Summary
이 프로토콜은 상피 세포와 세균의 동시와 언어 문화 microfluidic 공동 문화 모델을 설명합니다. 이 모델은 putative probiotic 박테리아 변종의 효과를 pathogenesis에 다른 수용성 분자 신호의 역할을 조사뿐만 아니라 화면을 사용할 수 있습니다.
Abstract
인간의 위장 (GI) 트랙트는 장의 상피 세포와 비 병원성 (공생) 박테리아가 공존하는 독특한 환경입니다. 이것은 병원체가 공생 레이어에 발생하는 microenvironment가 식민지의 범위를 결정하는 중요하다고 제안되었습니다. 병원체 식민 조사를 위해 현재 문화 방법은 잘 그들은 GI 요로 microenvironment를 모방하는 방식으로 박테리아와 상피 세포의 공동 문화를 활성화하지로 가설을 조사 적합하지 않습니다. 여기 우리는 진핵 세포 및 박테리아의 독립적인 문화를 수있는 microfluidic 공동 문화 모델을 설명하고, 병원체 식민지에 공생 microenvironment의 효과를 테스트. 공동 문화 모델은 공생을 개발하여 증명
Protocol
1. 표준 SU - 8 석판술 1을 (이 동영상에 표시되지 않습니다)를 사용하여 실리콘 마스터의 제작.
- SU - 8 "마스터"(SU - 8 2050, MicroChem, 뉴턴, MA) 청정실에서 다른 구성 요소를 (서로 다른 두께의 PDMS의 점막, 공동 문화 챔버) fabricating하십시오.을 만들 표준 SU - 8 석판술 방법을 사용하여 이러한 마스터 금형은 모든 microfabrication 시설 (; 예를 들어, 스탠포드 Microfluidics 주조에서 가공 수 있습니다 http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
- 이전 PDMS의 복제, 마스터에서 PDMS의 쉬운 버전을 촉진하기 위하여 진공 소스에 연결된 건조기에 플루오로 실란 수증기에 SU - 8 주인을 폭로. 종이 타월로 플루오로 실란의 드롭을 추가 한 분 진공을 적용합니다. 진공을 제거하고 플루오로 실란의 증착을위한 30 분 수 있습니다. 나중에 사용하기 위해 닫힌 용기에 SU - 8 마스터 보관하십시오.
2. 마스터이 SU - 8 PDMS의 복제 성형
- 유체 계층과 제어 계층은 SU - 8 마스터에서 PDMS의 복제 성형에 의해 만들어집니다.
- 10시 1분 WT에서 PDMS 사전 폴리머와 가교제를 섞습니다. 일시간 (또는 기포가 PDMS 혼합물에서 제거되기 전까지)에 건조기에 비율 및 데가스.
- 배양 접시에있는 SU - 8 마스터를 놓고 조심스럽게 SU - 8 마스터 위에 PDMS 혼합물을 따라줘. 다시 데가스 PDMS.
- 몰드에 주변 100μm의 균일한 PDMS의 두께를 한 분간 1200 rpm으로 금형을 스핀.
- PDMS를 치료 한 시간 PDMS 80에서 SU - 8 마스터 금형 ° C가 들어있는 배양 접시를 가열.
- 제거 치료 PDMS - 다루는 열판에서 SU - 8 마스터.
- SU - 8 마스터에서 PDMS 금형 껍질.
- 이 세균 인레츠 하나의 콘센트 하나의 공압 포트에 대한 20 게이지 날이 엔드 바늘을 사용하여 PDMS 금형 네 개의 구멍을 드릴.
3. 다층 PDMS 장치의 결합은이 장치를 세 레이어 - 메인 채널, 중앙 공기 계층, 그리고 세균에 대한 채널을 포함하는 바닥 박테리아 레이어를 포함하고 상위 레이어로 조립합니다. 아래에 설명된대로 세 개의 레이어가 모였습니다.
- 메탄올과 PDMS의 세포막을 젖은 조심스럽게 깨끗한 집게를 사용하여 SU - 8 마스터 금형에서 껍질. 테플론 시트에 플레이스 막.
