Summary
13 C -同位体標識は、微生物の様々なタイプの細胞の中央代謝を決定するための便利なテクニックです。細胞が特異的な標識基質で培養された後、GC - MS測定では、タンパク質構成アミノ酸のユニークな標識パターンに基づいて、機能的な代謝経路を明らかにすることができます。
Abstract
微生物は、生化学と機能ゲノミクス手法を用いて検討することができる複雑な代謝経路を持っている。セル中央の代謝を検討し、新しい酵素を発見する一つの重要な技術は、13 C -アシスト代謝の分析1です。この手法は、微生物が13 C標識基質が供給されるという同位体標識に基づいています。生化学ネットワークにおける代謝物との間の原子の遷移パスをトレースすることで、我々は機能的な経路を決定し、新しい酵素を発見することができます。
トランスクリプトミクスとプロテオミクスを補完する方法としては、代謝経路のアイソトポマー支援分析のためのアプローチは3つの主要手順2を含んでいます。 まず 、我々は13 C標識基質と細胞を成長させる。このステップでは、培地の組成および標識基質の選択は2つの重要な要因です。栄養補助食品の非標識炭素から測定ノイズを避けるために、唯一の炭素源と最少培地が必要です。さらに、標識された基質の選択は、それが分析されている経路を解明する方法を効果的に基づいています。小説の酵素は、しばしば別の反応の立体化学や中間製品を含むので、一般的に、単独で標識された炭素の基質は、新規の経路3,4の検出のための均一標識したものよりも小説の経路を検出するための、より有益である。 第二 に 、我々は、GCを使用して、アミノ酸の標識パターンを分析する- MS。アミノ酸は、タンパク質が豊富ですので、バイオマスの加水分解から得ることができる。アミノ酸は、GCの分離の前にN -（tert -ブチルジメチルシリル）- N - methyltrifluoroacetamide（TBDMS）で誘導体化することができる。 TBDMS誘導体化アミノ酸は、MSとのフラグメントの異なる配列の結果によって分割されることがあります。断片化と断片化されていないアミノ酸の電荷（m / z）比質量に基づいて、我々は、中央代謝の可能性というラベルの付いたパターンを推測することができますアミノ酸の前駆体。 第三に 、我々はこれらの経路が2アクティブであるかどうかを確認、アイソトポマーのデータに基づいて、提案された経路で13C炭素の遷移をトレースします。アミノ酸の測定は、中央代謝八重要な前駆体の代謝物に関する同位体標識の情報を提供します。これらの代謝キーのノードは、関連付けられている中心的な経路の機能を反映することができます。
タンパク質構成アミノ酸を介した13 C -アシスト代謝分析は広く特徴のあまりない微生物代謝1の機能解析に使用することができます。このプロトコルでは、我々は新たな酵素機能を発見するためのラベルの付いた炭素基質の使用方法を示すためのモデル株としてCyanothece 51142を使用します。
Protocol
1。細胞培養（図1）
- 微量元素、塩、ビタミン、および経路の調査に最適な特に標識された炭素基質と最少培地で細胞を成長させる。細胞培養用振盪フラスコまたはバイオリアクターのどちらかを使用してください。このような酵母エキスなどの有機栄養素は、アミノ酸の標識の測定に干渉する場合がありますので、培養液中に存在することはできません。
- UV /可視分光光度計で最適な波長（例えば、Cyanothece 51142のためのOD 730）での培養の光学密度によって細胞増殖を監視します。
- 細胞は、最初の非標識培地で成長させることができる。中間対数増殖期の細胞が標識された培地の接種（ボリュームの接種率3％（v / v）の）のために使用することが好ましい。ラベルの付いた文化は、初期の接種から非標識炭素の導入を避けるために、同じラベル付けされた培地で（3％（v / v）の接種率）継代培養してください。
- 遠心分離（10分、8000 × g）で中間対数増殖期に収穫継代培養細胞（10ml）を。
- 6MのHCl 1.5mlのでペレットを再懸濁し、透明なガラス、スクリュートップGCバイアルに移します。バイアルにフタをし、アミノ酸にバイオマスのタンパク質を加水分解するために24時間100℃のオーブン中に置いてください。バイオマスのペレットの加水分解は、20共通のアミノ酸（図2）5の16を得ることができる。システインおよびトリプトファンが分解され、そしてグルタミンとアスパラギンは、それぞれ、グルタミン酸とアスパラギン酸に変換されます。
- 2ミリリットルエッペンドルフチューブを用いて5分間、20,000 × gでアミノ酸溶液を遠心し、その新しいGCバイアルに上清を移す。このステップでは、加水分解溶液に固体粒子を除去。
- GCバイアルの蓋を外し、サーモフィッシャーサイエンティアクティ-バップエバポレーター（注記を使用して空気の流れの下で完全に試料を乾燥：凍結乾燥機をもtを使用することができます。O乾燥試料）。この手順は一晩行うことができます。
3。アミノ酸の誘導体化とGC - MSの条件
