Summary
Этот протокол описывает микрожидкостных совместно культуры модель для одновременного и локализованные культуры эпителиальных клеток и бактерий. Эта модель может быть использована для исследования роли различных растворимых молекулярные сигналы на патогенез, а также экран эффективности предполагаемых пробиотические бактериальные штаммы.
Abstract
Человека желудочно-кишечного тракта (ЖКТ) является уникальной средой, в которой кишечных эпителиальных клеток и непатогенные (синантропных) бактерий сосуществовать. Было высказано предположение, что микроокружение, что возбудитель встречи в синантропных слой играет важную роль в определении степени колонизации. Современные методы исследования культуры возбудителя колонизация не очень хорошо подходит для исследования эту гипотезу, поскольку они не позволяют со-культуры бактерий и эпителиальных клеток, таким образом, что имитирует И. микроокружения-кишечного тракта. Здесь мы опишем микрожидкостных совместно культуры модель, которая позволяет независимым культура клеток эукариот и бактерий, и тестирование влияния микроокружения на синантропных возбудителя колонизации. Совместно культуры модели демонстрируют развивающиеся комменсальной
Protocol
1. Производство кремния мастеров с использованием стандартных SU-8 фотолитографии 1 (не показано в этом видео).
- Используйте стандартные SU-8 методами фотолитографии для создания СУ-8 "мастеров" (SU-8 2050 года, MicroChem, Ньютон, штат Массачусетс) для изготовления различных компонентов (PDMS мембраны различной толщины, со-культуры камеры) в чистом помещении. Такие формы мастера могут быть изготовлены в любой микротехнологий объекта (например, Стэнфордский Microfluidics Литейный; http://thebigone.stanford.edu/foundry/ ).
- До репликации PDMS, подвергать SU-8 мастеров fluorosilane пара в сушильном шкафу придает источником вакуума для облегчения выпуска PDMS от хозяина. Добавить каплю fluorosilane к бумажным полотенцем и применять вакуумные для одного мин. Снимите вакуумный и позволить 30 мин для осаждения fluorosilane. Держите SU-8 мастер в закрытом контейнере для использования в будущем.
2. Реплика формования PDMS от SU-8 мастер 2
- Жидкостный слой и слой управления, сделаны реплики формования PDMS от SU-8 хозяина.
- Смешайте PDMS предварительно полимера и сшивающего агента в 10:01 мас. соотношение и Дега в эксикаторе в течение 1 часа (или пока пузырьки воздуха удаляют из смеси PDMS).
- Место SU-8 мастером в чашке Петри и осторожно вылейте смесь PDMS поверх SU-8 хозяина. Дега PDMS снова.
- Спиновые плесень при 1200 оборотов в минуту в течение одной минуты, чтобы получить равномерную толщину PDMS около 100 мкм на плесень.
- Тепло чашке Петри содержащие PDMS и SU-8 мастер формы при 80 ° С в течение одного часа, чтобы вылечить PDMS.
- Удалить вылечить PDMS покрытые SU-8 мастера из плиты.
- Пил плесень PDMS от SU-8 хозяина.
- Просверлите четыре отверстия в форме использования PDMS 20 калибра тупой конец иглы в течение двух бактерий входов, один выход и один пневматический порт.
3. Склеивание Многослойные PDMS устройств: Это устройство монтируется с тремя слоями, верхний слой, который содержит основной канал, средний слой пневматического и нижней бактериальный слой, содержащий каналы для бактерий. Три слоя собираются, как описано ниже.
- Влажные PDMS мембран с метанолом и тщательно чистить их от SU-8 мастер формы, используя чистую щипцами. Место мембраны на лист тефлона.
- Место мембранных пневматических и жидкостный слой на плазменной камеры кислорода. Включите плазмы в течение 40 сек (давление кислорода 10 SCCM, ВЧ мощность 100 Вт).
- После контакта с плазмой, выравнивание (в течение 10 минут) мембраны на дне PDMS канал с помощью щипцов. Добавление метанола на мембране и PDMS слоев позволяет свободное перемещение слоев, и делает выравнивание проще. В этом случае устройство помещается на кусочек марли, чтобы метанола пары к бегству.
