Metabolsk Pathway Bekreftelse og Discovery Through ¹³ C-merking av Proteinogenic Amino Acids

Summary

¹³ C-isotopen merking er en nyttig teknikk for å bestemme cellen sentrale metabolisme for ulike typer av mikroorganismer. Etter at cellene har vært dyrket med en bestemt merket substrat, kan GC-MS måling avdekker funksjonelle metabolismeveier basert på unike merking mønstre i proteinogenic aminosyrer.

Abstract

Mikrober har komplekse metabolske veier som kan undersøkes ved hjelp av biokjemi og funksjonell genomikk metoder. En viktig teknikk for å undersøke celle sentrale metabolisme og oppdage nye enzymer er ¹³ C-assistert metabolisme analyse 1. Denne teknikken er basert på isotop-merking, hvor mikrobene blir matet med en ¹³ C-merket underlag. Ved å spore atom overgangen stier mellom metabolitter i biokjemiske nettverket, kan vi fastslå funksjonell stier og oppdage nye enzymer.

Som en komplementær metode for å transcriptomics og proteomikk, tilnærminger for isotopomer-assistert analyse av metabolske veier inneholder tre viktige trinn ^to. Først vokser vi celler med ¹³ C merket underlag. I dette trinnet, sammensetningen av mediet og utvalget av merket substrater er to viktige faktorer. For å unngå måling støy fra ikke-merket karbon i nærings kosttilskudd, Er en minimal medium med en eneste karbonkilde nødvendig. Videre er valget av en merket substrat basert på hvor effektivt det vil belyse veien blir analysert. Fordi romanen enzymer ofte innebære annen reaksjon stereokjemi eller mellomprodukter, generelt, enkeltvis merket karbon underlag er mer informative for påvisning av nye veier enn jevnt merket kodekene for påvisning av nye veier ^{3, 4.} Second, analyserer vi aminosyre merking mønstre ved hjelp av GC -MS. Aminosyrer er rik på protein, og dermed kan fås fra biomasse hydrolyse. Aminosyrer kan derivatized av N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide (TBDMS) før GC separasjon. TBDMS derivatized aminosyrer kan bli fragmentert av MS og resultere i ulike matriser av fragmenter. Basert på masse for å lade (m / z) forholdet fragmentert og ufragmentert aminosyrer, kan vi utlede den mulige merket mønstre av de sentrale metabolitter somforløperne til aminosyrer. tredje spor vi 13C karbon overganger i den foreslåtte stier og, basert på isotopomer data, bekrefte om disse banene er aktive ^2. Måling av aminosyrer gir isotopiske merking informasjon rundt åtte avgjørende forløper metabolitter i sentrale metabolisme. Disse metabolske viktige noder kan reflektere funksjonene tilhørende sentrale veier.

¹³ C-assistert metabolisme analyse via proteinogenic aminosyrer kan bli mye brukt for funksjonell karakterisering av dårlig karakterisert mikrobiell metabolisme ^1. I denne protokollen, vil vi bruke Cyanothece 51142 som modell påkjenning å demonstrere bruk av merket karbon underlag for å oppdage nye enzymatisk funksjoner.

Protocol

1. Cellekultur (Figur 1)

1. Grow celler i minimal medium med sporstoffer, salter, vitaminer og spesielt merket karbon underlag som er best for pathway etterforskning. Bruk enten risting flasker eller bioreaktorer for cellekultur. Organiske næringsstoffer, slik som gjærekstrakt, kan forstyrre målingen av aminosyren merking og kan derfor ikke være til stede i kulturen medium.
2. Monitor cellevekst ved den optiske tettheten av kulturen på en optimal bølgelengde (f.eks OD ₇₃₀ for Cyanothece 51142) med en UV / VIS spektrofotometer.
3. Celler kan først dyrket i et ikke-merket medium. Den midterste-log vekstfase celler blir foretrukket skal brukes til poding (3% (v / v) etter volum poding ratio) av merket medium. Det merket kulturen bør være sub-dyrkes (3% v / v inokulasjon ratio) i samme merket medium for å unngå innføring av non-merket karbon fra den innledende podestoff.

