Summary
Två metoder för att screena växter med rotknölnematoder beskrivs. De beskrivna metoder innefattar hög genomströmning skärmar med nematoder i en icke-förstörande sätt att underlätta användningen av dessa växter i avelsprogram.
Abstract
Rotknölnematoder (släktet Meloidogyne) är obligata växtparasiter. De är extremt polyphagous och anses vara en av de ekonomiskt viktiga växtparasitiska nematoder. Den mikroskopiska andra stegets juvenil (J2), molted gång i ägg, är det infektiösa stadiet. De J2S kläcks ur äggen, röra sig fritt i jorden inom en film av vatten och leta rotspetsar på lämpliga växtarter. Efter att tränga in i växtrötter, vandrar de mot vaskulära cylindern där de skapa en matning plats och påbörja utfodring med sina nålar. Den flercelliga matningsstället består av flera förstorade multinukleära celler kallade jätteceller 'som är bildade från celler som undergick karyokinesis (upprepad mitos) utan cytokines. Angränsande pericycle celler delar och förstora i storlek ger upphov till en typisk galla eller rot knut, de karakteristiska symtomen på root-knot nematod infektion. När utfodring initieras, J2S blir stillasittande och undergo ytterligare tre molts att bli vuxna. Den vuxna honan lägger 150-250 ägg i en gelatinartad matris på eller under ytan av roten. Från äggen nya infektiösa J2S kläcks och starta en ny cykel. Roten-knot nematod livscykel är klar i 4-6 veckor vid 26-28 ° C.
Här presenterar vi den traditionella protokollet att infektera växter, som odlas i krukor med rotknölnematoder och två metoder för high-throughput analyser. Den första high-throughput metod används för anläggningar med små frön som tomat, medan den andra är för växter med stora frön som cowpea och gemensamma bönor. Stora frön stödjer utökade planta tillväxt med minimal näringstillskott. Den första hög genomströmning analysen använder plantorna odlas i sand i lådor medan den andra analysplattan växterna odlas i påsar i frånvaro av jorden. Plantan tillväxten påsen är gjord av en 15,5 x 12,5 cm papper veke, vek i toppen för att bilda en 2-cm-djupa tråg i vilken fröna eller plantan är placerad. Denpapper veke finns inuti en genomskinlig plastpåse. Dessa tillväxt påsar medger direkt observation av symtom nematodinfektion, hopskärning rötter och ägg massproduktion, under ytan av en transparent påse. Båda metoderna kan användningen av kontrollerade anläggningarna efter fenotypning för korsande eller produktion av utsäde. En ytterligare fördel med användningen av tillväxtfaktorer påsar är litet utrymmesbehov eftersom påsarna är lagrade i plast som hänger mappar anordnade i ställningarna.
Protocol
1. Tomatgroddplanta Tillväxten i krukor och Brickor
- För pot analyser, växt tomat frön i en enda pott i ett organiskt-rik jord som Sunshine mix. Bibehålla i ett växthus vid 22-28 ° C. Efter groning, gödsla en gång i veckan med Miracle-Gro.
- Ungefär två veckor efter groning, vid två sanna-bladstadiet, transplantera sig plantorna i krukor (10 cm diameter och 17 cm djupa) fyllda med sterilt sandig jord som innehåller 90% sand och 10% organisk mix. Lägg Osmocote långsam frisättning gödningsmedel och upprätthålla ett växthus vid 22-28 ° C under två veckor. Fortsätt att gödsla växter en gång i veckan med Miracle-Gro.
- För hög genomströmning skärmar, plantera frön direkt i brickor i sandjord, täcka brickan med plastfolie tills groning och underhålla som ovan. Efter groning, lägg Osmocote långsam frisättning gödningsmedel och gödsla en gång i veckan med Miracle-Gro.
2. Cowpea Tillväxten i plantor påsar
- SEEDS är antingen groddes i en Petri-skål, fodrad med flera lager av papper Kimwipe och överfördes individuellt till påsar eller placeras direkt in i papperet spåret av påsen och groddes.