アミノ酸やGCを経由して充電/高極性代謝物の分析は、これらの代謝物はアミノ酸は揮発性であり、ガスクロマトグラフィー2で分離できるように、誘導体化する必要があります。
- テトラヒドロフランの150μL（THF）およびN -（tert -ブチルジメチルシリル）- N - methyltrifluoroacetamide誘導体化試薬を150μLと乾燥試料を溶解する。
- ℃で1時間は65と80の間にオーブンまたは水浴ですべてのサンプルをインキュベートする。バイアル内の代謝物が溶解されていることを確認するために時々ボルテックス。
- 10分間20,000 × gでサンプルを遠心し、新しいGCバイアルに上清を移す。上清は透明で黄色がかったソリューションでなければなりません。検出器の飽和のために、GC - MSの測定精度は高いconceによって影響を受ける可能性が注入TBDMS誘導体化アミノ酸（これらのサンプルはしばしば暗褐色の色を示す）のntrationは、したがって、我々は、GC - MS測定6日までにTHFを使用してこれらのサンプルを希釈してください。
- GC - MS（、注入量を1：05または1:10スプリット比を使用する= 1μL、キャリアガスヘリウム= 1.2 mL /分）でサンプルを分析する。以下のGCの温度プログラムを使用して150で保持し20℃で2分間、3の増加° C〜280分あたり° C、増° C〜300分ごとに° C、およびその後5分間保持する。溶剤遅延は〜5分（30メートルGCカラム用）として設定することができます。 MSの比（m / z）を充電するために質量の範囲は60から500の間で設定できます。
4。 GC - MSデータの解析
- TBDMS誘導体化アミノ酸の測定は、GCの分離における同位体分別の影響を受ける可能性があります。光同位体は、GCカラムの同位体をつくよりも速く少し移動。電位測定の偏りを減らすために、我々は全体の質量スペクトルを平均化ができるアミノ酸のピーク範囲6
- TBDMS誘導体化代謝物のGCおよびMSスペクトルは、7の前に報告されている。各アミノ酸のためのGCの保持時間とユニークなm / zのピークが図3に示されています。
- アミノ酸または中央の代謝物の誘導体化は、13 C（1.13％）を含めて自然に標識された同位体のかなりの量、、18 O（0.20％）、29 Siの（4.70％）、および30のSi（3.09％）を紹介します。生の大量のアイソトポマーのスペクトルの自然同位体から測定ノイズが公開されたソフトウェア5、8を使用することで解決できます。最終的な同位体標識のデータは、質量分率、例えば、M 0、M 1、M 2、M 3およびM 4として報告されている（0から4個の13 C標識された炭素を含むフラグメントを表す）。
- 2 - オキソ - グルタル：アミノ酸の測定は、8つの重要な前駆体の代謝物に関する同位体標識の情報を提供することができます3 - P -グリセリン、アセチル- CoA、エリスロース- 4 - P、オキサロ酢酸、ホスホエノール、ピルビン酸、およびリボース-5 - P、食べた。これらの代謝物の標識パターンはいくつかの中心的な代謝経路（図2）9を識別するために使用することができます。標識実験の結果は、さらに他の生化学の方法（例えば、RT - PCR）を用いて確認することができます。
5。標識したアミノ酸のデータを用いて経路解析
うまく設計された13 Cトレーサー実験から生産のみ、いくつかの重要なアミノ酸を調べることにより、我々は全体の中央代謝の洗練された13 C -代謝フラックスの分析を行うことなく、いくつかのユニークな経路や酵素活性が明らかになることがある。
- Entner - Doudoroff経路：[1 - 13 C]グルコースを炭素源として使用することができます。経路がアクティブな場合、セリンのラベリングは、アラニン10でラベリングよりもかなり低くなります。
- 分岐したTCAサイクル：[1 - 13 C]ピルビン酸は、炭素源として使用することができます。 TCAサイクルが壊れている場合は、グルタミン酸が1つの炭素11、12で標識されている間、アスパラギン酸は、二つの炭素で標識することができる。
- 炭素基板を両方の炭素源として使用されるCO 2以外の標識と標識：混合栄養代謝のカルビン-ベンソン- BasshamサイクルによるCO 2固定。カルビンサイクルが機能している場合、セリンとヒスチジン標識は、大幅に他のアミノ酸に比較し、希釈される。有機炭素源は、媒体13に存在するときにこのような方法は、相対的CO 2固定を決定することができます。
- 酸化的ペントースリン酸経路：[1 - 13 C]グルコースを炭素源として使用することができます。経路がアクティブな場合、非標識アラニンは、> 50％12になります。
- アナプレロティック経路（例えば、PEP + CO 2 àのオキサロ酢酸）：13 CO 2および非標識炭素基質（例えば、グリセロールまたはピリジンuvate）を炭素源として使用することができます。経路がアクティブな場合、アスパラギン酸の標識は大幅にアラニンに比較し、13セリン、濃縮されます。
