Summary
שתי שיטות שונות על צמחים מסך עם השורש קושר את נמטודות מתוארים. הגישות שתוארו כוללות תפוקה גבוהה מסכים עם נמטודות באופן הורסות להקל על השימוש בצמחים אלה בתוכניות רבייה.
Abstract
השורש קושר את נמטודות (הסוג Meloidogyne) הם טפילים צמחים המחייבות. הם polyphagous מאוד נחשב לאחד החשובים ביותר נמטודות צמחים טפילים מבחינה כלכלית. מיקרוסקופית השלב השני נעורים (J2), נשל פעם הביצה, הוא השלב של התולעת. J2s את בוקעים מן הביצים, לנוע בחופשיות באדמה בתוך הסרט של מים, ולאתר טיפים שורש של מיני צמחים מתאימים. לאחר חדירה שורש הצמח, הם נודדים אל הגליל כלי הדם שם הם להקים אתר האכלה וליזום האכלה באמצעות stylets שלהם. האתר האכלה תאיים מורכב מספר תאים הנקראים multinuclear מוגדלים של התאים ענק של דבר נוצרים תאים שעברו karyokinesis (חזר מיטוזה) ללא cytokinesis. תאים pericycle השכנות הפרד להגדלה בגודל והוליד המרה רגילה או הקשר שורש, סימפטום אופייני של זיהום שורש הקשר נמטודות. לאחר ההאכלה הוא יזם, J2s להיות פעילים ובטלdergo שלושה molts נוספים להיות מבוגרים. הנקבה הבוגרת מטילה ביצים 150-250 במטריצה דביקות או מתחת לפני השטח של השורש. מן הביצים בוקעים J2s זיהומיות חדשים ולהתחיל מחזור חדש. שורש הקשר מחזור החיים נמטודות הושלמה ב 4-6 שבועות 26-28 ° C.
כאן אנו מציגים את הפרוטוקול המסורתית להדביק צמחים הגדלים בעציצים, עם השורש, ומשלב את נמטודות ואת שתי שיטות מבחני תפוקה גבוהה. השיטה הראשונה תפוקה גבוהה משמש בצמחים בעלי זרעים קטנים כגון עגבניות ואילו השני הוא לצמחים בעלי זרעים גדולים כגון שעועית cowpea משותף. זרעים גדולים לתמוך בצמיחה שתיל ממושך עם תוסף תזונתי מינימלי. Assay 1 תפוקה גבוהה מנצל שתילים שגודלו חול מגשי בעוד הצמחים assay השני מגדלים שקיות בהעדר אדמה. נרתיק גידול שתיל עשוי הפתיל 15.5 x 12.5cm נייר, מקופל בראש להקים שוקת 2 ס"מ עמוק שבו זרע או שתיל ממוקמת.הפתיל נייר נכלל בתוך כיס פלסטיק שקוף. אלה שקיות הצמיחה לאפשר תצפית ישירה של זיהום תסמיני נמטודות, מהחוצפה של שורשים לייצור המוני ביצה, מתחת לפני השטח של כיס שקוף. שתי השיטות לאפשר את השימוש הצמחים הוקרן, לאחר phenotyping, למעבר או הזרעים הייצור. יתרון נוסף של השימוש שקיות הצמיחה היא הדרישה שטח קטן בגלל שקיות מאוחסנים בתיקיות פלסטיק תלויים מדפים מסודרים.
Protocol
1. שתיל עגבניות הצמיחה סירים ומגשים
- בשביל הדלי, מבחני עגבניות זרעי צמחים בסיר אחד אדמה אורגני עשיר כגון תמהיל סאנשיין. לשמור בחממה ב 22-28 ° C. לאחר הנביטה, לדשן פעם בשבוע עם נס-Gro.
- כשבועיים לאחר הנביטה, בשלב נכון עלים 2, השתלת בנפרד את השתילים לתוך הסירים (10 ס"מ קוטר ו -17 ס"מ בעומק) מלא אדמה חולית סטרילית המכילה חול 90% ומערבבים אורגני 10%. הוסף Osmocote דשן שחרור איטי ולשמור בחממה ב 22-28 מעלות צלזיוס למשך שבועיים. המשך להפרות צמחים פעם בשבוע עם נס-Gro.