- Cure выровнены PDMS слоев на плите при температуре 80 ° С в течение 8 ч.
- После связывания пневматический мембранный на нижний слой, повторите шаги 3,2 - 3,4 для соединения верхней канал на собранном композитного устройства PDMS.
4. Сборка устройства PDMS 3,4
- Просверлите отверстия в входных и выходных портов, используемых для посева эукариотических клеток и бактерий.
- Подключите Tygon трубки (0,01 дюйма OD) в порты и эксплуатации пневматических слой, потянув с 20 мл шприца.
- Место модели PDMS и предварительно очищенное стекло в плазменной камере кислорода. Включите плазмы в течение 20 сек (давление кислорода 20 SCCM, ВЧ мощность 300 Вт) без применения вакуума.
- Для того, чтобы предотвратить контакт между островом стене (PDMS) крепление к стеклу, сразу же подключить шприца к устройству и применять вакуум, потянув шприц и удерживая его на месте.
- Аккуратно нажмите модели PDMS на стекле (в течение 2 минут).
- Cure устройство PDMS при 80 ° С в течение 10 минут.
5. Лечение стеклянной поверхности с фибронектин
- Стерилизовать устройство под действием УФ в течение 15 минут после подключения трубки к Tygon каждого порта.
- Заполнить и поток стерилизовать PBS в канал для удаления мусора в канал. Применить потока в течение 10 минут, чтобы удалить пузырьки воздуха. Пузырьки воздуха могут легко выбраться PDMS из-за его газопроницаемость.
- Заполните цветовое решение красителя в пневматических канала, чтобы предотвратить образование воздушных пузырьков в канале.
- Для облегчения посева эукариотической клетки на стекло, ввести 1 мкг / мл раствора фибронектина в устройство и инкубировать в течение 40 мин при 37 ° C.
- Вымойте избыток фибронектина с 1 мл питательной среды.
6. Формирование и измерение комменсальной Е. кишечной биопленки востровов
- Развести синантропных бактерий (например, кишечная палочка BW25113/pCM18) в M9 минимальных средах с OD 600 ~ 1 для формирования синантропных биопленки в закрытых камерах / островами.
- Закрыть острове стены с применением положительного давления жидкости. Домашний воздух-жидкость давления преобразователь используется для предотвращения образования пузырьков воздуха в канале.
- Ввести комменсальной Е. кишечной на острова с клапан закрыт, и позволяют бактериям придают течение 1 часа при 32 ° C.
- Вымойте одиноких бактерий и заливать разбавленный бактериальной суспензии (OD 600 ~ 0,05) в 0.25mL/hr течение 12 часов.
- Промыть биопленки со свежими питательной среды DMEM, чтобы удалить слабо прилагается бактерий и эукариот подготовиться к привязанности клетки.
- Изображение биопленки использовании Leica TCS SP5 конфокальной лазерной сканирующей микроскопии (Bannockburn, IL) и визуализировать биопленки архитектуры с использованием программного обеспечения IMARIS 5.
7. Посев эукариотических клеток вокруг бактериальных острова 6-8
- Trypsinize HeLa клетки из ткани колбу культуры и ресуспендируют в DMEM средств массовой информации для посева плотность 5 х 10 5 клеток / мл.
- Ввести HeLa клетки в устройство на скорости потока 2 мл / мин с помощью насоса Picoplus шприц (Гарвардский Apparattus, MA). Убедитесь, что остров стене опускается так, что бактериальные биопленки является отдельным от региона ячейки HeLa. Этот шаг должен быть выполнен на сцене световой микроскоп, так что равномерность посева может быть определена.
- Зажим ячейки выход к снижению движение суспензии клеток в канале и инкубировать в течение 6 ч при 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора.
- Заливать устройство с ростовой среде на уровне 0,5 мл / ч, чтобы удалить одиноких клеток.
- Обновить DMEM средств массовой информации для HeLa и синантропных Е. кишечной каждые 6 часов.