- Placera påsar i plast hängande mapp, två per mapp och ordna mappar i ett rack i en vertikal position. Placera stället i en kontrollerad miljö-kammare som hölls vid en temperatur av 25-28 ° C och 16 h ljus / 8 timmar mörker-cykel. Kuggstänger också kan bibehållas i ett växthus, men kräver en folie eller styvt papper locket placeras över hållaren på båda sidor av de växt-stammar, för att minska risken för svampkontamination.
- Vatten påsarna en eller två gånger per dag med omvänd osmos. Omkring 10 till 14 dagar efter sådd, vid en lämplig rotsystemet med tertiära rotspetsar har utvecklats (figur 1), fröplantorna är redo för ympning.
3. Extraktion av nematodägg
Extraktion av eGGS från infekterade rötter är modifierad från ett protokoll som utvecklats av Hussey och Barker (1973).
- Tre till fyra dagar innan nematod ympning, packa root-knot nematod ägg från infekterade tomat rötter. Innan du börjar ägget utvinning, tvätta arbetsområdet noggrant med varmt vatten för att undvika kontaminering. Också tvätta i varmt vatten en mixer, två hinkar, en trådnät stöd, en gummiklubba, tre siktar på 425, 90 och 25 m öppning, en graderad cylinder och sax.
- Stack silarna från topp till botten i följande ordning: 425, 90 och 25 m öppning. Äggen samlas på 25 ^ m sikt vid botten. Sätt siktarna på ett trådnät som stöds i en vask. Placera en hink under trådnätet att samla genomgång lösning.
- Skär topparna av den infekterade växten (er), som används som källa för inokulum, och kassera dem. Ta försiktigt bort växten från potten. Tvätta rötterna genom att doppa i en plasthink full med vatten. Skölj rötterna vidare under körarinnande vatten till dess att jordpartiklar tvättas bort från rötterna.
- Skär rötterna med en sax i små bitar. Kassera pålrot.
- Sätt de hackade rötter från en enda planta i en stor plastburk med lock, tillsätt bara tillräckligt 10% blekmedel lösning för att täcka rötterna och stäng locket.
- Skaka burk innehållande rötterna under 2 min.
- Öppna burken och häll rötterna på den översta sikten och tvätta med en slang kopplad till en imma munstycke. Tvätta tills allt blekmedel lukten är borta. Använd en hammare för att peka på sidorna av silarna för att undvika igensättning silen porerna.
- Ta bort den övre sikten och skölj skräp på den andra sikten.
- Avlägsna den andra sållet och samla upp fina partiklar, som innefattar ägg, från den sista sikten. Med en försiktig ström från en vattenflaska flyttar skräp till ena sidan av sikten. Samla upp skräp och ägg i en ren bägare med minsta möjliga mängd vatten.
- Sikta gång vattnet samlas upp iskopan genom 25 m sikten för att samla alla ägg som kan ha undgått. Skölj väl med vatten och samla i samma bägaren.
- Kasta växtrester från toppen sikten och tvätta noga alla tre siktar med trycksatt vatten. Rör inte nätet en del av silarna eftersom det kan snedvrida porstorleken.
4. Kläckägg nematodägg
- Line en ren metall korg med några lager Kimwipe papper och montera på ett glas petriskål. Tillåta en 1-cm avstånd mellan botten av korgen och formen.
- Häll de extraherade nematodägg på papperet i trådback. Tillsätt tillräckligt med vätska så att botten av trådkorg vidrör vattenytan, men är inte nedsänkt i vatten. Täck toppen med ett plastlock.
- Varje dag kontrollera för vattenavdunstning och tillsätta lite vatten i petriskålen så att botten av korgen vidrör vattnet. Detta förhindrar att ägg från uttorkning.
- Varannan dag hämtar water som innehåller J2S från Petri-skålarna till en bägare. Om den inte används omedelbart, vädra in inokulatet i rumstemperatur med hjälp av en tillförsel lab luft eller luft som genereras av ett akvarium pump. Använd den luftade inokulatet inom 2 dagar. J2S kan uppsamlas från den streckade inrättat över en period av 6-8 dagar.