- 산소 플라즈마 챔버에서 공기 막과 유체 레이어를 놓습니다. 40 초 (산소 압력이 10 sccm, RF 전력 100W)에 대한 플라즈마를 켭니다.
- 플라즈마에 노출된 후 (10 분 이내) 포셉를 사용하여 아래 PDMS 채널에 멤브레인을 맞춥니다. 멤브레인 및 PDMS 레이어에 메탄올을 추가하면 레이어 무료로 운동을하는 데 도움과 정렬이 쉬워집니다. 이 경우, 장치는 메탄올의 증기가 탈출 수 있도록 거즈의 일부에 위치합니다.
- 8 H. 80 ° C에서 열판에 정렬 PDMS 레이어 치료
- 본드로 조립 합성 PDMS 장치에 상단 채널 3.4 - 맨 아래 레이어에 공기 막에 결합 후, 단계 3.2를 반복합니다.
4. PDMS 장치를 조립 3,4
- 진핵 세포와 세균을 심는에 사용되는 입구와 출구 포트에 구멍을 드릴.
- 포트 Tygon 튜빙 (0.01 인치 OD)을 연결하고 20mL 주사기로 당겨 공압 레이어를 운영하고 있습니다.
- PDMS 모델과 산소 플라즈마 챔버에 미리 청소 유리 슬라이드를 놓습니다. 에 대한 플라즈마를 켜고 진공을 적용하지 않고 20 초 (산소 압력이 20 sccm, RF 전력 300W).
- 유리 슬라이드에 섬 벽 (PDMS) 결합 사이의 접촉을 방지하기 위해, 즉시 장치에 주사기를 연결하고 주사기를 당겨과 장소에 개최하여 진공을 적용합니다.
- 부드럽게 유리에 PDMS 모델 (2 분 이내) 누르십시오.
- 80 PDMS 장치를 치료 10 분 ° C.
5. fibronectin과 유리 표면을 처리
- 모든 포트에 Tygon 튜빙을 연결 후 15 분 동안 자외선을 쬐면 장치를 소독.
- 입력하고 채널에있는 이물질을 제거하는 채널로 살균 PBS를 흐름. 공기 방울을 제거하는 10 분 동안 흐름을 적용합니다. 공기 방울이 쉽게 때문에 가스 투과성의 PDMS을 이스케이프 처리할 수 있습니다.
- 채널에 공기 거품의 형성을 방지하기 위해 공압 채널에 색상 염료 솔루션을 채우십시오.
- 유리에 진핵 세포 시딩를 촉진하려면 장치에 fibronectin의 1 μg / ML 솔루션을 도입 37 40 분 품어 ° C.를
- 성장 미디어 1 ML과 초과 fibronectin을 씻으십시오.
6. 공생 E.의 형성 및 측정 콜리 biofilm에제도
- OD 600 M9 최소 매체의 공생 박테리아 (예 : E. 대장균 BW25113/pCM18)을 희석 폐쇄 실 / 제도에 공생 biofilm을 형성을위한 ~ 1.
- 긍정적 - 액체 압력을 적용하여 그 섬에 벽을 닫습니다. 수제 공기 - 투 - 액체 압력 변환기는 채널에 공기 방울 형성을 방지하는 데 사용됩니다.
- 공생 E. 소개 밸브와 제도에 대장균은 폐쇄하고, 박테리아는 32에서 1 시간 동안 첨부할 수 있습니다 ° C.
- 무소속의 박테리아를 씻고 12 시간 0.25mL/hr에서 희석 세균 현탁액 (OD 600 ~ 0.05)을 perfuse.
- 느슨하게 연결된 박테리아를 제거하고 진핵 세포 부착을 준비하는 신선한 DMEM 성장 매체와 biofilm을 씻어.
- 이미지 Leica TCS SP5 공촛점 레이저 스캐닝 현미경 (배녹번, IL), 그리고 IMARIS 소프트웨어 5를 사용 biofilm 아키텍처를 시각화를 사용하여 biofilm.