1. Høste sub-dyrkede celler (10ml) i midten-log vekstfase ved sentrifugering (10 min, 8000 × g).
2. Resuspender pellet i 1.5mL av 6M HCl og overføre den til et klart glass, skrue-top GC hetteglass. Cap hetteglassene og plassere dem i en 100 ° C ovn i 24 timer for å hydrolyze biomassen proteiner til aminosyrer. Hydrolyse av biomasse pellets kan gi 16 av de 20 vanlige aminosyrer (Figur 2) ^5. Cystein og tryptofan er degradert, og glutamin og asparagin omdannes til glutamat og aspartat, henholdsvis.
3. Sentrifuger aminosyre løsning ved 20.000 × g for 5 min med 2 ml Eppendorf-rør, og overføre supernatants til nye GC hetteglass. Dette trinnet fjerner partikler i hydrolyse løsningen.
4. Fjern GC hetteglass lokkene og tørke prøvene helt under en strøm av luft ved hjelp av en Thermo Scientific Reacti-VAP fordamperen (merk: en fryse tørketrommel kan også brukes to tørre prøver). Dette trinnet kan gjøres over natten.

3. Aminosyre derivatisering og GC-MS forhold

Analyse av aminosyrer eller siktet / svært polare metabolitter via GC krever at disse metabolittene være derivatized, slik at aminosyrer er flyktige og kan separeres ved gasskromatografi ^2.

1. Oppløse tørket prøvene med 150 mL av tetrahydrofuran (THF) og 150 mL av N-(tert-butyldimethylsilyl)-N-methyltrifluoroacetamide derivatisering reagens.
2. Inkuber alle prøvene i en ovn eller et vannbad mellom 65 og 80 ° C i 1 time. Vortex innimellom for å sørge for at metabolitter i hetteglasset er oppløst.
3. Sentrifuger prøver ved 20.000 × g for 10 min, og deretter overføre supernatanten til nye GC hetteglass. Supernatanten bør være en klar og gulaktig løsning. På grunn av metning av detektorer, kan GC-MS målenøyaktigheten bli påvirket av den høye concentration av injisert TBDMS derivatized aminosyrer (disse prøvene ofte viser mørk brun farge), derfor bør vi fortynne disse prøvene bruker THF før GC-MS måling ^seks.
4. Analysere prøvene av GC-MS (bruk en 1:05 eller 1:10 Delingsforholdet, injeksjonsvolum = 1 mL, bæregass helium = 1,2 ml / min). Bruk følgende GC temperatur program: hold ved 150 ° C i 2 minutter, øk på 3 ° C per min til 280 ° C, øker ved 20 ° C per min til 300 ° C, og deretter holde i 5 minutter. Solvent forsinkelse kan settes som ~ 5 min (for en 30 meter GC kolonne). Utvalget av massen til å belaste ratio (m / z) i MS kan settes mellom 60 og 500.

Fire. GC-MS dataanalyse

1. TBDMS derivatized aminosyre måling kan også bli påvirket av isotop diskriminering i GC separasjon. Lys isotoper flytte litt raskere enn heave isotoper i GC kolonne. For å redusere den potensielle måling bias, kan vi gjennomsnittlig massen spekteret av heleaminosyre peak Range ⁶
2. GC og MS spektra av TBDMS derivatized metabolitter har blitt rapportert før ^7. GC oppholdstid og den unike m / z topper for hver aminosyre er illustrert i figur 3.
3. Derivatisering av aminosyrer eller sentrale metabolitter introduserer betydelige mengder av naturlig-merkede isotoper, inkludert ¹³ C (1,13%), ¹⁸ O (0,20%), ²⁹ Si (4,70%), og ³⁰ Si (3,09%). Målingen støy fra naturlige isotoper i rå masse isotopomer spekteret kan korrigeres ved å bruke publiserte ^{5-programvaren, 8.} Den endelige isotoper merking data blir rapportert som masse brøker, f.eks ₀ M, ₁ M, M _2, M ₃ og M ₄ (som representerer fragmenter som inneholder null til fire ¹³ C merket karbonatomer).
4. Måling av aminosyrer kan gi isotopiske merking informasjon rundt åtte avgjørende forløper metabolitter: 2-oxo-glutarspiste, 3-P-glycerate, acetyl-CoA, erythrose-4-P, oxaloacetate, phosphoenolpyruvate, pyruvat, og ribose-5-P. Merkingen mønstre i disse metabolittene kan brukes til å identifisere flere sentrale stoffskifte (Figur 2) ^9. Utfallet av merking eksperimentene kan bli ytterligere bekreftet ved hjelp av andre biokjemiske metoder (f.eks RT-PCR).