- עבור תפוקה גבוהה המסכים, זרעי צמחים ישירות מגשי באדמה חולית, מכסים את המגש בניילון נצמד ולשמור עד נביטה לעיל. לאחר הנביטה, להוסיף Osmocote דשן שחרור איטי ולדשן פעם בשבוע עם נס-Gro.
2. Cowpea צמיחה בתיקי שתיל
- Seeds הם מונבטים או בצלחת פטרי, מצופה בכמה שכבות של נייר Kimwipe, והועברו ביחידות אל שקיות או ממוקם ישירות לתוך חריץ הנייר של הכיס ואת מונבטים.
- מניחים את שקיות הפלסטיק הקובץ בתיקייה תלוי, 2 לכל תיקייה, ולסדר את התיקיות במעמד במצב אנכי. מניחים את המדף בחדר בסביבה מבוקרת, שמרו על טמפרטורה של 25-28 מעלות צלזיוס ו - 16 שעות אור / 8 מחזור H כהה. Racks גם יכול להישמר בחממה, אך דורשים נייר או עטיפת נייר נוקשה להציב על המדף משני צידי הגבעולים צמח, כדי להפחית את פוטנציאל זיהום פטרייתי.
- את שקיות המים פעם או פעמיים ביום עם מים אוסמוזה הפוכה. בערך 10 עד 14 יום לאחר זריעה, כאשר מערכת שורשים נאותה עם טיפים שורש שלישוני פיתחה (איור 1), את השתילים מוכנים חיסון.
3. הפקת ביצים נמטודות
הפקת הggs מהשורשים נגועים הוא שונה מכל פרוטוקול שפותח על ידי Hussey ו בארקר (1973).
- שלושה עד ארבעה ימים לפני חיסון נמטודות, לחלץ השורש קושר את הביצים נמטודות מהשורשים עגבניה נגועים. לפני תחילת שאיבת הביצית, לשטוף את אזור העבודה ביסודיות עם מים חמים, כדי למנוע זיהום. גם לשטוף במים חמים בלנדר, שני דליים, רשת תיל תמיכה, פטיש גומי, שלוש הנפות של 425, 90 ו 25 צמצם מיקרומטר, גליל המדורג ומספריים.
- לסדר את הנפות מלמעלה למטה בסדר הבא: 425, 90 ו 25 צמצם מיקרומטר. הביצים יאספו על מסננת 25 מיקרומטר בתחתית. שים את הנפות על רשת תיל נתמך בכיור. שים דלי מתחת רשת תיל לאסוף את הפתרון באמצעות ריצה.
- חותכים את החלק העליון של הצמח הנגוע (ים), המשמש כמקור הבידוד, וזורקים. מוציאים בזהירות את הצמח מהסיר. לשטוף את השורשים על ידי טבילה בדלי פלסטיק מלאה במים. יש לשטוף את השורשים נוסף לפי לרוץנינג מים עד חלקיקי הקרקע נשטפים מן השורשים.
- חותכים את השורשים עם מספריים לחתיכות קטנות. השלך את השורש.
- שים את השורשים הקצוצים מצמח אחד בצנצנת פלסטיק גדולה עם מכסה, להוסיף מספיק פתרון אקונומיקה 10% כדי לכסות את השורשים ולסגור את המכסה.
- לנער את הצנצנת המכילה את השורשים של 2 דקות.
- פתח את הצנצנת ושופכים את השורשים על גבי מסננת העליון ולשטוף עם צינור מחובר נחיר ערפול. לשטוף היטב עד שכל ריח אקונומיקה נעלם. השתמש בפטיש כדי לנצל את הצדדים של הנפות כדי למנוע סתימת נקבוביות מסננת.
- הסר את מסננת למעלה לשטוף את הפסולת על מסננת 2.
- הסר את מסננת 2 ולאסוף את הפסולת בסדר, הכולל את הביצים, מן מסננת האחרון. עם זרם עדין מבקבוק המים, להעביר את הפסולת בצד אחד של המסננת. איסוף פסולת ביצים לתוך כוס נקייה עם כמות מינימלית של מים.
- מסננת שוב מים שנאספודלי דרך מסננת 25 מיקרומטר לאסוף את כל הביצים שאולי נמלטים. יש לשטוף היטב עם מים בכוס לאסוף אותו.
