Schermi throughput elevato e basso con Nematodi galligeni Meloidogyne spp. Published: March 12, 2012 doi: 10.3791/3629

DOI

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Hagop S. Atamian¹, Philip A. Roberts¹, Isgouhi Kaloshian¹

¹Department of Nematology, University of California, Riverside

Summary

Due metodi diversi per le piante schermo con nematodi galligeni sono descritti. Gli approcci descritti includono high-throughput schermi con nematodi in modo non distruttivo facilitare l'uso di queste piante in programmi di allevamento.

Abstract

Nematodi galligeni (Meloidogyne genere) sono parassiti obbligati delle piante. Sono estremamente polifago e considerato uno dei nematodi parassiti economicamente più importanti. Il microscopico seconda fase giovanile (J2), una volta mutate nell'uovo, è la fase infettiva. I J2S schiudono dalle uova, muoversi liberamente nel terreno all'interno di una pellicola d'acqua, e individuare punte delle radici delle specie di piante adatte. Dopo aver oltrepassato la radice, la loro migrazione verso il cilindro vascolare, dove creare un sito di alimentazione e avviare l'alimentazione usando i loro stiletti. Il sito di alimentazione multicellulare è formato da diverse cellule ingrandite multinucleari chiamate 'cellule giganti', che sono formate da cellule che sottoposti a cariocinesi (ripetuto mitosi) senza citochinesi. Le cellule si dividono e si pericycle vicini allargare dimensioni dando origine ad una fiele tipico o nodo radice, il sintomo caratteristico di root-nodo infezione nematode. Una volta che l'alimentazione è iniziato, J2S diventano sedentari e delle Nazioni Unitedergo tre mute supplementari per diventare adulti. La femmina adulta depone 150-250 uova in una matrice gelatinosa sopra o sotto la superficie della radice. Dalle uova si schiudono nuovi J2S infettive e iniziare un nuovo ciclo. La radice-nodo ciclo di vita del nematode si completa in 4-6 settimane a 26-28 ° C.

Qui vi presentiamo il protocollo tradizionale per infettare piante, coltivate in vaso, con nematodi galligeni e due metodi di analisi high-throughput. Il primo high-throughput metodo viene utilizzato per le piante con semi di piccole dimensioni come pomodoro, mentre il secondo è per le piante con semi grandi come fagioli fagiolo e comune. Semi di grandi dimensioni sostenere la crescita estesa piantina con un minimo supplemento nutrizionale. Il primo test un'elevata utilizza piantine coltivate in sabbia in vassoi, mentre negli impianti secondo saggio sono coltivate in bustine in assenza di terreno. Il sacchetto crescita delle piantine è fatto di un 15,5 x 12,5 centimetri stoppino di carta, piegata in alto per formare un 2-cm profondità trogolo in cui è posto il seme o piantina. Ilstoppino di carta è contenuto all'interno di un sacchetto di plastica trasparente. Questi sacchetti di crescita permettono l'osservazione diretta dei sintomi di infezione, i nematodi irritanti di radici e di massa produzione di uova, sotto la superficie di un sacchetto trasparente. Entrambi i metodi consentono l'utilizzo degli impianti schermati, dopo fenotipo, per attraversare o semi produzione. Un ulteriore vantaggio dell'uso di sacche di crescita è l'ingombro ridotto perché buste vengono memorizzati in plastica cartelle sospese disposti in rack.

Protocol

1. Pomodoro crescita delle piantine in vasi e vassoi

1. Per i saggi vaso, semi di piante di pomodoro in un piatto unico in un organico ricco di suolo, come mix sole. Mantenere in una serra a 22-28 ° C. Dopo la germinazione, concimare una volta alla settimana con Miracle-Gro.
2. Circa due settimane dopo la germinazione, la vera foglia in due fasi, singolarmente trapiantare le piantine in vasi (10 cm di diametro e 17 cm di profondità) riempiti con terreno sabbioso sterile contenente il 90% sabbia e 10% di mix organico. Aggiungi Osmocote concime a lenta cessione e di mantenere in una serra a 22-28 ° C per due settimane. Continuare a concimare le piante una volta alla settimana con Miracle-Gro.
3. Per high-throughput schermi, semi di piante direttamente in vassoi in terreno sabbioso, coprire il vassoio con pellicola trasparente fino alla germinazione e mantenere come sopra. Dopo la germinazione, aggiungere Osmocote concime a lenta cessione e concimare una volta alla settimana con Miracle-Gro.

