agua desionizada.
- Añadir 0,60 g de aspartamo a un matraz aforado de 100 mL y diluir hasta la marca de 100 mL con agua desionizada. Colocar esta solución en un refrigerador para evitar la descomposición durante el almacenamiento.
3. para las soluciones estándar 7
Los tres componentes todos tienen diferentes coeficientes de distribución, que afecta a cómo cada uno interactúa con los dos de las fases. Cuanto mayor sea el coeficiente de distribución, cuanto más tiempo que pasa el componente en la fase estacionaria, dando por resultado la retención más veces para alcanzar el detector.
- Siguiendo la tabla en el cuadro 1, pipetear la cantidad adecuada de cada componente en un matraz aforado de 50 mL.
- Diluir cada una de las soluciones stock para la marca de 50 mL en matraces aforados con fase móvil.
- Verter cada solución estándar en etiquetado pequeños viales en una gradilla de muestras.
- Almacene los racks de muestras en un refrigerador, junto con las soluciones restantes en los matraces aforados de 50 mL.
4. comprobación de la configuración inicial del sistema HPLC
- Confirman que la línea de residuos en un contenedor de residuos y no es el reciclaje en la fase móvil.
- Verificar que el caudal de la fase móvil se establece en 0, 5 mL/min. Esto es lo suficientemente alto como para permitir que todos los picos eluir dentro de 5 min y frenar lo suficiente para permitir la buena resolución.
- Verificar que la presión mínima y máxima y el caudal se establecen en los valores correctos en el panel frontal del sistema solvente (la bomba).
- Presión mínima: 250 psi (esto es para apagar la bomba, si se produce una fuga).
- Presión máxima: 4.000 psi (esto es para proteger la bomba de última hora, si la forma de un estorbo).
- Pulsa el "cero" en el panel frontal del detector para el espacio en blanco (el blanco es la fase móvil pura).
- Enjuague una jeringa de 100 μl con agua desionizada, luego con varios volúmenes de una de las normas de trabajo para ser analizado y llene la jeringa con la solución. Empezar con las 3 muestras del solo-componente, que permite identificar el pico de cada componente de interés.
5. manualmente inyectar la muestra y recolección de datos
- Con el mango del inyector en la posición de carga, lentamente inyectar 100 μl de solución a través del puerto de tabique.
- Verificar que el programa de recolección de datos está configurado para recopilar datos para 300 s, que permite suficiente tiempo para que todos los 3 picos a fin de eluir a través del detector.
- Cuando esté listo para iniciar la prueba, gire la manija del inyector a la posición de inyectar (que inyecta la muestra en la fase móvil) y haga clic en "Iniciar prueba" en el programa de recolección de datos de computadora inmediatamente. Normas 1-3, sólo uno de los tres picos secuenciales aparecen en la pantalla durante la ejecución (figura 1).
- Una vez 300 s han pasado, la recolección de datos envía un mensaje para guardar el archivo de datos. Guardar los datos bajo un nombre de archivo adecuada (p. ej., enfermedades de transmisión sexual #1).
- Nota el tiempo en segundos para el pico de cada ensayo, que se utiliza en la identificación de ese componente.
- Retire la jeringa del septo y repita el proceso para cada una de las restantes normas de trabajo, utilizando el mismo tiempo por el cromatograma como determinado a partir de la primera carrera.
Figura 1. El cromatograma de los 3 componentes. De izquierda a derecha, son cafeína, aspartamo y benzoato.
6. las muestras de refrescos de dieta
Coke Zero, Diet Coke y Pepsi de dieta son las "incógnitas". Se han quedado de envases abiertos durante la noche para deshacerse de la carbonatación, como burbujas no son buenas para el sistema HPLC. Esto suficientemente se deshace de los gases en las muestras.
- Dibujar aproximadamente 2 mL de la soda de dieta en una jeringa de plástico.
- Coloque la punta del filtro a la jeringa a través de Luer-Lok girando en su lugar.
- Empujar el líquido en la jeringa a través del filtro y en un frasco pequeño de vidrio. Esto elimina las partículas no deseadas que potencialmente podrían obstruir la columna de la separación.
- Diluir cada muestra con una cantidad igual de agua DI, por lo que son en el 50% de pureza.
- Inyectar 100 μl de la muestra en el bucle de muestra y realizar ensayos con los mismos parámetros en cuanto a las normas.
