Summary
13 सी आइसोटोप लेबलिंग सूक्ष्मजीवों के विभिन्न प्रकार के लिए सेल चयापचय केंद्रीय निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है. बाद कोशिकाओं एक विशिष्ट लेबल सब्सट्रेट के साथ संवर्धित किया गया है, जीसी - एमएस माप कार्यात्मक चयापचय proteinogenic अमीनो एसिड में अद्वितीय लेबलिंग पैटर्न पर आधारित रास्ते प्रकट कर सकते हैं.
Protocol
1. सेल संस्कृति (चित्रा 1)
- न्यूनतम माध्यम तत्वों का पता लगाने, लवण, विटामिन, और विशेष रूप से लेबल कार्बन substrates कि मार्ग की जांच के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं के साथ कोशिकाओं को विकसित. सेल संस्कृति के लिए या तो मिलाते बोतल या बायोरिएक्टर का प्रयोग करें. खमीर निकालने के रूप में कार्बनिक पोषक तत्वों, एमिनो एसिड लेबलिंग के माप के साथ हस्तक्षेप नहीं है और इस तरह मध्यम संस्कृति में मौजूद नहीं किया जा सकता है हो सकता है.
- एक इष्टतम तरंग दैर्ध्य (उदाहरण के लिए, 51142 आयुध डिपो के लिए 730 Cyanothece) में एक यूवी / विज़ स्पेक्ट्रोफोटोमीटर के साथ संस्कृति के ऑप्टिकल घनत्व सेल के विकास मॉनिटर .
- कक्ष पहली बार एक गैर लेबल मध्यम में उगाया जा सकता है. मध्यम लॉग विकास के चरण कोशिकाओं लेबल मध्यम के टीका (मात्रा टीका अनुपात द्वारा 3% (v / v)) के लिए इस्तेमाल किया जा पसंद कर रहे हैं. लेबल उप सभ्य संस्कृति एक ही लेबल माध्यम प्रारंभिक inoculum से गैर लेबल कार्बन की शुरूआत से बचने में (3% v / v टीका अनुपात) किया जाना चाहिए.
- हार्वेस्ट मध्यम लॉग centrifugation (10 मिनट, 8000 × छ) द्वारा विकास के चरण में उप संवर्धित कोशिकाओं (10ml).
- 6M एचसीएल के 1.5mL में गोली Resuspend और यह एक स्पष्ट गिलास, पेंच टॉप जीसी शीशी को हस्तांतरण. शीशियों कैप और उन्हें एक 100 ° सी ओवन में 24 घंटे के लिए जगह के अमीनो एसिड में बायोमास प्रोटीन hydrolyze. बायोमास छर्रों की hydrolysis 16 20 आम अमीनो एसिड (चित्रा 2) 5 की उपज कर सकते हैं. Cysteine और tryptophan अपमानित कर रहे हैं, और glutamine और asparagine ग्लूटामेट और aspartate, क्रमशः के लिए परिवर्तित कर रहे हैं.
- 5 2 मिलीलीटर Eppendorf ट्यूबों का उपयोग मिनट के लिए पर 20,000 एमिनो एसिड समाधान × छ अपकेंद्रित्र, और नए जीसी शीशियों supernatants हस्तांतरण. यह कदम hydrolysis समाधान में ठोस कणों को हटा.
- जीसी शीशी lids निकालें और नमूने थर्मो वैज्ञानिक Reacti VAP (बाष्पीकरण नोट का उपयोग कर हवा की एक धारा के तहत पूरी तरह से सूखे: एक फ्रीज सुखाने की मशीन भी टी में इस्तेमाल किया जा सकता हैओ सूखी नमूने). यह कदम रातोंरात किया जा सकता है.
3. एमिनो एसिड derivatization और शर्तों जीसी - एमएस
अमीनो एसिड या जीसी के माध्यम से चार्ज / अत्यधिक ध्रुवीय चयापचयों का विश्लेषण की आवश्यकता है कि इन चयापचयों derivatized हो सकता है, ताकि एमिनो एसिड अस्थिर कर रहे हैं और गैस क्रोमैटोग्राफी 2 के द्वारा अलग किया जा सकता है.
