根结线虫的高和低通量筛选根结线虫。 Published: March 12, 2012 doi: 10.3791/3629

DOI

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Hagop S. Atamian¹, Philip A. Roberts¹, Isgouhi Kaloshian¹

¹Department of Nematology, University of California, Riverside

Summary

屏幕植物根结线虫的两种不同的方法进行了阐述。所述方法包括高通量筛选，在一个非破坏性的方式，促进这些植物育种计划使用的线虫。

Abstract

根结线虫（ 根结线虫属）是专性植物寄生虫。他们是非常杂食性，并认为经济最重要的植物寄生线虫。第二阶段的微观少年（J2）蛋一次molted，是感染阶段。在J2S从卵孵化，在土壤内的水膜自由移动，并找到合适的植物品种的根尖。植物根系穿透后，他们对血管缸迁移，在那里建立一个饲养的网站，并开始喂养使用他们的口针。多细胞喂养的网站是由几个扩大多核细胞被称为“巨细胞”，形成从细胞进行有丝分裂（有丝分裂重复）没有胞质。邻近的中柱鞘细胞分裂和扩大规模产生典型的胆或根结，根结线虫感染的特点症状。一旦开始喂养，J2S成为久坐和联合国的三个额外molts dergo成为成年人。成年雌虫在根的表面上或下方的凝胶状基质150-250鸡蛋。从卵孵化新感染J2S并开始一个新的周期。的根结线虫的生命周期在4-6个星期内完成，在26-28°C。

在这里，我们目前的感染植物，生长在花盆里，根结线虫和两个高通量检测方法，传统的协议。用于小如番茄种子植物的第一个高通量的方法，而第二大种子植物如豇豆和菜豆。大粒种子，支持延长幼苗生长，以最小的营养补充品。第一个高通量检测采用幼苗生长在托盘，在沙子，而在第二个实验植物生长在土壤的情况下袋。幼苗生长袋是由一个15.5×12.5厘米纸灯芯，顶部折叠，形成一个2厘米深的槽，放置在种子或幼苗。 “纸灯芯包含一个透明塑料袋内。这些增长袋允许直接观察线虫感染症状，根和鸡蛋的大规模生产的拉毛，下一个透明袋的表面。这两种方法都允许使用的筛选植物，分型后，横过马路或在种子生产。增长袋使用一个额外的好处是因为袋挂在衣架安排在塑料文件夹中存储的小空间要求。

Protocol

1。番茄幼苗生长在花盆和托盘

1. 用于盆栽试验，在富含有机质的土壤，如阳光混合的单罐厂番茄种子。在温室保持在22-28°C。发芽后，施肥每周一次奇迹格罗。
2. 发芽后约两个星期，在这两个真正的叶阶段，移植到无菌的沙质土壤沙90％和10％的有机组合与充满盆（直径10厘米和17厘米深）单独苗。 Osmocote缓释肥料在温室两周保持在22-28°C。继续奇迹格罗每周一次的植物施肥。
3. 对于高通量筛选，直接在托盘在沙质土壤的植物种子，用保鲜膜覆盖的托盘，直到发芽，保持以上。发芽后，加Osmocote缓控释肥，施肥和每周一次的奇迹格罗。

2。豇豆幼苗生长袋

1. 小号电火工品是在培养皿​​中发芽，内衬几层Kimwipe纸，单独转移到袋或直接放在袋纸槽和发芽。
2. 挂着一个塑料文件夹，每个文件夹中放置袋，并安排在垂直位置的机架中的文件夹。放置在温度25-28°C和16 h光照/ 8 h黑暗周期保持在一个受控环境室的机架。机架也可以保持在温室，但需要陪衬或植物茎的两侧放置在机架上的僵硬的纸盖，以减少真菌污染的潜力。
3. 水袋与反渗透水，每天一次或两次。播种后约10至14天，已开发足够的根系统具有大专根尖（ 图1），苗接种准备。