7. cálculos
- De las concentraciones de las soluciones de componente, calcular la concentración de todos los componentes en las normas, basadas en las diluciones que se realizaron para las 7 muestras.
- Determinar las áreas de picos en los cromatogramas de cada estándar y muestras desconocidas por el método triangular, que es igual a horas punta de altura el ancho a la altura de ½ (figura 2). Después de determinar que pico corresponde a cada componente basado en el tiempo que tarda cada componente mostrar sus respectivos picos, entrar en estas áreas de pico en una hoja de cálculo de computadora.
- Crear curvas de calibración de área de pico frente a concentración (mg/L) en las normas para los tres componentes.
- Determinar que los mínimos de la cuadrados aptos para cada curva de calibración.
- Calcular la concentración de cada componente en los refrescos de dieta de las áreas de pico que se muestra en los ensayos de HPLC de las muestras. Recuerde que el refresco de dieta se diluyó por un factor de 2 antes de inyectar en el sistema HPLC.
- Calcular la cantidad, en mg/L, de cada componente de los refrescos de dieta.
- Basándose en los resultados, calcular los miligramos de cada componente en una lata de 12 onzas de soda. Asumir 12 oz = 354,9 mL.
Figura 2. Un ejemplo básico de una curva pico alto y ancho, que se multiplicará (altura del pico veces ancho de altura ½).
Fuente: Dr. Pablo Bower - Universidad de Purdue
Cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) es un importante método analítico utilizado para sepa…
1. que la fase móvil
- Para preparar la fase móvil, agregar 400 mL de acetonitrilo a aproximadamente 1,5 L de agua purificada de la DI.
- Cuidadosamente añadir 2,4 mL de ácido acético glacial a esta solución.
- Diluir la solución hasta un volumen total de 2.0 L en un matraz aforado con agua purificada de la DI. La solución resultante debe tener un pH entre 2.8 a 3.2.
- Ajustar el pH a 4.2 agregando hidróxido de sodio 40%, mediante goteo con el uso de un medidor de pH digital calibrado. Agregue muy lentamente una vez que el pH llegue a 4.0. Esto debe tomar alrededor de 50 gotas para llevar a cabo.
- Filtrar la fase móvil a través de un filtro de membrana de Nylon 66 de 0.47 μm bajo vacío para desgasificar la solución y eliminar sólidos que podrían conectar la columna cromatográfica. Es importante la fase móvil para evitar que una burbuja, que podría causar un vacío en la fase estacionaria en la entrada de la columna o su forma de trabajo en la célula del detector, causando inestabilidad con la absorbancia de UV de desgasificación.
2. crear las soluciones de componentes
Los tres componentes que deben hacerse son cafeína (0,8 mg/mL), benzoato de potasio (1,4 mg/mL) y aspartamo (éster metílico de L-aspartil-L-fenilalanina) (6,0 mg/mL). Estas concentraciones, una vez diluidas de la misma manera, ponen los estándares en los niveles encontrados en las muestras de soda.
- Añadir 0,40 g de cafeína a un matraz aforado de 500 mL y diluir hasta la marca de 500 mL con agua desionizada.
- Añadir a un matraz aforado de 500 mL 0,70 g de benzoato y luego diluir a la marca de 500 mL con agua desionizada.
- Añadir 0,60 g de aspartamo a un matraz aforado de 100 mL y diluir hasta la marca de 100 mL con agua desionizada. Colocar esta solución en un refrigerador para evitar la descomposición durante el almacenamiento.
3. para las soluciones estándar 7
Los tres componentes todos tienen diferentes coeficientes de distribución, que afecta a cómo cada uno interactúa con los dos de las fases. Cuanto mayor sea el coeficiente de distribución, cuanto más tiempo que pasa el componente en la fase estacionaria, dando por resultado la retención más veces para alcanzar el detector.
- Siguiendo la tabla en el cuadro 1, pipetear la cantidad adecuada de cada componente en un matraz aforado de 50 mL.
- Diluir cada una de las soluciones stock para la marca de 50 mL en matraces aforados con fase móvil.
- Verter cada solución estándar en etiquetado pequeños viales en una gradilla de muestras.
- Almacene los racks de muestras en un refrigerador, junto con las soluciones restantes en los matraces aforados de 50 mL.
4. comprobación de la configuración inicial del sistema HPLC
- Confirman que la línea de residuos en un contenedor de residuos y no es el reciclaje en la fase móvil.
