Summary
Ce protocole décrit une microfluidique de co-culture de modèle pour la culture simultanée et localisée des cellules épithéliales et des bactéries. Ce modèle peut être utilisé pour étudier le rôle des différents signaux moléculaires solubles sur la pathogenèse ainsi que l'écran de l'efficacité des souches bactériennes probiotiques putatifs.
Abstract
La gastro-intestinal humain intestinal (GI) est un environnement unique dans lequel les cellules épithéliales intestinales et non pathogènes (commensaux) les bactéries coexistent. Il a été proposé que le microenvironnement des rencontres que l'agent pathogène dans la couche commensale est importante pour déterminer l'ampleur de la colonisation. Les méthodes de culture actuelles pour enquêter sur la colonisation des pathogènes ne sont pas bien adaptés pour enquêter sur cette hypothèse car ils ne permettent pas de co-culture de bactéries et de cellules épithéliales d'une manière qui imite le microenvironnement tractus gastro-intestinal. Nous décrivons ici un microfluidique de co-culture modèle qui permet la culture indépendante des cellules eucaryotes et les bactéries, et de tester l'effet du microenvironnement commensale sur la colonisation d'agents pathogènes. Le modèle de co-culture se manifeste par l'élaboration d'un commensal
Protocol
1. La fabrication des maîtres de silicium en utilisant la norme SU-8 photolithographie 1 (non représenté dans cette vidéo).
- Utiliser des méthodes standard de SU-8 photolithographie pour créer un SU-8 "maîtres" (SU-8 2050, MicroChem, Newton, MA) pour fabriquer les différents composants (PDMS de différentes épaisseurs, de co-culture de chambre) dans une salle blanche. Ces moules maître peut être fabriqué dans toute installation de microfabrication (par exemple, Stanford Microfluidique Fonderie; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
- Avant de réplication PDMS, exposer le SU-8 maîtres d'fluorosilane la vapeur dans un dessiccateur attaché à une source de vide pour faciliter la libération facile de PDMS par le maître. Ajouter une goutte de fluorosilane d'une serviette en papier et appliquer le vide pendant une minute. Retirez le vide et laissez 30 min pour le dépôt de fluorosilane. Gardez le SU-8 de maître dans un récipient fermé pour une utilisation future.
2. Réplique de moulage de PDMS de SU-8 master 2
- La couche fluidique et la couche de contrôle sont réalisés par moulage réplique de PDMS de SU-8 maître.
- Mélanger le PDMS pré-polymère et cross-linker à un poids de 10h01. Ratio et dégazer dans un dessiccateur pendant 1 heure (ou jusqu'à ce que les bulles d'air sont éliminés du mélange PDMS).
- Placez le SU-8 maître dans une boîte de Pétri et verser délicatement le mélange PDMS sur le dessus de la SU-8 maître. Degas le PDMS à nouveau.
- Spin le moule à 1200 rpm pendant une minute pour obtenir une épaisseur uniforme d'environ 100 microns de PDMS sur le moule.
- Chauffer la boîte de Pétri contenant le PDMS et le SU-8 moule maître à 80 ° C pendant une heure pour guérir le PDMS.
- Retirez le guérir PDMS-couverte SU-8 maîtres de la plaque chauffante.
- Peler le moule PDMS du maître SU-8.
- Percez quatre trous dans le moule PDMS en utilisant un calibre 20 à bout émoussé l'aiguille pour les entrées bactéries deux, une sortie et un port pneumatique.
3. Collage de multicouches appareils PDMS: Cet appareil est assemblé avec trois couches, une couche supérieure qui contient le canal principal, une couche de pneumatiques milieu, et une couche inférieure bactérienne qui contient les canaux pour les bactéries. Les trois couches sont assemblés comme décrit ci-dessous.
- Mouiller les membranes en PDMS avec du méthanol et soigneusement les peler de leur SU-8 du moule maître à l'aide d'une pince propre. Membranes Déposer sur une plaque en téflon.