- להשליך את פסולת צמח מ מסננת למעלה לשטוף ביסודיות את כל שלושת הנפות עם מים בלחץ. אל תיגע חלק רשת הנפות אשר יהא לעוות את גודל הנקבוביות.
4. נמטודות דגירה ביצים
- הקו סל מתכת נקייה עם כמה שכבות של נייר Kimwipe ולהתאים על צלחת פטרי מזכוכית. אפשר במרחק 1 ס"מ בין החלק התחתון של הסל ואת המנה.
- יוצקים את הביצים נמטודות שחולצו על הנייר בסל תיל. הוסף נוזלי מספיק כך את תחתית סל חוט נוגע פני המים אך אינו שקוע במים. תכסה את חלקו העליון עם מכסה פלסטיק.
- כל יום לבדוק אם יש אידוי מים ומוסיפים מעט מים בצלחת פטרי כדי התחתון של הסל נוגעת במים. זה ימנע את הביצים מהתייבשות.
- בכל יום אחר, לאסוף WAter המכיל את J2s מן צלחות פטרי לתוך הכוס. אם לא נעשה שימוש באופן מיידי, לאורר הבידוד שנאספו בטמפרטורת החדר בעזרת אוויר או במעבדה אספקת האוויר הנוצר על ידי משאבת האקווריום. השתמש הבידוד aerated בתוך 2 ימים. J2s ניתן לגבות מן הבקיעה להקים על פני תקופה של 6-8 ימים.
5. רוט עגבניות זיהום בעציצים או מגשים והערכת זיהום
- השתמש שלוש aliquots של נמטודות שנאספו כדי לספור את מספר J2s בשקופית לספור או צלחת, לחשב את הממוצע ולקבוע את עוצמת הקול הרצויה חיסון. בדרך כלל 3000 J2s משמשים לכל צמח בעציצים ו -500 J2s עבור הצמחים הגדלים מגשי שתיל.
- מערבבים את הבידוד על צלחת ערבוב המגנטי במהירות נמוכה.
- לפני לחסן את הצמחים, לוודא כי הקרקע לחה אך לא רטובה מדי. עבור חיסון הסיר, לעשות שלושה חורים בעומק של 1/2 סיר על בחול סביב כל מערכת עגבניות שורש באמצעות עיפרון (איור 2
- עבור תפוקה גבוהה מסכי במגשים, השתמש במחט שונה עצה חתום עם חורים בצידי דבוקות עצה פיפטה של 5 מ"ל יחד pipetter (איור 3) כדי לספק את J2s לתוך האדמה. לחלופין, ניתן לשלוח נמטודות כמו בשלב 5.3.
- לשמור על הצמחים בחממה ב 24-27 מעלות צלזיוס למשך שישה עד שמונה שבועות. המשך להפרות פעמיים בחודש עם הנס-Gro.
- להערכת זיהום, להסיר בזהירות את הצמחים מן הסירים לשטוף את השורשים (כפי שמתואר בשלב 3.3).
- כתם ההמונים ביצים כחולות על ידי הצללה השורשים של 1 מ"ג / ל 'erioglaucine, במשך 15 דקות.
- יש לשטוף את השורשים במים ולהעריך על ידי ספירת ההמונים ביצה צבעונית במערכת השורש היחיד. זכוכית מגדלת שולחן מואר יכול לשמש כדי לעזור לדמיין את המוני ביצים.
- אם הצמחים הוקרן יש צורך גרם נוסףמחקרים enetic, לא לחתוך את צמרות לפני הכביסה השורשים להערכה. לאחר מכתים והספירה ההמונים ביצה, לשתול את השתילים בקרקע אורגנית, לגזום את ראשי בכבדות כדי להפחית את הדיות, ולשמור בחממה.
6. Cowpea זיהום רוט בתיקי והערכת זיהום
- ספור את הבידוד נמטודות ומערבבים בצלחת בחישה מגנטי, כמתואר לעיל.
- מוציאים את שקיות מהתיקיות תלויים ומניחים על משטח אופקי. מחסן לכל כיס עם 1500 J2s ב 5 מ"ל. הרם את מכסה הפלסטיק של כיס ולהפיץ את נמטודות באופן שווה על פני השטח של השורשים.