- Verificar que el caudal de la fase móvil se establece en 0, 5 mL/min. Esto es lo suficientemente alto como para permitir que todos los picos eluir dentro de 5 min y frenar lo suficiente para permitir la buena resolución.
- Verificar que la presión mínima y máxima y el caudal se establecen en los valores correctos en el panel frontal del sistema solvente (la bomba).
- Presión mínima: 250 psi (esto es para apagar la bomba, si se produce una fuga).
- Presión máxima: 4.000 psi (esto es para proteger la bomba de última hora, si la forma de un estorbo).
- Pulsa el "cero" en el panel frontal del detector para el espacio en blanco (el blanco es la fase móvil pura).
- Enjuague una jeringa de 100 μl con agua desionizada, luego con varios volúmenes de una de las normas de trabajo para ser analizado y llene la jeringa con la solución. Empezar con las 3 muestras del solo-componente, que permite identificar el pico de cada componente de interés.
5. manualmente inyectar la muestra y recolección de datos
- Con el mango del inyector en la posición de carga, lentamente inyectar 100 μl de solución a través del puerto de tabique.
- Verificar que el programa de recolección de datos está configurado para recopilar datos para 300 s, que permite suficiente tiempo para que todos los 3 picos a fin de eluir a través del detector.
- Cuando esté listo para iniciar la prueba, gire la manija del inyector a la posición de inyectar (que inyecta la muestra en la fase móvil) y haga clic en "Iniciar prueba" en el programa de recolección de datos de computadora inmediatamente. Normas 1-3, sólo uno de los tres picos secuenciales aparecen en la pantalla durante la ejecución (figura 1).
- Una vez 300 s han pasado, la recolección de datos envía un mensaje para guardar el archivo de datos. Guardar los datos bajo un nombre de archivo adecuada (p. ej., enfermedades de transmisión sexual #1).
- Nota el tiempo en segundos para el pico de cada ensayo, que se utiliza en la identificación de ese componente.
- Retire la jeringa del septo y repita el proceso para cada una de las restantes normas de trabajo, utilizando el mismo tiempo por el cromatograma como determinado a partir de la primera carrera.
Figura 1. El cromatograma de los 3 componentes. De izquierda a derecha, son cafeína, aspartamo y benzoato.
6. las muestras de refrescos de dieta
Coke Zero, Diet Coke y Pepsi de dieta son las "incógnitas". Se han quedado de envases abiertos durante la noche para deshacerse de la carbonatación, como burbujas no son buenas para el sistema HPLC. Esto suficientemente se deshace de los gases en las muestras.
- Dibujar aproximadamente 2 mL de la soda de dieta en una jeringa de plástico.
- Coloque la punta del filtro a la jeringa a través de Luer-Lok girando en su lugar.
- Empujar el líquido en la jeringa a través del filtro y en un frasco pequeño de vidrio. Esto elimina las partículas no deseadas que potencialmente podrían obstruir la columna de la separación.
- Diluir cada muestra con una cantidad igual de agua DI, por lo que son en el 50% de pureza.
- Inyectar 100 μl de la muestra en el bucle de muestra y realizar ensayos con los mismos parámetros en cuanto a las normas.
7. cálculos
- De las concentraciones de las soluciones de componente, calcular la concentración de todos los componentes en las normas, basadas en las diluciones que se realizaron para las 7 muestras.
- Determinar las áreas de picos en los cromatogramas de cada estándar y muestras desconocidas por el método triangular, que es igual a horas punta de altura el ancho a la altura de ½ (figura 2). Después de determinar que pico corresponde a cada componente basado en el tiempo que tarda cada componente mostrar sus respectivos picos, entrar en estas áreas de pico en una hoja de cálculo de computadora.
- Crear curvas de calibración de área de pico frente a concentración (mg/L) en las normas para los tres componentes.
- Determinar que los mínimos de la cuadrados aptos para cada curva de calibración.
- Calcular la concentración de cada componente en los refrescos de dieta de las áreas de pico que se muestra en los ensayos de HPLC de las muestras. Recuerde que el refresco de dieta se diluyó por un factor de 2 antes de inyectar en el sistema HPLC.
- Calcular la cantidad, en mg/L, de cada componente de los refrescos de dieta.
- Basándose en los resultados, calcular los miligramos de cada componente en una lata de 12 onzas de soda. Asumir 12 oz = 354,9 mL.
Figura 2. Un ejemplo básico de una curva pico alto y ancho, que se multiplicará (altura del pico veces ancho de altura ½).