5. Tomat Root Infektion i krukor eller brickor och utvärdering av Infection
- Använd tre portioner av de insamlade nematoder att räkna antalet J2S i en räkna bild eller fat, beräkna den genomsnittliga och bestämma önskad volym för ympning. Typiskt 3000 J2S används per planta i krukor och 500 J2S för växter som odlas i plantor magasin.
- Rör om den inokulum på en magnetomrörarplatta vid låg hastighet.
- Innan du ympa plantorna, se till att jorden är fuktig men inte alltför blöt. För potten ympning, gör tre hål omkring en halv-pot djup i sanden runt varje tomat rotsystemet med en penna (figur 2
- För de med hög genomströmning skärmar i brickor, använd en modifierad sluten spets nål med hål på sidorna limmade till en 5-ml pipettspets längs en pipett (Figur 3) för att leverera J2S i marken. Alternativt kan nematoder levereras som i steg 5,3.
- Hålla växterna i ett växthus vid 24-27 ° C under sex till åtta veckor. Fortsätt att gödsla två gånger i månaden med Miracle-Gro.
- För utvärdering av infektion, försiktigt ta bort växterna från krukorna och tvätta rötter (som beskrivs i steg 3,3).
- Färga ägg massorna blå genom att sänka ned rötterna i 1 mg / L Erioglaucine, i 15 min.
- Skölj rötterna i vatten och utvärdera genom att räkna de färgade ägg massorna på individuell rotsystem. En belyst skrivbord förstoringsglas kan användas för att hjälpa visualisera ägg massorna.
- Om kontrollerade anläggningar behövs för ytterligare genetic studier, klipp inte toppar före tvätt rötterna för utvärdering. Efter färgning och räkning av ägg massorna, transplantera de späda plantorna i organisk jord, beskära de toppar kraftigt för att reducera avdunstning, och bibehålla i ett växthus.
6. Cowpea Root Infektion i påsar och utvärdering av Infection
- Räkna nematod inokulum och rör om en magnetomrörarplatta, såsom beskrivits tidigare.
- Ta bort påsarna från hängande mappar och placera på en horisontell yta. Ympa varje påse med 1500 J2S i 5 ml. Dra ut skyddet av påsen och fördela de nematoder jämnt över ytan av rötterna.
- Håll påsar i ett horisontellt läge för 24 timmar efter ympning, täckt med mörkt papper för att utesluta ljus, sedan tillbaka till de hängande mappar i tillväxten kammaren.
- Vattna blommorna som behövs, en eller två gånger dagligen, med halv styrka Hoagland lösning (Hoagland & Arnon, 1950, tabell 1
- Cirka 30 dagar (intervall 28-35 dagar) efter ympning, ingjuter Varje påse med ca 10-20 ml av 75 mg / L Erioglaucine. Håll påsarna översvämmade med färgämnet i ett horisontellt läge över natten.
- Töm fickorna och utvärdera de rotsystemen genom att räkna äggen massorna under en belyst skrivbord lupp.
- Om kontrollerade anläggningar behövs för vidare genetiska studier eller avel arbete, försiktigt dra ut rötterna från papperet, transplantationen i organisk jord i krukor och upprätthålla ett växthus.
7. Representativa resultat
Vederbörliga tomat och cowpea anläggningar för nematod vaccinationer för de två beskrivna systemen visas i figur1 och 2. Dessutom är exempel på väl-infekterade rötter tomat och cowpea visas i figurerna 4 och 5. Som i de flesta motståndskraft mot sjukdomar skärmar, är det lämpligt att använda minst 6-10 plantor per genotyp för nematoden ympning för att beräkna genomsnittet av infektioner. Variation i nematodinfektion mellan växter av samma genotyp, kan minskas genom att använda enhetliga anläggningens storlek och exakt mängd och leverans av inokulat.
Användningen av tråg och påsar tillväxt möjliggör screening av hundratals till tusentals växter i en liten ökning utrymme. Tillväxt påsar medger också snabb och effektiv icke-destruktiv utvärdering av root-knot nematod infektioner med något behov av tvätt rötter (Figur 4).
Figur 1. En två veckor gamla cowpea växt som odlas i en påse och är klar för root-knot NEMATode inokulering.