- לשמור את שקיות במצב מאוזן על 24 שעות לאחר חיסון, מכוסה בנייר כהה כדי להוציא לאור, ולאחר מכן לחזור התיקיות תלויים בתא הגידול.
- להשקות את הצמחים לפי הצורך, פעם ביום או פעמיים, עם פתרון חצי כוח של הוגלנד (הוגלנד & ארנון, 1950, טבלה מס '1
- כ 30 ימים (טווח 28-35 ימים) לאחר חיסון, להחדיר בכל כיס עם כ 10-20 מ"ל של erioglaucine מ"ג / ל '75. לשמור את שקיות מוצפים עם צבע במצב אופקי בין לילה.
- מסננים את שקיות ולהעריך את מערכות השורשים על ידי ספירת ההמונים ביצה תחת זכוכית מגדלת שולחן מואר.
- אם הצמחים הוקרן יש צורך במחקרים גנטיים נוספים או עבודה פורייה, שלוף בזהירות את השורשים מהשתלת נייר, באדמה אורגנית סירים ולשמור בחממה.
7. נציג תוצאות
בשלבים המתאימים של צמחי עגבניות cowpea עבור חיסונים נמטודות עבור שתי מערכות המתוארות מוצגות דמויות1 ו 2. בנוסף, דוגמאות היטב נגועים שורשי עגבניות cowpea מוצגים איורים 4 ו -5. כמו רוב מסכי עמידות למחלות, מומלץ להשתמש לפחות 6-10 צמחים לכל גנוטיפ עבור חיסון נמטודות כדי לחשב את הממוצע של שיעור זיהום. וריאציה זיהום נמטודות בין צמחים, של גנוטיפ זהה, ניתן להפחית באמצעות גודל המפעל אחיד סכום מדויק מסירה של הבידוד.
השימוש מגשי שקיות צמיחה מאפשר הקרנה של מאות עד אלפי צמחים בחלל גידול קטן. שקיות הצמיחה גם לאפשר מהיר ויעיל שאינו הרסני הערכה של השורש קושר זיהומים נמטודות ללא צורך שורשים כביסה (איור 4).
באיור 1. 2 בת שבוע במפעל cowpea גדל בכיס ומוכן שורש הקשר NEMAtode חיסון.
איור 2. 3 שבועות בן צמח עגבניות מוכן חיסון שורש הקשר נמטודות.
איור 3. מחט שונה עצה ו פיפטה המשמש חיסון תפוקה גבוהה של נמטודות. בתחתית המחט נחתם ושלוש קבוצות של חורים שנקדחו מחט באמצעות קרן לייזר. ואז, המחט שונה היה מודבק על קצה פיפטה של 5 מ"ל.
איור 4. שורש עגבניות מערכת נגוע השורש קושר את נמטודות.
איור 5. מערכת השורש cowpea עם המוני מוכתמים ביצה erioglaucine 30 יום לאחר חיסון גדל ב28 ° C.
Discussion
יש שני שלבים קריטיים עבור המסך נמטודות מוצלח: הכנת הבידוד זיהומיות מאוד באמצעות צמחים בשלב התפתחותי תקין. שיעור הבקיעה של שורש, פקעת ביצים נמטודות הוא משתנה מאוד ונע בין 5 ל - 50%. לכן כדי להשיג רמות אופטימליות של הפתח J2s זיהומיות ביותר, תשומת לב רבה יש לשלם מיצוי הליכים ביצה הבקיעה. הביצים צריכים להיות חשופים אקונומיקה למשך זמן מינימלי אקונומיקה יש לשטוף היטב את התערובת מן השורש. כאשר הבקיעה את הביצים, slurry המכיל את הביצים לא צריך להיות שקוע במים. בנוסף, יש להימנע לשפוך את הביצים לתוך צלחת פטרי הבסיסי שבו בקעו צעירים נאספים. דרך אחת להימנע לשפוך את הביצים תוך כדי תהליך הבקיעה הוא לא להוסיף מים ישירות Kimwipe כמו נייר עשוי להישבר. במקום להוסיף את המים ישירות אל צלחת פטרי.