- Tetrahydrofuran के 150 μL (THF) और एन (tert - butyldimethylsilyl) एन methyltrifluoroacetamide derivatization अभिकर्मक के 150 μL के साथ सूखे नमूने भंग.
- एक ओवन या ° 1 घंटे के लिए सी 65 और 80 के बीच एक पानी के स्नान में सभी नमूनों को सेते हैं. कभी कभी भंवर को यकीन है कि शीशी में चयापचयों भंग कर रहे हैं.
- +२०,००० × छ पर 10 मिनट के लिए नमूने, अपकेंद्रित्र और तब नया जीसी शीशियों के लिए सतह पर तैरनेवाला हस्तांतरण. सतह पर तैरनेवाला एक स्पष्ट और पीले रंग के समाधान होना चाहिए. डिटेक्टरों की संतृप्ति के कारण, जीसी - एमएस माप सटीकता उच्च conce से प्रभावित किया जा सकता है हैइंजेक्शन TBDMS derivatized अमीनो एसिड (इन नमूनों अक्सर गहरे भूरे रंग से पता चलता है) ntration, इसलिए हम इन जीसी - एमएस माप से पहले 6 THF का उपयोग करने के नमूने पतला होना चाहिए.
- जीसी - एमएस (1:05 या 1:10 विभाजन अनुपात, इंजेक्शन की मात्रा का उपयोग = 1 μL, वाहक गैस हीलियम = 1.2 एमएल / मिनट). नमूनों का विश्लेषण निम्नलिखित जीसी तापमान प्रोग्राम का उपयोग करें: 150 पर पकड़ · सी 2 मिनट के लिए, 3 पर वृद्धि ° C 280 न्यूनतम प्रति डिग्री सेल्सियस, 20 में वृद्धि सी मिनट प्रति 300 डिग्री सेल्सियस, और फिर 5 मिनट के लिए पकड़ °. सॉल्वेंट देरी ~ 5 मिनट (30 मीटर जीसी स्तंभ के लिए) के रूप में सेट किया जा सकता है. 60 और 500 के बीच एमएस में अनुपात (मी / z) प्रभारी जन की सीमा सेट किया जा सकता है.
4. जीसी - एमएस डेटा विश्लेषण
- TBDMS derivatized एमिनो एसिड माप भी जीसी जुदाई में आइसोटोप भेदभाव से प्रभावित किया जा सकता है. लाइट आइसोटोप थोड़ा तेजी से स्थानांतरित करने की तुलना में जीसी स्तंभ में आइसोटोप उसांस. संभावित माप पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, हम पूरी की बड़े पैमाने पर स्पेक्ट्रम औसत सकती हैएमिनो एसिड चोटी 6 रेंज
- जीसी और एमएस TBDMS derivatized चयापचयों का स्पेक्ट्रा 7 से पहले सूचित किया गया है. जीसी प्रतिधारण और प्रत्येक अमीनो एसिड के लिए समय अद्वितीय मी / z चोटियों 3 चित्र में सचित्र हैं.
- अमीनो एसिड या केंद्रीय चयापचयों Derivatization स्वाभाविक रूप से लेबल आइसोटोप के महत्वपूर्ण मात्रा में 13 सी (1.13%), 18 हे (0.20%), 29 सी (4.70%), और 30 सी (3.09%) का परिचय है. कच्चे जन isotopomer स्पेक्ट्रम में प्राकृतिक आइसोटोप से माप शोर प्रकाशित 5 सॉफ्टवेयर, 8 का उपयोग करके ठीक किया जा सकता है. अंतिम समस्थानिक लेबलिंग डेटा जन भिन्न, उदाहरण के लिए, एम 0, एम 1, एम 2, एम 3 और 4 एम के रूप में रिपोर्ट कर रहे हैं (शून्य से चार 13 सी लेबल कार्बन युक्त टुकड़े का प्रतिनिधित्व).