8. Введение патогенных бактерий на остров и воздействия эукариотических клеток
- Подготовка Е. палочки O157: H7 (EHEC) для заражения клетки HeLa при множественности заражения (МВД) 100:1 200:1 (количество EHEC на клетку HeLa).
- Промыть и промыть слабо прилагается синантропных бактерий.
- Ввести разбавленный EHEC подвеска (OD 600 ~ 0,1) на островах.
- Инкубируйте устройство при температуре 37 ° С в 5% СО 2 инкубатора в течение 6 часов без потока, чтобы EHEC подвергаться сигналы присутствуют в синантропных биопленки.
- Поднимите PDMS стене подвергать EHEC в синантропных островов HeLa клетки в течение 6 часов.
- Промойте канал PBS и пятна для живых и мертвых клеток, используя Live / Мертвые комплектом (L3224, Invitrogen, Калифорния).
- Изображение нескольких местах на Zeiss Axiovert 200M флуоресцентного микроскопа и оценить количество живых и мертвых клеток.
9. Представитель Результаты 9
Последовательность событий при инфекциях желудочно-кишечного тракта была передразнил путем разработки монослоя клеток HeLa и синантропных Е. биопленки палочка и подвергая EHEC в синантропных биопленки до заражения клеток HeLa. Этапы изготовления микрожидкостных совместно культуры модели показаны на рисунке 1. Рисунок 2А показывает, 3-мерные оказание со-культуры устройства. Двух регионах в совместной культуре устройство эукариотических камеры культуре клеток и бактериальной острова показаны на рисунке 2B с различными красителями цвета (фиолетовый для эукариотических регионов и зеленый для бактериальных остров). Возможность выделения бактериальной культуры из регионов окружающих эукариотических область показана на рис 2С с помощью цвета красителей. На рисунке 3 показана репрезентативные результаты от совместного культуры эпителиальных клеток и бактерий. Рис.3 показана колонизация комменсальной биопленки (зеленый) острова EHEC (красный). Рис 3B показывает сопоставление эпителиальных клеток и синантропных Е. палочка с EHEC в бактериальной острова. RFP выражения EHEC и GFP выражения синантропных бактерий локализуются на острове, когда PDMS стене опускается, иллюстрирующие возможности выделения бактериальных остров из эпителиальных клеток.
Рисунок 1: Сотовый посева схемы совместного культуры модели. (1) PDMS стена опускается на форму острова, синантропных бактерий вводятся в остров, и фибронектин текла по всему острову. (2) HeLa клетки высевают в регионах, окружающих остров. (3) После HeLa клетки достигают слияния и синантропных биопленки сложилось, EHEC вводится в остров. (4) PDMS стеной поднимаетсядо подвергать HeLa клеток, окружающих остров, чтобы EHEC. Вставка детали показы клапана.
Рисунок 2: микрожидкостных моделью для сотрудничества культуре эпителиальных клеток и бактерий. () Трехмерный исполнение совместного культуре устройство показывает пневматическим приводом захвата регионов для формирования бактериальной островах среди эпителиальных клеток. Каждая бактериальная острове (1200 мкм и диаметром 1000 мкм друг от друга) имеет отдельный вход и выход для обеспечения питательной среды и удаления отходов с острова. (B) Микрофотография со-культуры устройства с цветными красителями с указанием различных регионах (эпителиальные зоне клетки, бактериальная острова). (C) точность системы захвата пневматического показывает снижение PDMS стене (слева) с использованием пневматического активированного канала (синие), представляя пурпурной краски в закрытом острова остров, и течет желтая краска вокруг него в течение 48 ч. Когда PDMS стены поднимается (справа), регион острова подвергается воздействию окружающей желтый краситель. Шкала бар представляет 500 мкм.