- 再クエン酸シンターゼ：[1 - 13 C]ピルビン酸を炭素源として使用することができます。酵素がアクティブな場合、グルタミン酸は、β-カルボキシル基3、4にラベルが付いています。
- Citramalate経路：[1 - 13 C]ピルビン酸、[2 - 13 C]グリセロール、または[1 - 13 C]酢酸を炭素源として使用することができます。経路がアクティブになっている場合は、ロイシン、イソロイシンの標識量は14と同じです。
- セリン-イソクエン酸リアーゼサイクル：[1 - 13 C]ピルビン酸または[1 - 13 C]乳酸は、炭素源として使用することができます。経路がアクティブな場合、セリンの3位の炭素は15というラベルが付けられます。
- 栄養素の利用率（すなわち、外因性アミノ酸）：完全にラベルの付いた炭素基質および非標識アミノ酸を含む培地使用することができます。細胞が選択的にこれらの補足の非標識の栄養素を利用するのなら、我々は、バイオマス中のこれらのアミノ酸の重要なラベリングの希釈が表示されます。このメソッドは、栄養補助食品は、セル16に好まれている調査するために使用することができます。
6。代表的な結果
最近のバイオエネルギーの研究は、バイオエネルギーの生産とCO 2のキャプチャのための新規光合成微生物を使用して利益を復活している。中央代謝経路の生化学的な知識が十分な根拠がないので、過去数年間で、先進的な13C -代謝フラックス解析（13C - MFA）を含むかなりの数の13C -代謝分析は、、、光合成細菌において中心的な代謝を調査するために適用されているこれら以外のモデル生物10、11、17〜20インチここで、我々はCyanothece 51142 21の代替イソロイシン経路の発見の例を示す。 シアンothece 51142は、典型的なイソロイシン合成経路において、2 - ketobutyrateにスレオニンの変換を触媒する酵素（EC 4.3.1.19、スレオニンアンモニア-リアーゼが）、含まれていません。イソロイシン経路を解決するために、我々は54 mMのグリセロール（2 - 13C、> 98％）とASP2媒体22にCyanothece 51142（20 mL）を成長する。Cyanothece 51142は、主な炭素源としてグリセロール標識した第2の位置を利用しています。イソロイシンの3つの炭素で標識されている間私達は、スレオニンとアラニンが一炭素のラベルがついたことを確認します。したがって、Cyanothece 51142の合成は、ほとんどの生物（図4）で採用されているスレオニン経路から派生させることはできません。一方、ロイシン、イソロイシンは、フラグメントに基づいて、同一の標識パターンを持つ（M - 15）+とフラグメント（M - 159）+。例えば、[M - 15] +（フラグメント化されていないアミノ酸を含む）からのアイソトポマーのデータは、ロイシンに対して同一のラベル（M0 = 0.01、M1 = 0.03、M2 = 0.21、M3 = 0を示す0.69）とイソロイシン（M0 = 0.01、M1 = 0.03、M2 = 0.24、M3 = 0.67）。したがって、ロイシン、イソロイシンは、同じ前駆体（すなわち、ピルビン酸、アセチルCoA）から合成されている必要があります。この観察は、イソロイシン合成のためのcitramalate経路中の標識炭素の移行と一貫性です。この経路を確認するために、我々は共同ゲノム研究所のデータベースを検索しCyanotheceでcitramalateシンターゼシーマ （cce_0248）の存在を見つける。
図1 13 C -アシストパスウェイ解析の手順。
図2。その代謝前駆体の標識パターンを取得するために使用されるアミノ酸。 ACoA、アセチルCoA、AKG、α-ケトグルタル酸、C5P、リボース5 - リン酸、CIT、クエン酸、E4P、エリスロース4 - リン酸、G6P、グルコース-6 - リン酸、OAA、オキサロ酢酸、PEP、ホスホエノールピルビン酸、PGA、3 - ホス、PYR、ピルビン酸。
図3。16個のアミノ酸のためのGCピーク。アミノ酸のαカルボキシル基を欠いている全アミノ酸、及び（M - 159）+を含む、（M - 57）+：TBDMS誘導体化アミノ酸は、二つのフラグメントにMSによってクラックされています。ロイシンとイソロイシンの場合は、（M - 57）+は、他の質量ピークが重なっていた。我々は、全アミノ酸の標識を分析するフラグメントを（M - 15）+使用することをお勧めします。 （F302）+グループは、アミノ酸のバックボーン内の最初の（α-カルボキシル基）と第二の炭素を含む、ほとんどのアミノ酸で検出される。このMSピークはしばしば高いノイズ対信号比を持っているので、（F302）+することは定量的な代謝フラックス7を分析するために推奨されていません。
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図4。Cyanothece 51142（前報から変更）21イソロイシン経路の遷移のラベル付け。