- Placez la membrane pneumatique et la couche fluidique sur une chambre à plasma d'oxygène. Tourner sur le plasma pendant 40 secondes (10 sccm pression d'oxygène, de puissance RF 100W).
- Après une exposition au plasma, d'aligner (dans les 10 minutes) de la membrane sur le fond du canal PDMS l'aide de pinces. Addition de méthanol sur la membrane et les couches PDMS permet la libre circulation des couches, et rend l'alignement facile. Dans ce cas, le dispositif est placé sur un morceau de gaze pour permettre aux vapeurs de méthanol à s'échapper.
- Guérissez les couches alignées PDMS sur une plaque chauffante à 80 ° C pendant 8 h.
- Après collage de la membrane pneumatique sur la couche inférieure, répétez les étapes 3.2 à 3.4 pour coller le canal supérieur sur le dispositif de PDMS assemblés composites.
4. L'assemblage du dispositif de PDMS 3,4
- Percez des trous dans les ports d'entrée et de sortie utilisés pour l'ensemencement des cellules eucaryotes et les bactéries.
- Relier les tubes Tygon (0,01 pouces OD) aux ports et à exploiter la couche pneumatiques en tirant avec une seringue de 20ml.
- Placez le modèle PDMS et d'une lame de verre pré-nettoyés dans une chambre à plasma d'oxygène. Tourner sur le plasma pendant 20 sec (pression d'oxygène 20 sccm, RF 300W) sans appliquer le vide.
- Afin d'éviter tout contact entre l'île mur (PDMS) collage à la lame de verre, se connecter immédiatement une seringue à l'appareil et appliquer le vide en tirant la seringue et le maintenant en place.
- Appuyez doucement sur le modèle de PDMS sur le verre (dans les 2 minutes).
- Cure le dispositif de PDMS à 80 ° C pendant 10 minutes.
5. Traiter la surface du verre avec de la fibronectine
- Stériliser appareil sous UV pendant 15 minutes après le raccordement de tuyaux Tygon à chaque port.
- Remplissez et le débit du PBS stérile dans le canal pour enlever tous les débris dans le canal. Appliquer des flux pendant 10 minutes pour enlever les bulles d'air. Les bulles d'air peuvent facilement échapper à la PDMS en raison de sa perméabilité aux gaz.
- Remplir une solution de teinture de couleur dans le canal pneumatique pour éviter la formation de bulles d'air dans le canal.
- Afin de faciliter l'ensemencement des cellules eucaryotes sur le verre, introduire un 1 ug / ml solution de fibronectine dans l'appareil et laisser incuber pendant 40 min à 37 ° C.
- Laver la fibronectine excédent avec 1 ml de milieu de croissance.
6. Formation et évaluation des commensaux E. coli dans les biofilmsîles
- Diluer les bactéries commensales (par exemple, E. coli BW25113/pCM18) dans les médias M9 minimale à OD 600 ~ 1 pour former un biofilm commensales dans les chambres fermées / îles.
- Fermer le mur île par l'application positive liquide à haute pression. Un convertisseur de pression artisanales air-liquide est utilisé pour prévenir la formation de bulles d'air dans le canal.
- Introduire le commensal E. coli dans les îles avec la vanne fermée, et permettent aux bactéries d'attacher pendant 1 heure à 32 ° C.
- Laver les bactéries seules et perfuser une suspension diluée bactérienne (DO 600 ~ 0,05) à 0.25mL/hr pendant 12 heures.
- Rincer le biofilm avec des produits frais milieux de croissance DMEM pour enlever les bactéries faiblement attachés et se préparer pour la fixation des cellules eucaryotes.
- Image du biofilm en utilisant un Leica TCS SP5 microscope confocal à balayage laser (Bannockburn, IL), et de visualiser l'architecture du biofilm en utilisant le logiciel Imaris 5.