Figur 2. En tre veckor gamla tomatplantor redo för root-knot nematod ympning.
Figur 3. En modifierad nål och pipettspets används för high-throughput ympning av nematoder. Botten av en nål förseglades och tre uppsättningar av hål borrades i nålen med hjälp av en laserstråle. Därefter modifierades nålen limmas till en 5-ml pipettspets.
Figur 4. En tomat rotsystemet infekterade med rotknölnematoder.
Figur 5. Ett cowpea rotsystem med ägg massor färgats med Erioglaucine 30 dagar efter inokulering vuxit28 ° C.
Discussion
Det finns två viktiga steg för en lyckad nematod skärmen: utarbetandet av ett mycket smittsamt inokulat och använda växter på rätt utvecklingsstadium. Kläckning hastighet av rotknölnematoder nematodägg är mycket variabel och uppgår till mellan 5 till 50%. Därför att erhålla optimala nivåer av luckan och starkt J2S infektiösa, måste stänga hänsyn tas till ägget utvinning-och kläckning. Ägg bör utsättas för blekmedel för en minsta tidsperiod och blekmedel bör sköljas väl ut från roten blandningen. När kläckningen av ägg bör slammet innehåller ägg inte nedsänkt i vatten. Dessutom undvika att spilla äggen i den underliggande petriskålen där kläckta yngel samlas in. Ett sätt att undvika att spilla äggen under kläckning processen är inte att lägga till vattnet direkt till Kimwipe som papper kan gå sönder. Istället lägger vattnet direkt till petriskål.
För bästa resultat, använd nyligen kläckta J2S. Om hatch-graden är låg och mer inokulum behövs kan J2S lagras vid 15 ° C under en längre period. Värma den lagrade inokulum till rumstemperatur för att återuppliva nematoderna före ympningen. Men inte lagrar J2S under långa perioder, även vid 15 ° C som svalt J2S inte smitta effektivt.
Unga plantor är det bästa utvecklingsstadiet för root-knot nematod ympning. Behöver dock vägas mot bildandet av ett lämpligt rotsystem som kan ge tillräckliga mängder root tips som införselplatser för J2S. Bibehålla optimal kondition växters tillväxt är också kritisk för skärmar. Undvik att vattnas plantorna speciellt de som odlas i påsar. Över-vattning av påsarna, vilket indikeras av stående vatten på bottnen av påsen, kan främja svamptillväxt och minskar rot hälsa.
Med både analyser ytterligare utvärdering av nematodinfektion och beräkning av antalet ägg / rotsystem och ägg / gram fresh rot kan utföras. För tomat analyserna, individuella rötter vägs och extraherade ägg som beskrivits för inokulat beredning (avsnitt 3). Vid bearbetning av ett stort antal växt prover, kan enskilda rotsystem kan urlakade med en mixer för ägg extraktion. Antalet ägg bör räknas i minst tre portioner och äggen / gram färsk rotsystem beräknas. För påsen analyserna, rotsystemet dras av papper insatsen, vägdes och ägg extraheras.
Disclosures
Vi har inget att lämna ut.
Acknowledgments
Forskning i Kaloshian lab finansieras genom ett bidrag från USA National Institute of Food och jordbruksorganisation (2007-35607-17765). Forskning i Roberts lab finansieras genom anslag från USA Agency for International Development (GDG-G-00-02-00012-00 och EDH-A-00-07-00005) och California Dry Bean Advisory Board.
References
- Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway. Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).
- Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea. Crop Sci. 40, 611-618 (2000).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).
- Hussey, R. S., Barker, K. R. A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique. Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).
- Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid. Plant J. 27, 417-425 (2001).
- Matkin, O. A., Chandler, P. A. The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants. Calif. Agric. Exp. Stn. Manual. Baker, K. F. 23, 68-85 (1957).
- Omwega, C. O., Roberts, P. A. Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature. Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).
- Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita. Plant Dis. 72, 970-972 (1988).
- Perry, R. N. Root-Knot Nematodes. Moens, M., Starr, J. L. , CABI Publishing. Wallingford. (2009).
- Starr, J. L., Cook, R. Resistance to Parasitic Nematodes. Bridge, J. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).