5. Pathway analyse ved hjelp av merket aminosyre data

Ved å undersøke bare noen viktige aminosyrer produsert fra veldesignet ¹³ C tracer eksperimenter, kan vi avsløre flere unike veier eller enzym aktiviteter uten å utføre sofistikerte ¹³ C-metabolic flux analyse av hele det sentrale metabolisme.

1. Entner-Doudoroff pathway: [1 - ¹³ C] glukose kan brukes som karbonkilde. Hvis veien er aktiv, vil serine merking være betydelig lavere enn merking i ^alanin-10.
2. Forgrenet TCA syklus: [1 - ¹³ C]pyruvat kan brukes som karbonkilde. Dersom TCA syklusen er brutt, kan aspartat merkes av to karbonatomer, mens glutamat er merket med bare ett karbon ^{11, 12.}
3. CO ₂ fiksering av Calvin-Benson-Bassham syklus i en mixotrophic metabolisme: Non-merket CO ₂ og merket karbon substrater er både brukt som karbon kilder. Hvis Calvin syklus er funksjonell, vil serine og histidin merking være betydelig utvannet, sammenligne med andre aminosyrer. Slik metode kan bestemme den relative CO ₂ fiksering når organisk karbon kilder er til stede i medium ^13.
4. Oksidativt pentose fosfat pathway: [1 - ¹³ C] glukose kan brukes som karbonkilde. Hvis veien er aktiv, vil ikke-merkede alanin være> 50% ^12.
5. Anaplerotic veien (f.eks PEP + CO ₂ à oxaloacetate): ¹³ CO ₂ og ikke-merkede carbon underlag (f.eks glyserol eller Pyruvate) kan brukes som karbonkilde. Hvis veien er aktiv, vil aspartat merking være betydelig beriket, sammenligne med alanin og serin ^13.
6. Re-citrat syntase: [1 - ¹³ C] pyruvat kan brukes som karbonkilde. Dersom enzymet er aktiv, glutamat merket i β-carboxyl ^{Gruppe 3, 4.}
7. Citramalate pathway: [1 - ¹³ C] pyruvat, [2 - ¹³ C] glyserol, eller [1 - ¹³ C] acetate kan brukes som karbonkilde. Hvis veien er aktiv, leucine og isoleucin merking beløp er identiske ^14.
8. Serine-isocitrate lyase syklus: [1 - ¹³ C] pyruvat eller [1 - ¹³ C] laktat kan brukes som karbonkilde. Hvis veien er aktiv, vil den tredje posisjonen karbon i serine merkes ^15.
9. Utnyttelse av næringsstoffer (dvs. eksogene aminosyrer): en kultur medium med fullt merket karbon underlag og ikke-merkede aminosyrerkan brukes. Hvis cellene selektivt utnytte disse supplert non-merket næringsstoffer, vil vi se betydelige merking utvanning av disse aminosyrer i biomassen. Denne metoden kan brukes til å undersøke hvilke næringsstoffer kosttilskudd er foretrukket av cellen ^16.