7. Ensemencement des cellules eucaryotes autour des îles bactérienne 6-8
- Trypsiniser cellules HeLa par flacon de culture tissulaire et remettre en suspension dans des milieux DMEM pour une densité de semis de 5 x 10 5 cellules / ml.
- Présentez les cellules HeLa dans l'appareil à un débit de 2 mL / min en utilisant une pompe seringue Picoplus (Harvard Apparattus, MA). Assurez-vous que le mur île est abaissé pour que le biofilm bactérien est séparée de la région de cellules HeLa. Cette étape doit être effectuée sur la scène d'un microscope optique afin que l'uniformité de l'ensemencement peut être déterminée.
- Serrer la sortie de la cellule afin de réduire le mouvement de la suspension cellulaire dans le canal et incuber pendant 6 h à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur.
- Perfuser l'appareil avec un milieu de croissance à 0,5 ml / h pour enlever les cellules seules.
- Actualiser les médias DMEM pour HeLa et commensaux E. coli toutes les 6 heures.
8. Introduction de bactéries pathogènes dans l'île et l'exposition aux cellules eucaryotes
- Préparer E. coli O157: H7 (EHEC) pour infecter les cellules HeLa à une multiplicité d'infection (MOI) de 100:1 200:1 (nombre de cellules HeLa par EHEC).
- Rincer et laver faiblement attachés bactéries commensales.
- Introduire une suspension diluée EHEC (DO600 ~ 0,1) dans les îles.
- Incuber appareil à 37 ° C dans un 5% de CO 2 incubateur pendant 6 heures sans écoulement pour permettre à EHEC pour être exposé à des signaux présents dans le biofilm commensales.
- Soulevez le mur de PDMS pour exposer EHEC dans les îles commensales de cellules HeLa pendant 6 heures.
- Rincer le canal avec du PBS et les taches pour les cellules vivantes et mortes en utilisant le kit Live / Dead (L3224, Invitrogen, CA).
- L'emplacement des images multiples sur un microscope Zeiss Axiovert 200M fluorescence et estimer le nombre de cellules vivantes et mortes.
9. Résultats Représentant 9
La séquence des événements dans les infections des voies gastro-intestinal a été imité par le développement d'une monocouche de cellules HeLa et un commensal E. biofilm coli et d'exposer à l'EHEC biofilm commensales avant l'infection des cellules HeLa. Les étapes impliquées dans la fabrication de la microfluidique de co-culture du modèle sont présentés dans la figure 1. Figure 2A montre un rendu en 3 dimensions de l'appareil de co-culture. Les deux régions dans le dispositif de co-culture de la chambre de culture de cellules eucaryotes et les bactéries de l'île sont montrés dans la figure 2B avec des colorants de couleurs différentes (violet pour les régions eucaryotes et vert pour l'île de bactéries). La faisabilité d'isoler les régions de culture bactérienne de la région environnante eucaryotes est montré dans la figure 2C utilisant des colorants de couleurs. La figure 3 montre des résultats représentatifs de la co-culture de cellules épithéliales et des bactéries. Figure 3A montre la colonisation du biofilm commensales (vert) île par EHEC (rouge). La figure 3B montre la juxtaposition de cellules épithéliales et commensaux E. coli avec des EHEC dans l'île bactérienne. La DP exprimant la GFP EHEC et exprimer les bactéries commensales sont localisés dans l'île quand le mur de PDMS est abaissé, ce qui illustre la faisabilité d'isoler l'île bactérienne de cellules épithéliales.
Figure 1: Schéma de l'ensemencement des cellules dans le modèle de co-culture. (1) Le mur de PDMS est abaissé pour former une île, les bactéries commensales sont introduits dans l'île, et la fibronectine est coulé autour de l'île. (2) des cellules HeLa sont ensemencées dans les régions qui entourent l'île. (3) Après les cellules HeLa atteignent la confluence et le biofilm commensales a développé, à EHEC est introduit dans l'île. (4) Le mur de PDMS est levépour exposer les cellules HeLa qui entoure l'île d'EHEC. En médaillon montre les détails du fonctionnement de la vanne.