2. La crescita Cowpea in buste Seedling

1. SI responsabili politici sono sia germogliato in una capsula di Petri, rivestito con diversi strati di carta Kimwipe, e trasferiti singolarmente ai sacchetti o inserito direttamente nella scanalatura di carta del sacchetto e germinato.
2. Mettere i sacchetti di plastica in una cartella di file di sospensione, due per ogni cartella, e organizzare le cartelle in un rack in posizione verticale. Inserire la griglia in un ambiente controllato camera mantenuta ad una temperatura di 25-28 ° C e 16 h di luce / 8 ore buio ciclo. Rack può anche essere mantenuto in una serra, ma richiedono un foglio di carta rigida o coperchio posizionato sulla cremagliera su entrambi i lati dei gambi delle piante, per ridurre il potenziale di contaminazione fungina.
3. Le buste d'acqua una o due volte al giorno con acqua ad osmosi inversa. Circa 10 a 14 giorni dopo la semina, quando un apparato radicale adeguato con punte delle radici terziarie si è sviluppata (Figura 1), le piante sono pronte per l'inoculo.

3. Estrazione di uova dei nematodi

Estrazione eGGS da radici infette è stato modificato da un protocollo sviluppato da Hussey e Barker (1973).

1. Tre o quattro giorni prima dell'inoculazione nematode, estrarre galligeni uova di nematodi dalle radici di pomodoro infetti. Prima di iniziare l'estrazione delle uova, lavare l'area di lavoro accuratamente con acqua calda per evitare la contaminazione. Anche lavare in acqua bollente un frullatore, due secchi, uno di sostegno rete metallica, un martello di gomma, tre setacci di 425, 90 e 25 micron di apertura, un cilindro graduato e le forbici.
2. Stack dei setacci dall'alto verso il basso nel seguente ordine: 425, 90 e 25 micron di apertura. Le uova vengono raccolte sul setaccio da 25 micron in basso. Mettere i setacci su una rete metallica supportato in un lavandino. Mettere un secchio sotto la rete metallica per raccogliere il run-through soluzione.
3. Tagliare le cime della pianta infetta (s), utilizzati come fonte di inoculo, e scartare. Rimuovere delicatamente la pianta dal vaso. Lavare le radici mediante immersione in un secchio di plastica pieno d'acqua. Lavare le radici di età inferiore a correreacqua corrente fino a quando le particelle di terreno vengono lavate via dalle radici.
4. Tagliare le radici con le forbici in piccoli pezzi. Smaltire il fittone.
5. Mettere le radici tagliate da un unico stabilimento in un grande vaso di plastica con un coperchio, basta aggiungere solo una soluzione di candeggina al 10% per coprire le radici e chiudere il coperchio.
6. Scuotere il vaso contenente le radici per 2 min.
7. Aprire il vaso e versare le radici sulle setaccio superiore e lavare con un tubo collegato a un ugello di appannamento. Lavare bene fino a quando tutto l'odore di candeggina è andato. Usare un martello per toccare i lati dei setacci per evitare di intasare i pori setaccio.
8. Rimuovere il setaccio superiore e sciacquare i detriti sul setaccio secondi.
9. Rimuovere il setaccio secondo e raccogliere i detriti sottile, che comprende le uova, dal setaccio ultimo. Con un flusso delicato da una bottiglia d'acqua, spostare i detriti di un lato del setaccio. Raccogliere i detriti e le uova in un becher pulito con una quantità minima di acqua.
10. Sieve ancora una volta l'acqua raccolta nellasecchio attraverso il setaccio da 25 micron di raccogliere tutte le uova che possono essere sfuggiti. Sciacquare bene con acqua e raccogliere nel bicchiere stesso.
11. Eliminare i detriti pianta dal setaccio superiore provvedendo a lavare accuratamente tutti e tre i vagli con acqua in pressione. Non toccare la parte maglie dei setacci in quanto può alterare la dimensione dei pori.