Seks. Representant Resultater

Nyere bioenergi studier har gjenopplivet interesser i å bruke romanen phototrophic mikroorganismer for produksjon av bioenergi og CO _2-fangst. I de siste årene har ganske mange 13C-metabolisme analyser, inkludert avanserte 13C-Metabolsk Flux analyser (13C-UD), blitt anvendt for å undersøke sentrale metabolisms i phototrophic bakterier, fordi biokjemiske kunnskap om sentrale metabolske veier er ikke velbegrunnet i disse ikke-modell organismer ^{10, 11, 17-20.} Her presenterer vi et eksempel på oppdagelsen av en alternativ isoleucin vei i Cyanothece 51142 ^21. Cyanothece 51142 inneholder ikke enzymet (EC 4.3.1.19, treonin ammoniakk-lyase), som katalyserer omdannelsen av treonin til 2-ketobutyrate i typiske isoleucin syntese veien. For å løse isoleucin veien, vokser vi Cyanothece 51 142 (20 ml) i ASP2 medium ²² med 54 mm glyserol (2-13C,> 98%). Cyanothece 51142 benytter ^2. posisjon merket glyserol som viktigste karbon kilde. Vi observerer at treonin og alanin man ha merket karbon, mens isoleucin er merket med tre karbonatomer. Derfor kan syntese i Cyanothece 51142 ikke være avledet fra treonin rute ansatt i de fleste organismer (figur 4). På den annen side, leucine og isoleucin har identiske merking mønstre basert på fragment (M-15) ⁺ og fragment (M-159) ^+. For eksempel isotopomer data fra [M-15] ⁺ (inneholder ufragmentert aminosyrer) viser identisk merking for leucine (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0,21, M3 = 00,69) og isoleucin (M0 = 0,01, M1 = 0,03, M2 = 0,24, M3 = 0,67). Dermed leucin og isoleucin må være syntetisert fra samme forløpere (dvs. pyruvat og acetyl-CoA). Denne observasjonen er konsistent med merket karbon overgangen i citramalate vei for isoleucin syntese. For å bekrefte denne veien, søker vi Joint Genome Institute database og finner tilstedeværelsen av en citramalate syntase Cima (cce_0248) i Cyanothece.

Figur 1. Den ¹³ C-assistert pathway analyse trinn.

Figur 2. Aminosyrer brukes til å anskaffe merking mønster av deres metabolske forløpere. ACoA, acetyl-CoA, AKG, α-ketoglutarat; C5P, ribose 5-fosfat, CIT, citrate, E4P, erythrose 4-fosfat, G6P, glukose 6-fosfat, OAA, oxaloacetate, PEP, phosphoenolpyruvate, PGA, 3-phosphoglycerate, PYR, pyruvat.

Figur 3. GC topper for 16 aminosyrer. TBDMS derivatized aminosyrer er sprukket med MS i to fragmenter: (M-57) ^+, som inneholder hele aminosyre, og (M-159) ^+, som mangler α carboxyl gruppen av aminosyren. For leucine og isoleucin, det (M-57) + ble overlappet av andre masse topper. Vi anbefaler å bruke fragment (M-15) + å analysere hele aminosyre merking. The (f302) + gruppen er påvist i de fleste aminosyrer, som inneholder kun den første (α-carboxyl gruppe) og andre karbonatomer i en aminosyre ryggrad. Fordi denne MS peak ofte har høy støy-til-signal forholdstall, (f302) ⁺ anbefales ikke for kvantitativt å analysere metabolske flukser ^7.

igure 4 "/>
Figur 4. Merking overganger i isoleucin baner i Cyanothece 51142 (modifisert fra vår forrige papiret) ^21.

Discussion

Denne protokollen består av fôring cellen med en merket substrat og måle den resulterende isotopiske merking mønstre i aminosyrer via GC-MS. Siden MS data (m / z ratio) gir akkurat den totale mengden av merking av MS ioner, må vi vurdere isotopomer distribusjoner av aminosyrer ved å undersøke m / z forholdstall på begge ufragmentert (M-57) ⁺ og fragmentert aminosyrer (dvs. (M-159) ⁺ og (f302) ^+). Videre kan vi utføre flere cellekulturer med en kjemisk identisk medium, men underlag som har forskjellige merking mønster ^(1. posisjon merket, ^2. posisjon merket, etc.). Merkingen informasjon om metabolitter fra disse eksperimentene kan integreres for å dekode de faktiske karbon overgangen ruter gjennom de sentrale stoffskifte.