- 2-oxo - glutar: अमीनो एसिड के मापन आठ महत्वपूर्ण अग्रदूत चयापचयों के बारे में समस्थानिक लेबलिंग जानकारी प्रदान कर सकते हैंखाया, 3 - पी ग्लिसरेट, acetyl-CoA, erythrose-4-पी, oxaloacetate, phosphoenolpyruvate, पाइरूवेट, और ribose-5-P. इन चयापचयों में लेबलिंग पैटर्न कई केंद्रीय चयापचय रास्ते (चित्रा 2) 9 की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. लेबलिंग प्रयोगों के परिणाम और अन्य जैव रसायन तरीकों का उपयोग कर (जैसे, RT-पीसीआर) की पुष्टि कर सकते हैं.
5. मार्ग अमीनो एसिड डेटा लेबल का उपयोग विश्लेषण
केवल कुछ प्रमुख अमीनो अच्छी तरह से डिजाइन 13 सी ट्रेसर प्रयोगों से उत्पादित एसिड की जांच करके, हम परिष्कृत 13 सी चयापचय पूरे केंद्रीय चयापचय के प्रवाह विश्लेषण प्रदर्शन के बिना कई अनूठी रास्ते या एंजाइम की गतिविधियों को बता सकते हैं.
- Entner - Doudoroff मार्ग: [1 - 13 सी] ग्लूकोज कार्बन स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है . यदि मार्ग में सक्रिय है, सेरीन लेबलिंग 10 alanine में लेबलिंग की तुलना में काफी कम हो जाएगा.
- शाखित TCA चक्र: [1 - 13 सी]पाइरूवेट कार्बन स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि TCA चक्र टूट गया है, aspartate दो कार्बन द्वारा लेबल किया जा सकता है, जबकि ग्लूटामेट केवल एक 11 कार्बन, 12 के साथ लेबल है .
- एक mixotrophic चयापचय में सीओ 2 केल्विन बेन्सन - Bassham चक्र से निर्धारण: सीओ 2 गैर - लेबल और कार्बन substrates के लेबल दोनों कार्बन स्रोत के रूप में उपयोग किया जाता है. यदि केल्विन चक्र कार्यात्मक है, सेरीन और हिस्टडीन लेबलिंग काफी पतला अन्य अमीनो एसिड की तुलना में. ऐसी विधि रिश्तेदार सीओ 2 निर्धारण निर्धारित कर सकते हैं जब कार्बनिक कार्बन स्रोतों मध्यम 13 में मौजूद हैं.
- Oxidative pentose फॉस्फेट मार्ग: [1 - 13 सी] ग्लूकोज कार्बन स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है . यदि मार्ग सक्रिय है, गैर लेबल alanine> 50 12% हो जाएगा.
- Anaplerotic (जैसे, पीईपी + सीओ 2 à oxaloacetate) मार्ग: 13 सीओ 2 और गैर लेबल कार्बन (substrates जैसे, ग्लिसरॉल, या pyruvate) कार्बन स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है. यदि मार्ग में सक्रिय है, aspartate लेबलिंग काफी समृद्ध हो सकता है, 13 सेरीन alanine और तुलना.
- पुनः साइट्रेट synthase: [1 - 13 सी] पाइरूवेट कार्बन स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है . यदि एंजाइम सक्रिय है, ग्लूटामेट β carboxyl समूह 3, 4 में लेबल है.
- Citramalate मार्ग: [1 - 13 सी] पाइरूवेट, [2 - 13 सी] ग्लिसरॉल, या [1 - 13 सी] एसीटेट कार्बन स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है . यदि मार्ग में सक्रिय है, leucine और isoleucine लेबलिंग मात्रा 14 समान हैं.
- सेरीन isocitrate lyase चक्र: [1 - 13 सी] पाइरूवेट या [1 - 13 सी] लैक्टेट कार्बन स्रोत के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है . यदि मार्ग में सक्रिय है, सेरीन में तीसरा स्थान कार्बन 15 लेबल किया जाएगा.