7. 세균성 섬들이 6-8 주변의 진핵 세포를 심는
- 5 X 10 5 세포 / ML의 시딩 밀도에 대한 DMEM 매체 조직 문화 술병과 resuspend에서 헬라 세포를 Trypsinize.
- 2 ML / Picoplus의 주사기 펌프 (하버드 Apparattus, MA)를 사용 분의 유량에있는 장치에 헬라 세포를 소개합니다. 섬의 벽이 세균성 biofilm은 헬라 세포 지역에서 분리되도록 저하되었는지 확인하십시오. 시딩의 균일 결정 수 있도록이 단계는 가벼운 현미경의 무대에서 수행되어야합니다.
- 5 % CO 2 배양기에서 37 6 H에 대한 채널 및 부화 ° C의 세포 현탁액의 움직임을 줄이기 위해 셀 콘센트 클램프.
- 무소속의 세포를 제거하는 0.5 ML / HR에서 성장 매체와 장치를 Perfuse.
- 새로고침 헬라와 공생 E.위한 DMEM 매체 대장균 매 6 시간.
8. 아일랜드와 진핵 세포에 노출에 병원성 세균 소개
- E. 준비 대장균 O157 : H7 (EHEC)가 100:1 200:1 (헬라 세포 당 EHEC의 수)의 감염의 다중성 (뫄)에서 헬라 세포를 감염 있습니다.
- 린스와 느슨하게 연결된 공생 세균을 씻어.
- 제도에 희석 EHEC 중지 (OD 600 ~ 0.1) 소개합니다.
- ° 흐름없이 6 시간 동안 5 % CO 2 배양기에서 C는 공생 biofilm에있는 신호에 노출 수 EHEC 수 있도록 37 장치를 품어.
- 6 시간 동안 헬라 세포에 공생 제도 EHEC를 노출 PDMS 벽을 리프트.
- PBS와 채널을 씻어 라이브 / 데드 키트 (L3224, Invitrogen, CA)을 사용하여 살고 죽은 세포에 대한 얼룩.
- 자이스 혈구 Axiovert 200M 형광 현미경 및 이미지 여러 위치 살고 죽은 세포의 수를 예상하고있다.
9. 대표 결과 9
GI 트랙트 감염의 이벤트 시퀀스는 헬라 세포의 monolayer과 공생 E.을 개발하여 했었습니다 콜리 biofilm 사전 헬라 세포의 감염에 공생 biofilm에 EHEC을 알아가는 겁니다. microfluidic 공동 문화 모델의 제조에 관련된 단계는 그림 1에 표시됩니다. 그림 2A의 공동 문화 장치의 3 차원 렌더링을 보여줍니다. 공동 문화 장치 진핵 세포 배양 챔버와 박테리아 섬의 두 영역은 서로 다른 색상의 염료 (세균성 섬에 대한 진핵세포 지역과 녹색 보라색)과 그림 2B에 표시됩니다. 주변 진핵세포 지역에서 세균성 문화의 영역을 분리의 가능성은 그림 2C는 색 염료를 사용하여 표시됩니다. 그림 3은 상피 세포 및 박테리아의 공동 문화 대표 결과를 보여줍니다. 그림 3A가에 의해 공생 biofilm (녹색) 섬 식민지를 보여줍니다 EHEC (적색). 그림 3B는 상피 세포와 공생 E.의 병렬 배치를 보여줍니다 박테리아 섬 EHEC과 대장균. EHEC 및 GFP 표현 공생 세균을 표현 RFP는 상피 세포에서 박테리아 섬에 고립의 가능성을 보여주는, PDMS 벽이 저하됩니다 섬의 현지 있습니다.
그림 1 : 공동 문화 모델 셀 시딩 제도. (1) PDMS 벽이 섬을 형성 저하되어 공생 박테리아는 섬에 소개하고 있으며, fibronectin은 섬에서 흘렀을 것입니다. (2) 헬라 세포는 섬 주변 지역에서 씨앗을 품고 있습니다. (3) 헬라 세포가 합류를 달성하고 공생 biofilm이 개발되면, EHEC는 섬에 소개됩니다. (4) PDMS 벽이 해제됩니다EHEC로 섬 주변 헬라 세포를 노출까지. 밸브 작동 삽입된 페이지 보여주는 세부 사항.