La cromatografía líquida de alta resolución, o HPLC, es una técnica muy versátil que separa los componentes de una mezcla líquida en función de sus diferentes interacciones con una fase estacionaria.
La HPLC es una adaptación de la cromatografía en columna. En la cromatografía en columna, una columna está llena de perlas a microescala llamada fase estacionaria. Las cuentas de fase estacionaria están funcionalizadas con grupos químicos que inducen una interacción entre la cuenta y los componentes de una mezcla ubicada en la fase líquida o móvil. A medida que la mezcla fluye a través de la columna, los componentes interactúan con la fase estacionaria de manera diferente.
En HPLC, la cromatografía en columna se realiza a un caudal más alto y, por lo tanto, a una presión más alta que la cromatografía en columna clásica. Esto permite el uso de cordones de fase estacionaria más pequeños con una mayor relación superficie-volumen, lo que aumenta en gran medida la interacción de la fase estacionaria y los componentes en la fase móvil.
Este video presentará los conceptos básicos del funcionamiento de la HPLC al demostrar la separación de los componentes de varios refrescos dietéticos.
Hay dos tipos de HPLC que se utilizan en el laboratorio: analítico y preparativo. En la HPLC analítica, el instrumento se utiliza para identificar componentes de un pequeño volumen, y la muestra analizada se descarta como residuo. En la HPLC preparativa, el instrumento se utiliza para purificar una mezcla y se recoge una cantidad deseada de cada componente en fracciones.
La instrumentación de HPLC consta de una serie de componentes simples. En primer lugar, la fase móvil, mantenida en depósitos de disolvente, es bombeada a través del sistema por una o más bombas a un caudal constante. El inyector de muestras inyecta la muestra en la corriente de fase móvil. La muestra, diluida por la fase móvil, se entrega a la columna de HPLC, donde se separan los componentes de la muestra. A continuación, el detector analiza los componentes y los guarda en fracciones para su uso posterior o los transfiere a una botella de residuos.
La columna de HPLC es el componente clave del sistema. Está compuesto por un cilindro de metal o plástico, empaquetado con perlas a microescala de fase estacionaria o resina de cromatografía. La mezcla de muestra fluye a través del lecho de partículas empaquetadas a un caudal constante y cada componente interactúa con la fase estacionaria a medida que fluye.
Los compuestos interactúan con la fase estacionaria de manera diferente y, por lo tanto, viajan a lo largo de la columna hasta el detector a una velocidad diferente. El tiempo necesario para que un componente salga de la columna, o eluya, se denomina tiempo de retención. El resultado es un gráfico de tiempo de retención frente a intensidad, o un cromatograma. El tiempo de retención se utiliza para identificar el componente. El tamaño del pico, específicamente el área debajo del pico, se utiliza para cuantificar la cantidad del compuesto en la solución inicial.
La elección de la fase estacionaria depende de las propiedades de los componentes de la mezcla de muestra. La fase estacionaria más utilizada son las perlas de sílice, ya que son un material inerte no polar que forma perlas a microescala y alcanza una densidad de empaquetamiento suficiente. El tipo más común de HPLC es la cromatografía de fase reversa, que utiliza una fase estacionaria hidrofóbica, generalmente perlas de sílice con cadenas C18 unidas a la superficie de las perlas. Los componentes se eluyen en orden decreciente de polaridad.
La fase móvil utilizada en la cromatografía de fase reversa suele ser una mezcla de agua y un disolvente orgánico, como el acetonitrilo. Dependiendo de la muestra, la fase móvil puede permanecer en una proporción constante de agua y disolvente orgánico, lo que se conoce como modo isocrático. Sin embargo, esto puede dar lugar a picos amplios, en el caso de un alto contenido de agua, o picos superpuestos, en el caso de un alto contenido orgánico.
La relación de fase móvil también se puede cambiar linealmente o por pasos durante la separación, para crear un gradiente de fase móvil. Una elución en gradiente puede evitar el ensanchamiento de los picos de los componentes menos polares, mejorando así la separación y acortando el tiempo de elución.
Ahora que se han esbozado los conceptos básicos de la HPLC, se demostrará la técnica de HPLC en el laboratorio. En este experimento, se utilizará HPLC para separar y cuantificar tres componentes comunes de los refrescos dietéticos.
En primer lugar, para preparar la fase móvil, añadir 400 mL de acetonitrilo a 1,5 L de agua desionizada purificada. A continuación, añada con cuidado 2,4 ml de ácido acético glacial. Diluir la solución hasta un volumen total de 2 L. La solución resultante debe tener un pH entre 2,8 y 3,2.