- पोषक तत्वों के उपयोग (यानी, exogenous एमिनो एसिड): पूरी तरह से लेबल कार्बन substrates और गैर लेबल अमीनो एसिड के साथ एक संस्कृति के माध्यमइस्तेमाल किया जा सकता है. यदि कोशिकाओं चुनिंदा इन पूरक गैर लेबल पोषक तत्वों का उपयोग करते हैं, हम बायोमास में इन एमिनो एसिड की महत्वपूर्ण लेबलिंग कमजोर पड़ने देखेंगे. जांच करने के लिए जो पोषक तत्वों की खुराक 16 सेल द्वारा पसंद कर रहे हैं इस पद्धति का इस्तेमाल किया जा सकता है.
6. प्रतिनिधि परिणाम
हाल ही bioenergy अध्ययन bioenergy उत्पादन के लिए उपन्यास phototrophic सूक्ष्मजीवों का उपयोग में हितों को पुनर्जीवित किया है और 2 पर कब्जा सीओ . पिछले कुछ वर्षों में काफी उन्नत 13C मेटाबोलिक फ्लक्स विश्लेषण (13C एमएफए) सहित कुछ विश्लेषण 13C-चयापचय, phototrophic बैक्टीरिया में केंद्रीय metabolisms की जांच करने के लिए किया गया आवेदन किया है, क्योंकि केंद्रीय चयापचय मार्ग के जैव रासायनिक ज्ञान अच्छी तरह से स्थापित नहीं है इन गैर मॉडल 10 जीवों, 11, 17-20 में. यहाँ, हम Cyanothece में एक वैकल्पिक isoleucine मार्ग की खोज 21 51142 का एक उदाहरण प्रस्तुत सियान.othece 51142 (4.3.1.19 चुनाव आयोग, threonine अमोनिया lyase) एंजाइम, जो ठेठ isoleucine संश्लेषण मार्ग में 2-ketobutyrate threonine के रूपांतरण catalyzes शामिल नहीं है. Isoleucine मार्ग को हल करने के लिए, हम 54 मिमी ग्लिसरॉल (2-13C, 98%>) के साथ ASP2 22 मध्यम में 51142 Cyanothece (20 एमएल) Cyanothece 51,142 बढ़ने 2 एन डी स्थिति मुख्य कार्बन स्रोत के रूप में लेबल ग्लिसरॉल का इस्तेमाल. हम निरीक्षण threonine और alanine कि एक कार्बन लेबल है, जबकि isoleucine तीन कार्बन के साथ लेबल है. इसलिए, संश्लेषण में 51142 Cyanothece threonine सबसे जीवों (चित्रा 4) द्वारा नियोजित मार्ग से प्राप्त नहीं कर सकते हैं. दूसरी ओर, leucine और isoleucine समान लेबलिंग टुकड़ा पर आधारित पैटर्न है + (एम -15) और टुकड़ा (M-159) +. उदाहरण के लिए, से isotopomer डेटा [M-15] + (unfragmented अमीनो एसिड युक्त) leucine के लिए समान लेबलिंग (M0 = 0.01 M1 = 0.03 M2, = 0.21, एम 3 = 0 दिखा0.69) और isoleucine (M0 = 0.01, एम 1 = 0.03, M2 0.24 =, = एम 3 .67). इस प्रकार leucine isoleucine और एक ही व्यापारियों (यानी, पाइरूवेट और acetyl-CoA) से संश्लेषित किया जाना चाहिए. यह अवलोकन लेबल isoleucine संश्लेषण के लिए citramalate मार्ग में कार्बन संक्रमण के साथ संगत है. इस मार्ग की पुष्टि करने के लिए, हम संयुक्त जीनोम संस्थान डेटाबेस खोज और Cyanothece में एक citramalate synthase Cima (cce_0248) की उपस्थिति जानने के.