לקבלת התוצאות הטובות ביותר, השתמש J2s שבקעו זה עתה. אם hatcשיעור H נמוך הבידוד יותר יש צורך, J2s ניתן לאחסן על 15 מעלות צלזיוס למשך תקופה ארוכה. לחמם את הבידוד המאוחסן בטמפרטורת החדר כדי להחיות את נמטודות שקדמו חיסון. עם זאת, אין לאחסן את J2s לתקופות ממושכות אפילו 15 מעלות צלזיוס כ J2s מורעבים לא להדביק ביעילות.
שתילים צעירים בשלב ההתפתחותי הטוב ביותר עבור חיסון שורש הקשר נמטודות. עם זאת, זה צריך להיות מאוזן עם הקמתה של מערכת שורשים נאותה לספק בכמות מספקת של טיפים שורש כמו נקודות הכניסה עבור J2s את. שמירה על מצב אופטימלי גידול צמחים חיוני גם עבור המסכים. הימנע יתר משקים צמחים במיוחד אלה גדל שקיות. יתר משקה את שקיות, כפי שצוין על ידי מים עומדים בבית התחתון של הנרתיק, יכול לקדם את צמיחת הפטרייה ולצמצם בריאות השורש.
עם הערכה מבחני הן עוד יותר של זיהום נמטודות וחישוב של מספר ביצים / מערכת שורש וביצים / גרם freהשורש ש ניתן לבצע. עבור מבחני העגבניות, שורשים בודדים שקל וביצים שחולצו כפי שתואר על הבידוד הכנה (סעיף 3). בעת עיבוד של מספר גדול של דגימות צמחים, מערכות שורש בודדים ניתן macerated באמצעות בלנדר להפקת הביצים. מספר הביצים יש לספור לפחות שלושה aliquots והביצים / גרם שורש טרי של מערכת מחושב. עבור מבחני כיס, מערכת השורשים היא הסירה את הכנס נייר, שקל, וביצים חילוץ.
Disclosures
אין לנו מה למסור.
Acknowledgments
מחקר Kaloshian המעבדה ממומנת על ידי מענק מטעם ארצות הברית המכון הלאומי המזון והחקלאות (2007-35607-17765). מחקר רוברטס המעבדה ממומנת על ידי תרומות של ארצות הברית הסוכנות לפיתוח בינלאומי (GDG-G-00-02-00012-00 ו-EDH-00-07-00005) ו יבש קליפורניה עמוד שעועית המייעצת.
References
- Bhattarai, K. K., Xie, Q. G., Mantelin, S., Bishnoi, U., Girke, T., Navarre, D. A., Kaloshian, I. Tomato susceptibility to root-knot nematodes requires an intact jasmonic acid signaling pathway. Mol. Plant Microbe Interact. 21, 1205-1214 (2008).
- Ehlers, J. D., Matthews, W. C., Hall, A. E., Roberts, P. A. Inheritance of a broad-based form of root-knot nematode resistance in cowpea. Crop Sci. 40, 611-618 (2000).
- Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. Calif. Agric. Exp. Stn. Circ. 347, (1950).
- Hussey, R. S., Barker, K. R. A comparison of methods of collecting inocula of Meloidogyne spp., including a new technique. Plant Dis. Rep. 57, 1025-1028 (1973).
- Martinez de Ilarduya, O., Moore, A. E., Kaloshian, I. The tomato Rme1 locus is required for Mi-1-mediated resistance to root-knot nematodes and the potato aphid. Plant J. 27, 417-425 (2001).
- Matkin, O. A., Chandler, P. A. The U.C.-type soil mixes. In: The U.C. system for producing healthy container-grown plants. Calif. Agric. Exp. Stn. Manual. Baker, K. F. 23, 68-85 (1957).
- Omwega, C. O., Roberts, P. A. Inheritance of resistance to Meloidogyne spp. in common bean and the genetic basis of its sensitivity to temperature. Theor. Appl. Genet. 83, 720-726 (1992).
- Omwega, C. O., Thomason, I. J., Roberts, P. A. A nondestructive technique for screening bean germplasm for resistance to Meloidogyne incognita. Plant Dis. 72, 970-972 (1988).
- Perry, R. N. Root-Knot Nematodes. Moens, M., Starr, J. L. , CABI Publishing. Wallingford. (2009).
- Starr, J. L., Cook, R. Resistance to Parasitic Nematodes. Bridge, J. , CABI Publishing. Wallingford. (2002).