Ajuste el pH a 4,2 añadiendo un 40% de NaOH, gota a gota, a la solución de agitación, con el uso de un medidor de pH calibrado.
Filtre la fase móvil a través de un filtro de membrana de 0,47 μm al vacío para desgasificar la solución y eliminar los sólidos que podrían obstruir la columna. Es importante desgasificar la solución, ya que las burbujas pueden causar vacíos en la fase estacionaria o llegar a la celda del detector y causar inestabilidad en las mediciones.
Prepare soluciones de tres componentes de cafeína, benzoato y aspartamo, que son tres componentes típicos de los refrescos dietéticos. Estas soluciones de componentes se utilizan para preparar las soluciones estándar que se utilizarán para determinar las incógnitas. Prepare 500 ml de las soluciones de cafeína y benzoato.
Prepare 100 mL de la solución componente de aspartamo. Guarde la solución en el refrigerador cuando no esté en uso para evitar la descomposición.
A continuación, prepare 7 soluciones estándar, cada una con diferentes concentraciones de cafeína, benzoato y aspartamo. Pipetear la cantidad adecuada de cada componente en un matraz aforado y diluir hasta la marca de 50 ml con fase móvil.
Cada una de las 3 primeras soluciones contiene un componente, para permitir la identificación de picos. Las otras 4 soluciones contienen un rango de concentraciones de los 3 componentes, con el fin de correlacionar la altura del pico con la concentración.
Vierta cada solución estándar en un vial etiquetado en un estante de muestras. Guarde el estante de muestras con las muestras y las soluciones restantes en el refrigerador.
En primer lugar, configure la fase móvil y los contenedores de residuos. Asegúrese de que las líneas de residuos se introduzcan en un contenedor de residuos y no se reciclen de nuevo en la fase móvil. Asegúrese de que la línea de fase móvil de entrada se alimente al contenedor de fase móvil.
Verifique que el caudal de la fase móvil esté ajustado a 0,5 mL/min. Este caudal permitirá que todos los componentes eluyan en 5 minutos, pero es lo suficientemente lento como para garantizar la resolución de picos individuales.
A continuación, verifique las presiones mínima y máxima en el sistema de suministro de solvente. Estos ajustes apagan la bomba en caso de fuga u obstrucción, respectivamente.
Presione "cero" en el panel frontal de los detectores para establecer el espacio en blanco. Enjuague un 100-? L jeringa con agua desionizada, luego con varios volúmenes de 1 de los 7 estándares de trabajo. A continuación, llene la jeringa con esa solución. Comience con las 3 muestras de un solo componente para identificar el pico de cada componente.
A continuación, inyecte manualmente la solución, colocando el mango del inyector en la posición de carga. Inyecte lentamente el 100 ? L de solución a través del puerto del tabique.
Verifique que el programa de recopilación de datos esté configurado para recopilar datos durante 300 s, lo que permite tiempo suficiente para que los 3 picos eluyan a través del detector. Cuando esté listo para comenzar el ensayo, gire el mango del inyector a la posición de inyección, para inyectar la muestra en la fase móvil. Inmediatamente, haga clic en "Iniciar prueba" en el programa de recopilación de datos. Cuando se complete el escaneo, repita el proceso para cada una de las 7 soluciones estándar. Para cada uno de los 3 primeros estándares, solo aparece uno de los 3 picos. Anote la ubicación del pico, que se utiliza para identificar el componente.
Selecciona 3 muestras de refrescos dietéticos y déjalos reposar en recipientes abiertos durante la noche para eliminar la carbonatación.
Después de la desgasificación durante la noche, extraiga aproximadamente 3 ml de cada refresco dietético en una jeringa de plástico. A continuación, coloque una punta de filtro en la jeringa y empuje la soda a través del filtro hacia un frasco de vidrio, para eliminar las partículas sólidas.
Diluir 2 mL de cada muestra con 2 mL de la fase móvil para disminuir la concentración de soda a la mitad.
Sorteo 100 ? L de una de las muestras de refresco en una jeringa e inyectarla en el circuito de muestra. Ejecute la prueba con parámetros idénticos a los de las soluciones estándar. Repita para cada muestra de refresco.
En primer lugar, correlacione las áreas pico de las muestras estándar con las concentraciones conocidas. Para ello, determine las áreas de pico en los cromatógrafos para cada muestra estándar utilizando el método triangular. Calcule las horas de altura máxima con la anchura a la mitad de la altura y utilice este valor como el área máxima.