चित्रा 1 13 सी - सहायता मार्ग विश्लेषण कदम.
चित्रा 2 एमिनो एसिड उनके चयापचय व्यापारियों की लेबलिंग पैटर्न प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल किया. ACoA, acetyl सीओए, AKG, α-ketoglutarate; C5P, ribose 5 - फॉस्फेट, सीआईटी, साइट्रेट, E4P, erythrose 4 फॉस्फेट; G6P, ग्लूकोज 6 फॉस्फेट; OAA oxaloacetate, पीईपी, phosphoenolpyruvate, पीजीए, 3 - phosphoglycerate; PYR, पाइरूवेट.
चित्रा 3 16 अमीनो एसिड के लिए जीसी चोटियों . TBDMS derivatized अमीनो एसिड एमएस द्वारा दो टुकड़ों में टूट रहे हैं: + (एम -57), पूरे एमिनो एसिड युक्त, और + (M-159), जो एमिनो एसिड की α carboxyl समूह का अभाव है. + Leucine और isoleucine, के लिए (M-57) अन्य जन चोटियों से छा गया था. हम टुकड़ा (एम 15) + का उपयोग करने के लिए पूरे अमीनो एसिड लेबलिंग का विश्लेषण के सुझाव देते हैं. (F302) + समूह सबसे अमीनो एसिड में पाया जाता है, जिसमें केवल प्रथम एक एमिनो एसिड रीढ़ की हड्डी में और (α-carboxyl समूह) दूसरा कार्बन. क्योंकि यह एमएस शिखर अक्सर उच्च अनुपात शोर करने के लिए संकेत है, (f302) + मात्रात्मक चयापचय 7 अपशिष्टों का विश्लेषण करने के लिए अनुशंसित नहीं है.
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चित्रा 4 isoleucine रास्ते में 51142 Cyanothece (हमारे पिछले कागज से संशोधित) 21 में बदलाव लेबल.
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Discussion
इस प्रोटोकॉल लेबल एक सब्सट्रेट के साथ सेल खिला और जीसी - एमएस के माध्यम से अमीनो एसिड में जिसके परिणामस्वरूप समस्थानिक लेबलिंग पैटर्न को मापने के होते हैं. एमएस डेटा (के अनुपात / मीटर z) के बाद से सिर्फ एमएस आयनों की लेबलिंग के समग्र राशि दे, हम दोनों unfragmented + (एम 57) मी / z अनुपात और खंडित अमीनो एसिड का परीक्षण करके एमिनो एसिड की isotopomer वितरण का आकलन है (यानी, + (M-159) और (f302) +). इसके अलावा, हम एक रासायनिक समान मध्यम लेकिन substrates कि विभिन्न लेबलिंग पैटर्न (1 सेंट स्थिति लेबल, 2 एन डी लेबल की स्थिति, आदि) के साथ कई सेल संस्कृतियों का प्रदर्शन कर सकते हैं. इन प्रयोगों से चयापचयों के बारे में जानकारी लेबलिंग केंद्रीय चयापचय मार्ग के माध्यम से वास्तविक कार्बन संक्रमण मार्गों व्याख्या करने के लिए एकीकृत किया जा सकता है.