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Discussion
このプロトコルは、標識基質を細胞に供給し、GC - MSを経由してアミノ酸に生じる同位体標識パターンを測定することで構成されています。 MSデータ（m / zの比）がちょうどMSイオンのラベリングの全体的な量を与えるので、我々は両方の断片化されていないのm / zの比（M - 57）+を調べて、断片化されたアミノ酸でアミノ酸のアイソトポマーの分布を評価する必要があります（すなわち、（M - 159）+と（F302）+）。さらに、我々は化学的に同一の媒質が異なる標識パターン（ラベル付き第1の位置、標識した第2の位置、など）を持つ基板といくつかの細胞培養を行うことができます。これらの実験からの代謝物についての標識情報は、中央の代謝経路を介して実際の炭素の遷移経路をデコードするために統合することができます。
パスウェイ解析のために、標識された基質の選択が重要になります。一般的には、単独で標識された炭素の基質は、EASですIERは、標識された炭素の運命を追跡するのに使用する際に中心的な経路を通じて13 Cのpercolates、複数の炭素が基板5混乱させるカーボントレースをラベル付けしながら。また、単独で標識基質を均一に標識基質より代謝物にユニークな分子構造を解明するために、より有益である。例えば、4、（ 再 ）型クエン酸合成酵素は、通常のクエン酸シンターゼとは異なる反応の立体化学を示し、そのため異なる分子のキラリティーを持つようにクエン酸を発生する。一方、基質はそれに関連する経路を検出するために適性が異なる。ピルビン酸または酢酸はTCAサイクルといくつかのアミノ酸経路を分析するために最適である一方、グルコースは、解糖系とペントースリン酸経路の間でスプリット比を検出するために最適です。したがって、それは細胞の代謝の全体像を調査するために別の基質を使用する必要があります。
13 C同位体ラベルは、微生物で機能的な経路を決定するための便利なテクニックです。しかし、この手法にはいくつかの制限があります。 まず 、それを CO 2を唯一の炭素源として使用されている場合は、直接独立栄養代謝の代謝を解決できないとして、有機基板を用いた炭素代謝の解析にのみ適しています。入力12 CO 2 / 13 CO 2混合物23として同程度のCO 2のラベルのすべてのアミノ酸を用いて独立栄養培養。代謝の解析は別の代謝経路で代謝物の13 C炭素の再配列から推測する必要があるので、これは、経路の解析を困難にする。 第二 に 、本 論文では"アクティブ"と"非アクティブ"の経路を区別もっぱら定性的な結果を示す。代謝の正確な定量化は、高度なモデリングアプローチを（すなわち、必要と
最後に、非モデル微生物種のゲノム配列の数が増えて、毎年出版されています。しかし、これらの種の機能解析は、これまでゲノム配列決定のペースに遅れをとっている。13 C標識のアプローチは、多くの非モデル生物の代謝経路の確認や発見に重要な役割を果たすことができる。さらに、ラベルの情報は、微生物25の解読絶対炭素フラックスへの代謝モデリング（13 C - MFA）と統合することができます。従って、この技術は広くecolog、バイオ燃料に関連する生物学的システムの分析で使用することができますiCalと医療への応用。
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Disclosures
利害の衝突は宣言されません。
Acknowledgments
この研究は、NSFキャリアグラント（MCB0954016）とDOEバイオエネルギー研究助成（DEFG0208ER64694）によってサポートされていました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| TBDMS | Sigma-Aldrich | 19915 | - |
| THF | Sigma-Aldrich | 34865 | - |
| Labeled carbon substrate | Cambridge Isotope Laboratories | Depend on the experimental requirement | Website: http://www.isotope.com |
| Gas chromatograph | Agilent Technologies | Hewlett-Packard, model 7890A | - |
| GC Columns | J&W Scientific | DB5 (30m) | - |
| Mass spectrometer | Agilent Technologies | 5975C | - |
| Reacti-Vap Evaporator | Thermo Fisher Scientific, Inc. | TS-18825 | For drying amino acid samples |
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