Usando el área de pico y las concentraciones conocidas, cree una curva de calibración para cada componente y determine el ajuste de mínimos cuadrados para cada curva de calibración.
Calcule la concentración de cada componente en las gaseosas dietéticas de las áreas pico. Recuerde que todas las gaseosas se diluyeron en un factor de 2 antes de inyectarlas en la HPLC. Con base en estos resultados, calcule los mg de cada componente en una lata de refresco de 12 onzas.
Como era de esperar, las 3 gaseosas analizadas contenían aproximadamente la misma cantidad del benzoato conservante. Sin embargo, los productos de Coca-Cola contenían más cafeína. Los valores calculados para todos los componentes se correlacionaron bien con los valores informados por los fabricantes.
La HPLC es un instrumento muy versátil que se utiliza en una amplia gama de análisis.
La HPLC se utiliza a menudo para purificar moléculas peptídicas. En este ejemplo, se prepararon complejos de péptidos transmembrana y luego se estabilizaron mediante reticulación oxidativa de las proteínas con enlaces disulfuro.
A continuación, las proteínas se disolvieron en ácido fórmico y se purificaron mediante HPLC de fase reversa. A continuación, la muestra se eluyó utilizando un gradiente lineal de dos disolventes y la pureza se confirmó con espectrometría de masas.
La HPLC también se puede utilizar para identificar compuestos orgánicos sintetizados en el laboratorio. En el experimento de Miller-Urey se estudió la síntesis abiótica de compuestos orgánicos en la tierra primigenia. Los gases primordiales, como el metano y el amoníaco, se introdujeron en un matraz que contenía agua, simulando los primeros océanos. Luego se aplicó una descarga eléctrica, imitando los rayos en la tierra primordial.
A continuación, el agua se analizó mediante HPLC junto con espectrometría de masas y se comparó con los estándares de aminoácidos conocidos. En este experimento se sintetizaron e identificaron 23 aminoácidos.
Acabas de ver la introducción de JoVE a la HPLC. Ahora debe comprender los conceptos básicos de la ejecución del instrumento y el análisis de los datos resultantes.
¡Gracias por mirar!
Q1: How does HPLC separate components in a liquid mixture?
HPLC separates components based on their different interactions with a stationary phase. A liquid mobile phase is pumped through a column packed with small beads of stationary phase. Components interact differently with these beads and travel through the column at different rates, causing separation. The time each component takes to exit the column, called retention time, identifies the component.
Q2: What is the difference between analytical and preparative HPLC?
Analytical HPLC identifies components in a small sample volume, which is then discarded as waste. Preparative HPLC purifies a mixture and collects a desired amount of each component in fractions for later use. Both use the same separation principle but differ in their purpose and sample handling after analysis.
Q3: Why is degassing the mobile phase important in HPLC?
Degassing removes dissolved gases from the mobile phase before it enters the column. Bubbles in the mobile phase can create voids in the stationary phase or travel to the detector cell, causing measurement instability. Filtering the mobile phase through a membrane filter under vacuum effectively removes gases and solid particulates that could clog the column.
Q4: What does the chromatogram tell you about separated components?
A chromatogram plots retention time versus signal intensity. The retention time identifies each component, while the peak area quantifies the amount of compound in the original solution. By correlating peak areas to known concentrations using calibration curves principles and applications, you can determine unknown sample concentrations.
Q5: What is reversed-phase chromatography and when is it used?
Reversed-phase chromatography uses a hydrophobic stationary phase, typically silica beads with C18 chains bonded to the surface, paired with a polar mobile phase of water and organic solvent like acetonitrile. Components elute in order of decreasing polarity. This is the most common HPLC mode and works well for water-soluble samples.
Q6: How does gradient elution improve HPLC separation?
Gradient elution changes the mobile phase ratio linearly or stepwise during separation, increasing the organic solvent concentration over time. This prevents peak broadening of less polar components that occurs with constant isocratic conditions, thereby improving separation quality and shortening elution time for complex mixtures.
Q7: Why are smaller stationary phase beads used in HPLC compared to column chromatography?
HPLC operates at higher flow rates and pressures than classical column chromatography, enabling the use of smaller stationary phase beads. These micro-scale beads have a greater surface area to volume ratio, which greatly increases interaction between the stationary phase and sample components, improving separation efficiency and resolution.
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