मार्ग विश्लेषण के लिए, एक लेबल सब्सट्रेट के चुनाव महत्वपूर्ण है. सामान्य में, अकेले कार्बन substrates के लेबल ईएएस हैंier लेबल कार्बन के भाग्य का पता लगाने में उपयोग करने के लिए जब केंद्रीय रास्ते के माध्यम से 13 सी percolates, जबकि एकाधिक कार्बन substrates कर सकते हैं उलझाना कार्बन अनुरेखण लेबल . इसके अलावा, अकेले लेबल substrates के समान लेबल substrates तुलना में अधिक चयापचयों में अद्वितीय अणु संरचनाओं स्पष्ट जानकारीपूर्ण हैं 4 उदाहरण के लिए, (रे) प्रकार साइट्रेट synthase सामान्य साइट्रेट synthase से अलग प्रतिक्रिया त्रिविम दिखाता है, और इस प्रकार साइट्रेट कारणों के लिए अलग अलग आणविक दाहिनी ओर है . दूसरी ओर, substrates उनकी उपयुक्तता में अलग करने के लिए अपने रास्ते का पता लगाने जुड़े हैं. ग्लूकोज ग्लाइकोलाइसिस और pentose फॉस्फेट रास्ते के बीच विभाजन अनुपात का पता लगाने के लिए सबसे अच्छा है, जबकि पाइरूवेट या एसीटेट TCA चक्र और कुछ एमिनो एसिड रास्ते का विश्लेषण करने के लिए सबसे अच्छा कर रहे हैं. इसलिए, यह अलग substrates का उपयोग करने के लिए सेल metabolisms की समग्र तस्वीर की जांच करने के लिए आवश्यक है.
13 सी - आइसोटोपलेबलिंग सूक्ष्मजीवों में कार्यात्मक रास्ते का निर्धारण करने के लिए एक उपयोगी तकनीक है. हालांकि, इस तकनीक कई सीमाएं सबसे पहले है. केवल कार्बन चयापचय के विश्लेषण कार्बनिक substrates का उपयोग के लिए अनुकूल है, के रूप में इसे सीधे स्वपोषी metabolisms में चयापचय को हल नहीं अगर सीओ 2 एकमात्र कार्बन स्रोत के रूप में प्रयोग किया जाता है सकते हैं. स्वपोषी 12 इनपुट सीओ सीओ 2 / 13 2 23 मिश्रण के रूप में सीओ 2 लेबल सभी अमीनो एसिड का उपयोग उसी हद तक संस्कृतियों. यह मार्ग विश्लेषण कठिन बना देता है है, के रूप में चयापचय विश्लेषण के लिए चयापचयों में 13 सी कार्बन की पुनर्व्यवस्था से अलग चयापचय मार्ग द्वारा inferred किया जा दूसरा है. इस पत्र केवल गुणात्मक "सक्रिय" और "गैर - सक्रिय" रास्ते के बीच भेदभाव परिणाम प्रस्तुत करता है. चयापचय की सटीक मात्रा का ठहराव एक परिष्कृत मॉडलिंग दृष्टिकोण की आवश्यकता है (यानी,
अंत में हर साल, गैर मॉडल माइक्रोबियल प्रजातियों के लिए जीनोम अनुक्रम के एक बढ़ती हुई संख्या प्रकाशित किया जा रहा है. हालांकि, इन प्रजातियों के कार्यात्मक विशेषताओं जीनोमिक अनुक्रमण की गति बहुत पीछे lagged है 13 सी लेबलिंग दृष्टिकोण और कई गैर मॉडल जीवों में चयापचय मार्ग की पुष्टि की खोज में महत्वपूर्ण भूमिका निभा सकते हैं. . इसके अलावा, लेबलिंग जानकारी को समझने पूर्ण कार्बन अपशिष्टों के लिए चयापचय 25 सूक्ष्मजीवों में मॉडलिंग (13 सी - एमएफए) के साथ एकीकृत किया जा सकता है. इसलिए, इस तकनीक का व्यापक रूप से जैव ईंधन के लिए संबंधित जैविक प्रणालियों का विश्लेषण करने में इस्तेमाल किया जा सकता है, ecologराजनैतिक और चिकित्सा अनुप्रयोगों.
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Disclosures
ब्याज की कोई संघर्ष की घोषणा की.
Acknowledgments
इस अध्ययन से एक NSF कैरियर (MCB0954016) अनुदान और एक डो Bioenergy अनुसंधान अनुदान (DEFG0208ER64694) द्वारा समर्थित किया गया.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | - |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865 | - |
| Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
| Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | - |
| GC Columns | J&W Scientific | DB5 (30m) | - |
| Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | - |
| Reacti-Vap Evaporator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TS-18825 | For drying amino acid samples |
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