4. Nematodi uova da cova

1. Linea un cestino di metallo pulito, con pochi strati di carta Kimwipe e stare su un piatto di vetro Petri. Consentire un 1-cm di distanza tra il fondo del cestello e il piatto.
2. Versare le uova nematodi estratti sulla carta nel cestello. Aggiungere abbastanza liquido in modo che il fondo del cestello tocca la superficie dell'acqua, ma non è immerso in acqua. Coprire la parte superiore con un coperchio di plastica.
3. Ogni giorno controllare l'evaporazione dell'acqua ed aggiunge dell'acqua nella scatola di Petri in modo che il fondo del cestello tocca l'acqua. Questo consentirà di evitare le uova si asciughi.
4. Ogni altro giorno, raccogliere il WAter che contiene i J2S dai piatti Petri in un becher. Se non utilizzato immediatamente, aerare l'inoculo raccolti a temperatura ambiente utilizzando una fornitura dell'aria di laboratorio o aria generata da una pompa acquario. Utilizzare l 'inoculo aerato entro 2 giorni. J2S possono essere raccolte dalla schiusa istituito per un periodo di 6-8 giorni.

5. Pomodoro infezione Root in vasi o vassoi e valutazione di infezione

1. Utilizzare tre aliquote dei nematodi raccolti per contare il numero di J2S in una diapositiva di conteggio o un piatto, calcolare la media e determinare il volume desiderato per l'inoculo. Tipicamente 3000 J2S vengono utilizzati per pianta in vaso e 500 J2S per le piante coltivate in vassoi piantine.
2. Mescolare il inoculo su una piastra di agitazione magnetica a bassa velocità.
3. Prima di inoculare le piante, assicurarsi che il terreno è umido ma non troppo bagnato. Per l'inoculazione pot, fare tre fori di circa mezzo piatto di profondità sotto la sabbia attorno ad ogni sistema di radici di pomodoro con una matita (figura 2
4. Per gli high-throughput schermi in vassoi, utilizzare un ago modificato punta sigillata con fori sui lati incollati a 5 ml punta della pipetta lungo una pipettatura (Figura 3) di consegnare i J2S nel terreno. In alternativa, nematodi possono essere forniti come nel passaggio 5,3.
5. Mantenere le piante in una serra a 24-27 ° C per sei-otto settimane. Continuare a concimare due volte al mese con Miracle-Gro.
6. Per la valutazione di infezione, rimuovere con attenzione le piante dai vasi e lavare le radici (come descritto al punto 3.3).
7. Colorare le masse di uova azzurre immergendo le radici in 1 mg / L erioglaucine, per 15 min.
8. Lavare le radici in acqua e valutare contando le masse di uova colorate sul sistema radicale individuale. Una lente di ingrandimento scrivania illuminata può essere usato per aiutare a visualizzare le masse di uova.
9. Se le piante schermati sono necessarie per g ulteriorestudi enetic, non tagliare le cime prima di lavare le radici per la valutazione. Dopo la colorazione, e contando le masse di uova, trapiantare le piantine in organico del suolo, potare le cime pesantemente per ridurre la traspirazione, e mantenere in una serra.

6. Cowpea infezione Root in sacchetti e valutazione di infezione

1. Contare il nematode inoculo e mescolare in un piatto di agitazione magnetica come descritto in precedenza.
2. Rimuovere le buste delle cartelle sospese e posto su una superficie orizzontale. Inoculare ogni busta con 1500 J2S in 5 ml. Sollevare il coperchio di plastica del sacchetto e distribuire i nematodi uniformemente sulla superficie delle radici.
3. Tenete i sacchetti in posizione orizzontale per 24 h dopo l'inoculazione, coperto con carta scura per escludere la luce, per poi tornare alle cartelle sospese nella camera di crescita.
4. Annaffiare le piante, se necessario, una volta o due volte al giorno, con trattamento di mezza forza la soluzione di Hoagland (Hoagland e Arnon, 1950; Tabella 1
5. Circa 30 giorni (range 28-35 giorni) dopo l'inoculazione, infondere ogni busta con circa 10-20 ml di 75 mg / L erioglaucine. Mantenere i sacchetti inondati con il colorante in posizione orizzontale durante la notte.
6. Scolate i sacchetti e valutare i sistemi di root contando le masse di uova sotto una lente d'ingrandimento scrivania illuminata.
7. Se le piante schermati sono necessari per ulteriori studi genetici o di lavoro di allevamento, estrarre delicatamente le radici dal trapianto carta, in organica del suolo in vaso e di mantenere in una serra.