Figure 2: Modèle microfluidiques pour la co-culture de cellules épithéliales et des bactéries. (A) en trois dimensions restitution de l'appareil de co-culture montrant pneumatique actionné régions piégeage pour former des îlots bactérienne chez les cellules épithéliales. Chaque île bactérienne (1200 um de diamètre et 1000 um d'intervalle) a une entrée et une sortie pour fournir un milieu de croissance et d'élimination des déchets de l'île. (B) Micrographie de l'appareil de co-culture avec des colorants de couleurs montrant les différentes régions (zone de cellules épithéliales, les îles bactérienne). (C) La fidélité du système de piégeage pneumatique est démontré par l'abaissement du mur PDMS (panneau de gauche) en utilisant un canal pneumatique activé (en bleu), l'introduction de teinture pourpre dans les iles fermée, et qui coule colorant jaune autour d'elle pendant 48 h. Lorsque le mur de PDMS est soulevée (à droite), la région île est exposée à la teinture jaune entoure. La barre d'échelle représente 500 um.
Figure 3: Co-culture de cellules HeLa et les bactéries. (A) image de fluorescence de la DP-exprimant EHEC et exprimant la GFP E. coli dans les BW25113 île. (B) Superposition d'transmise, vert, rouge et des images de fluorescence dans l'appareil. La barre d'échelle représente 200 um.
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Discussion
Essais classiques pour l'attachement des agents pathogènes et la colonisation d'utiliser une monocouche de cellules eucaryotes dans des plaques de culture de tissu dans lequel des agents pathogènes sont ajoutés. Ces modèles ne sont pas physiologiquement pertinents car ils n'intègrent pas un biofilm bactérien commensal développés sur les cellules eucaryotes. La simple addition d'une culture pré-cultivé des bactéries aux cellules eucaryotes est peu probable d'aboutir à cette conformation que les biofilms sont très organisés structures qui se développent au fil du temps, et il est extrêmement difficile, voire quasiment impossible, pour les cellules eucaryotes en culture de la présence de bactéries pendant de longues périodes de temps sans perte significative de viabilité. Depuis pathogènes ne sont pas naviguer à travers un biofilm commensale dans ces modèles se fixer aux cellules épithéliales, ces modèles ne reflètent pas fidèlement reproduire l'organisation des cellules épithéliales et les bactéries commensales dans le tractus gastro-intestinal. Ici, nous décrivons le développement d'un dispositif microfluidique qui utilise à commande pneumatique piégeage pour la co-culture de cellules eucaryotes et les bactéries. En utilisant des cellules HeLa comme modèle de la lignée cellulaire eucaryote et EHEC que l'agent pathogène modèle, nous montrent que le dispositif de co-culture peut garder la région des îles isolées ainsi que de soutenir la culture et le développement d'une monocouche de cellules HeLa et un commensal E. biofilm coli. La microfluidique de co-culture de modèle permet non seulement de la localisation des bactéries commensales et les cellules épithéliales, mais aussi de pré-expose aux agents pathogènes des bactéries commensales avant de rencontrer les cellules épithéliales; ce qui, présentant un environnement plus physiologiquement pertinents durant la colonisation. En outre, le modèle de co-culture peut être un outil utile pour des études fondamentales axée sur l'examen du rôle des signaux spécifiques sur l'infectiosité EHEC ainsi que pour des applications telles que le dépistage des souches probiotiques potentiels.
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Acknowledgments
Ce travail a été soutenu en partie par la National Science Foundation (EFAC 0.846.453) et le National Institutes of Health (1R01GM089999).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30002.02 | |
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| Mask aligner | Neurotronix | Q4000 | |
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
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