Рисунок 3: Со-культуре клеток HeLa и бактерий. (А) Флуоресценция образ RFP, экспрессирующих EHEC и GFP-выражения E. кишечной BW25113 в остров. (В) Наложение передается, зеленый и красный флуоресцентные изображения в устройстве. Шкала бар представляет 200 мкм.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Обычные анализы для возбудителя привязанности и колонизации использовать монослоя клеток эукариот в виде пластин культуры тканей, в которые добавляются патогенные. Эти модели не соответствующих физиологически так как они не включают бактериальные биопленки комменсальной разработан на эукариотических клеток. Простое добавление предварительно выращенные бактериальной культуры для эукариотических клеток вряд ли приведет к этой конформации как биопленки высокоорганизованные структуры, которые развиваются с течением времени, и это чрезвычайно трудно, если вообще практически невозможно, к культуре эукариотических клеток в присутствии бактерий в течение длительных периодов времени без существенной потери в жизнеспособности. Так как возбудители не перемещаться по комменсальной биопленки в этих моделях для подключения к эпителиальных клеток, эти модели не точно имитировать организации эпителиальных клеток и синантропных бактерий в желудочно-кишечном тракте. Здесь мы опишем развитие микрожидкостных устройство, которое использует пневматически контролируемого захвата для совместной культуре клеток эукариот и бактерий. Использование HeLa клетки как модель эукариотической клеточной линии и EHEC как модель патогена, мы покажем, что со-культуре устройство может держать остров регион изолирован, а также поддержку выращивания и развития монослоя ячейки HeLa и синантропных Е. кишечной биопленки. Микрожидкостных совместно культуры модель не только дает возможность локализации синантропных бактерий и эпителиальных клеток, но и предварительно выставляет патогенных бактерий синантропных до встречи эпителиальных клеток, тем самым, представляя более физиологически соответствующую окружающую среду во время колонизации. Кроме того, совместно культуры модель может быть полезным инструментом для фундаментальных исследований, посвященных изучению роли конкретных сигналов на EHEC инфекционности, а также для таких приложений, как скрининг потенциальных пробиотических штаммов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа была выполнена при частичной поддержке Национального научного фонда (конбет 0846453) и Национального института здоровья (1R01GM089999).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| SU-8 2050 | MicroChem Corp. | ||
| high-resolution (16,256 dpi) photolithography mask | Fineline-Imaging Inc, CO | ||
| Trichloro(3,3,4,4,5,5,6,6,7,7,8,8,8-tridecafluorooctyl)silane | Sigma-Aldrich | 77279 | |
| PDMS | Dow Corning | 184 SIL ELAST KIT 0.5KG | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific, Inc. | SH30002.02 | |
| Programmable spin coater | Laurell Tech Corp | WS0650S | |
| Mask aligner | Neurotronix | Q4000 | |
| Oxygen plasma etcher | March Plasma System, CA | CS-1701 | |
| Syringe pump | Harvard Apparatus | ||
| Live/Dead Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen | L-3224 |
References
- McDonald, J. C. Prototyping of microfluidic devices in poly(dimethylsiloxane) using solid-object printing. Anal Chem. 74, 1537-1545 (2002).
- Jeon, N. L. Design and fabrication of integrated passive valves and pumps for flexible polymer 3-dimensional microfluidic systems. Biomed Microdevices. 4, 117-121 (2002).
- Baek, J. Y., Park, J. Y., Ju, J. I., Lee, T. S., Lee, S. H. A pneumatically controllable flexible and polymeric microfluidic valve fabricated via in situ development. J Micromech Microeng. 15, 1015-1020 (2005).
- Grover, W. H., Ivester, R. H., Jensen, E. C., Mathies, R. A., A, R. Development and multiplexed control of latching pneumatic valves using microfluidic logical structures. Lab Chip. 6, 623-631 (2006).
- Lee, J., Jayaraman, A., Wood, T. K., K, T. Indole is an inter-species biofilm signal mediated by SdiA. BMC Microbiol. 7, 42-42 (2007).
- Hsu, C. H., Folch, A. Microfluidic devices with tunable topographies. Appl Phys Lett. 86, 023508-023508 (2005).
- Hui, E. E., Bhatia, S. N.
- Lee, J. Y. Integrating sensing hydrogel microstructures into micropatterned hepatocellular cocultures. Langmuir. 25, 3880-3886 (2009).
- Kim, J., Hegde, M., Jayaraman, A. Co-culture of epithelial cells and bacteria for investigating host-pathogen interactions. Lab-on-Chip. , (2009).