7. Risultati rappresentativi

Le fasi appropriate di piante di pomodoro e cowpea per vaccinazioni nematodi per i due sistemi descritti sono mostrati nelle Figure1 e 2. Inoltre, esempi di ben-infette radici di pomodoro e cowpea sono mostrate nelle figure 4 e 5. Come nella maggior parte degli schermi resistenza alle malattie, è consigliabile utilizzare almeno 6-10 piante per genotipo per l'inoculazione nematode per calcolare la media del tasso di infezione. Variazione infezione nematodi tra piante, dello stesso genotipo, può essere ridotto utilizzando impianti e dimensioni uniformi quantità precisa e di consegna di inoculo.

L'uso di vassoi e sacchetti di crescita consente lo screening di centinaia di migliaia di piante in uno spazio di crescita di piccole dimensioni. Sacchetti crescita consentono anche veloce ed efficiente valutazione non distruttiva di galligeni infezioni da nematodi senza necessità di radici di lavaggio (Figura 4).

Figura 1. Una settimana-vecchio impianto di due fagiolo cresciuto in un sacchetto e pronte per root-knot NEMAtode inoculazione.

Figura 2. A tre week-vecchia pianta di pomodori pronti per la root-knot inoculazione nematode.

Figura 3. Un ago modificato e puntale usato per high-throughput inoculazione di nematodi. Il fondo di un ago è stato sigillato e tre serie di fori sono stati perforati nella ago utilizzando un fascio laser. Poi, l'ago modificata è stata incollata a 5 ml punta della pipetta.

Figura 4. Un sistema di radici di pomodoro infettato da nematodi galligeni.

Figura 5. Un apparato radicale cowpea con masse di uova colorate con erioglaucine 30 giorni post-inoculazione cresciuta a28 ° C.

Discussion

Ci sono due passaggi critici per uno schermo nematode successo: la preparazione di un inoculo altamente infettivo e utilizzando gli impianti in fase di sviluppo adeguato. Tasso di schiusa delle uova galligeni nematodi è altamente variabile e spazia tra il 5 - 50%. Quindi, per ottenere livelli ottimali di portello e J2S altamente infettivi, particolare attenzione deve essere posta l'estrazione delle uova da cova e le procedure. Le uova dovrebbero essere esposti alla candeggina per un periodo di tempo minimo e candeggina devono essere risciacquati bene dalla miscela di root. Quando cova le uova, l'impasto che contiene le uova non devono essere immerso in acqua. Inoltre, evitare di versare le uova nel piatto sottostante Petri dove sono raccolti i giovani nati. Un modo per evitare di versare le uova durante il processo di cova, non è quello di aggiungere l'acqua direttamente al Kimwipe della carta potrebbe rompersi. Invece aggiungere l'acqua direttamente alla piastra di Petri.

Per ottenere i migliori risultati, utilizzare J2S appena nati. Se il hatch tasso è basso e più inoculo è necessario, J2S può essere conservato a 15 ° C per un periodo più lungo. Scaldare l'inoculo conservato a temperatura ambiente per rivivere i nematodi prima inoculazione. Tuttavia, non conservare i J2S per periodi prolungati anche a 15 ° C come J2S affamati non in grado di infettare in modo efficiente.

Piantine giovani sono il miglior stadio di sviluppo per l'utente root-knot inoculazione nematode. Tuttavia, questo deve essere equilibrata con la formazione di un apparato radicale adeguato fornire un numero sufficiente di apici radicali come punti di entrata per i J2S. Il mantenimento di ottimali condizioni di crescita delle piante è essenziale anche per gli schermi. Evitare di venire l'acquolina in impianti appositamente quelli coltivati ​​in sacchetti. Over-irrigazione dei sacchetti, come indicato da acqua stagnante nel fondo della sacca, può promuovere la crescita fungina e diminuire salute radice.

Con entrambi i dosaggi di valutazione ulteriore infestazione da nematodi e calcolo del numero di uova / sistema di radici e uova / grammo di freradice sh può essere eseguita. Per i saggi di pomodoro, le radici individuali vengono pesati e uova estratte come descritto per la preparazione inoculo (sezione 3). Durante l'elaborazione numero elevato di campioni di piante, sistemi radicali singoli potevano essere macerata usando un miscelatore per l'estrazione delle uova. Il numero di uova deve essere contato in almeno tre aliquote e le uova / grammo di sistema radice fresca calcolato. Per i saggi sacchetto, il sistema della radice viene tirato fuori il foglietto di carta, pesati, e uova estratte.