For veien analyse, er valget av en merket substrat viktig. Generelt, enkeltvis merket karbon substrater er EASIer å bruke i spore skjebne merket karbon når ¹³ C percolates gjennom sentrale veier, mens flere carbon merket substrater kan forvirre karbon tracing. Også enkeltvis merket underlag er mer informative å belyse unik molekyl strukturer i metabolitter enn jevnt merket underlag. ⁴ For eksempel viser (Re)-type citrate syntase annen reaksjon stereokjemi fra normal citrat syntase, og dermed forårsaker citrate å ha ulike molekylære kiralitet . På den annen side, underlag er forskjellige i deres egnethet til å oppdage sine tilhørende veier. Glukose er best for å oppdage splitt forholdet mellom glykolysen og pentose fosfat pathways, mens pyruvat eller acetat er best for å analysere TCA syklus og noen aminosyre veier. Derfor er det nødvendig å bruke ulike underlag for å undersøke det generelle bildet av celle metabolisms.

¹³ C-isotopenmerking er en nyttig teknikk for å bestemme funksjonelle stier i mikroorganismer. Imidlertid har denne teknikken flere begrensninger. Først, det egner seg kun for analyse av karbon metabolisme bruk av organiske substrater, som det ikke kan direkte løse stoffskiftet i autotrophic metabolisms hvis CO ₂ brukes som eneste karbonkilde. Autotrophic kulturer bruker CO ₂ merke alle aminosyrer i samme utstrekning som innspill ¹² CO ₂ / ¹³ CO ₂ blanding ^23. Dette gjør veien analyse vanskelig, som metabolisme analyse må utledes fra en omorganisering av ¹³ C karbonatomer i metabolitter av ulike stoffskifte. Second, presenterer dette papiret utelukkende kvalitative resultater å skille mellom "aktiv" og "ikke-aktiv" veier. Nøyaktig tallfesting av metabolismen krever en sofistikert modellering tilnærming (dvs. tredje, er omfanget av ¹³ C-metabolisme analyse begrenset av tekniske utfordringer i å bestemme lav overflod og ustabil metabolitter. Bredere metabolske nettverket kan probed ved å analysere frie metabolitter foruten aminosyrer. Måling av frie metabolitter krever både høyeffektiv metabolitten utvinning metoder og svært sensitive analytiske plattformer. LC-MS, FT-ICR MS, og CE-MS har vært brukt for å identifisere merking mønstre av frie metabolitter, og gi mer innsikt i celle metabolisms ^2. Fjerde, ¹³ C-assistert veien analyse gjøres best i minimal medium, fordi tillegg av ikke-merkede næringsstoff tilskudd fører til feilaktig lavere merking konsentrasjoner og gjøre kvantitative ¹³ C-MFA studier ikke så enkelt. Dessuten kan celler bruke eksogene aminosyrer mye for protein synthesis, og dermed gi meget svake merking signaler for disse proteinogenic aminosyrer ^24. Hvis en rik medium er nødvendig for å vokse celler, måling av intracellulære metabolitter, i stedet for aminosyrer, effektivt kan redusere forstyrrelser i merking data som oppstår fra eksogene non-merket karbon næringsstoffer.

Endelig er et økende antall genomet sekvenser for non-modell mikrobielle arter blir publisert hvert år. Imidlertid har funksjonell karakterisering av disse artene ligget langt bak tempoet i genomisk sekvensering. ¹³ C-merking tilnærminger kan spille viktige roller i bekreftelsen og oppdagelsen av metabolske veier i mange ikke-modell organismer. Videre kan merking bli integrert med metabolsk modellering ⁽¹³ C-MFA) å dechiffrere absolutt karbon flukser i mikroorganismer ^25. Derfor kan denne teknikken bli mye brukt i analyse av biologiske systemer knyttet til biodrivstoff, ecological og medisinske applikasjoner.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
TBDMS	Sigma-Aldrich	19915	-
THF	Sigma-Aldrich	34865	-
Labeled carbon substrate	Cambridge Isotope Laboratories	Depend on the experimental requirement	Website: http://www.isotope.com
Gas chromatograph	Agilent Technologies	Hewlett-Packard, model 7890A	-
GC Columns	J&W Scientific	DB5 (30m)	-
Mass spectrometer	Agilent Technologies	5975C	-
Reacti-Vap Evaporator	Thermo Fisher Scientific, Inc.	TS-18825	For drying amino acid samples