그림 2 : 상피 세포 및 박테리아의 공동 문화 Microfluidic 모델입니다. 상피 세포 사이에 박테리아 섬을 형성 pneumatically - actuated 트래핑 지역을 보여주는 공동 문화 장치 (A) 3 차원 연주. 각 세균의 섬 (1200 μm의 직경과 간격 1,000 μm의)는 성장 미디어를 제공하고 섬에서 낭비를 제거하는 별도의 입구와 출구가 있습니다. 다른 영역을 (상피 세포 구역, 세균 제도) 표시 색상 염료와 공동 문화 장치 (B) 현미경. (C) 공압 트래핑 시스템의 충실도는 pneumatically 활성화 채널 (파란색)를 사용하여 PDMS 벽 (왼쪽 패널) 저하 폐쇄 섬 제도에 자주색 염료를 소개하고, 48 H.에 대한 주위 노란색 염료를 흐르는으로 표시됩니다 PDMS 벽이 (오른쪽 패널)을 올랐을 때, 섬 지역은 주변의 노란색 염색에 노출됩니다. 스케일 바 500 μm의를 나타냅니다.
그림 3 : 헬라 세포 및 박테리아의 공동 문화. RFP - 표현 EHEC 및 GFP - 표현 E.의 (A) 형광 이미지 아일랜드에서 대장균 BW25113. (B) 전송의 중첩, 녹색 및 장치에 적색 형광 이미지. 스케일 바는 200 μm의를 나타냅니다.
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Discussion
병원체 첨부 파일과 식민지에 대한 기존의 assays은 병원균이 추가되어있는 조직에 문화 접시에있는 진핵 세포의 monolayer를 활용. 이러한 모델들은 진핵 세포에서 개발한 공생 박테리아 biofilm을 포함하지 않는 생리학 관련되지 않습니다. 진핵 세포에 미리 재배 세균성 문화의 간단한 또한 biofilms가 높은 시간이 지남에 따라 발전 구조를 구성하는 본 형태로 이어질 가능성이 있으며, 실질적으로 불가능하지 않을 경우 그것은 박테리아의 존재의 문화 진핵 세포로, 매우 어렵습니다 생존에 상당한 손실없이 오랜 기간 동안. 병원균은 상피 세포에 부착 이러한 모델에서 공생 biofilm을 탐색하지 않기 때문에,이 모델은 정확하게 GI 트랙트의 상피 세포와 공생 박테리아의 조직을 모방하지 않습니다. 여기서 우리는 진핵 세포 및 박테리아의 공동 문화 pneumatically 제어 트래핑을 사용하는 microfluidic 장치의 개발을 설명합니다. 모델 병원체로 모델 진핵 세포 라인과 EHEC 같은 헬라 세포를 사용하여, 우리는 공동의 문화 장치가 고립된 섬 지역을 유지뿐만 아니라 재배 및 개발 HELA 세포 monolayer와 공생 E.을 지원할 수 표시 콜리 biofilm. microfluidic 공동 문화 모델은 공생 박테리아와 상피 세포의 현지화 수뿐만 아니라, 상피 세포가 발생하기 전에 공생 세균을 병원체를 미리 노출뿐만 아니라,이를 통해, 식민지 동안 더 생리학 관련성이 높은 환경을 제시. 또한, 공동 문화 모델은 EHEC 감염에뿐만 아니라 잠재적인 probiotic 종자를 선별 같은 애플 리케이션을위한 특정 신호의 역할을 조사에 초점을 맞춘 기초 연구에 유용한 도구가 될 수 있습니다.
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Acknowledgments
이 작품은 국립 과학 재단 (CBET 0,846,453)과 국립 보건원 (1R01GM089999)에 의해 부분적으로 지원되었다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30002.02 | |
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| Mask aligner | Neurotronix | Q4000 | |
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
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