3。线虫虫卵提取

电子商务的提取感染根GGS修改赫西和巴克（1973）开发了一个协议。

1. 线虫三到四天之前，提取感染番茄根部的根结线虫卵。鸡蛋提取开始之前，工作区用热水洗脸，彻底避免污染。也是在热水冲洗搅拌机，两桶水，丝网的支持下，橡胶锤，三筛425，90和25微米的孔径，量筒和剪刀。
2. 堆栈按照下列顺序从上到下筛：425，90和25微米的孔径。 25微米筛上的鸡蛋将被收集在底部。放在水槽支持丝网筛。丝网下把水桶收集贯通的解决方案。
3. 作为接种源，切断受感染的植物（S）的上衣，并丢弃。小心取出锅​​厂。根洗净，浸在装满水的塑料桶。下冲洗进一步运行的根源宁水，直到土壤颗粒从根部洗净。
4. 切剪刀切成小块的根源。处置的主根。
5. 把盖在一个大塑料瓶从单一植物切碎的根，刚够10％的漂白粉溶液覆盖的根源，并盖上盖子。
6. 摇动罐子含2分钟的根源。
7. 打开罐子，倒入到顶端筛根，并用软管连接到一个喷雾喷嘴。洗井，直到所有的漂白剂气味消失了。使用木槌挖掘，以避免堵塞筛孔筛双方。
8. 卸下顶部筛和冲洗的第二个筛子上的杂物。
9. 删除第二个筛子，并收取罚款的碎片，其中包括鸡蛋，从去年筛。从一瓶水的温柔流，将杂物筛一侧。收集到一个干净的烧杯中水的最低金额碎片和鸡蛋。
10. 筛一次水收集在通过25微米筛收集任何可能逃脱的蛋桶。用水冲洗干净，并收集在同一烧杯。
11. 丢弃从顶部筛植物碎片和压水彻底清洗所有三个筛子。请勿触摸网的一部分，因为它可能会扭曲孔径的筛子。

4。孵化线虫虫卵

1. 行清洁的金属与几层Kimwipe纸的篮子，适合在玻璃培养皿。允许一个篮子和盘子的底部之间的1厘米的距离。
2. 在纸张上提取的线虫虫卵倒在篮筐。加入足够的液体，使篮筐底部接触水面，但不是浸泡在水中。盖上一个塑料盖的顶部。
3. 每天检查水分蒸发，在培养皿中添加一些水，使篮子的底部接触的水。这将防止干燥鸡蛋。
4. 隔日，收集佤之三，包含到一个烧杯，培养皿J2S。如果不立即使用，实验室供气或水族馆泵产生的空气通气在室温下使用所收集的接种。使用2天之内的曝气接种。的J2S可能收集超过6-8天期间设立的孵化。

5。番茄根在花盆或托盘和评估感染感染

1. 使用三等分收集线虫计数的幻灯片或菜J2S数量来计算，计算平均值，并确定为接种所需的音量。通常3000 J2S使用单株盆栽植物种植在育苗盘和500 J2S。
2. 搅拌磁性板在低速搅拌接种。
3. 之前接种植物，确保土壤湿润，但不要太湿。锅接种，在每个番茄根系统使用铅笔周围的沙孔，深度约一半锅（ 图2
4. 对于托盘的高通量筛选，用孔上粘到5毫升枪头沿移液器（ 图3），提供入土壤J2S双方修改后的密封尖端针。此外，线虫可交付步骤5.3。
5. 温室中的植物保持在24-27°C的六到八周。继续奇迹格罗每月两次施肥。
6. 感染的评价，小心取出从盆的植物和洗根（步骤3.3中所述）。
7. 染色15分钟，淹没在1毫克/升erioglaucine根蓝色的蛋群众。
8. 水冲洗根和评估计数彩绘蛋群众对个别根系统。一个发光的桌子放大镜可以用来帮助可视化的蛋群众。
9. 如果筛选的植物都需要进一步Ğenetic研究，不削减洗涤前评价根的顶部。染色和计数的卵块后，移植在有机土壤的树苗，修剪顶部，大量减少蒸腾，并保持在一个温室。

6。豇豆根感染感染的邮袋和评价

1. 计数线虫接种和磁力搅拌板搅拌，如前面所述。
2. 删除水平的表面上悬挂的文件夹和地方的邮袋。接种5毫升在1500 J2S每个邮袋。提起袋的塑料盖，并均匀地分布在根表面的线虫。
3. 24小时后接种黑纸覆盖排除光，保持在一个水平位置的袋，然后返回到生长室吊夹。
4. 需要水的植物，一次或两次，每天，半强度霍格兰的解决方案（霍格兰德嫩，1950年， 表1
5. 接种后约30天（范围28-35天），注入约10-20毫升75毫克/升erioglaucine每个邮袋。保持一夜之间淹没在水平位置与染料袋。
6. 漏袋和评估计数照明办公桌放大镜下的蛋群众的根系统。
7. 如果筛选植物需要进一步的遗传研究或育种工作，精心拉出的根源，从纸张，移植在花盆里的土壤有机和保持在一个温室。

7。代表结果

两个系统的线虫接种番茄和豇豆植物的适当阶段，显示在图1和2。此外，番茄和豇豆感染根的例子在图4和图5所示。至于在大多数抗病屏幕的，最好是使用至少6-10％的基因型植物线虫来计算，平均感染率。相同的基因型，植物之间的感染线虫的变化，可以减少使用统一的工厂规模和准确的数量和交货的接种。

托盘和增长袋的使用，使筛选数百数以千计的植物在一个小的增​​长空间。增长袋也让没有必要洗根（ 图4）快速，高效的根结线虫感染的非破坏性评估。

图1。两个周龄的豇豆植物生长在一个小袋，并准备为根结NEMAtode接种。

图2。三个星期岁番茄根结线虫接种的准备。

图3。一种改进的针头和枪头，用于高通量的线虫接种。一针的底部是密封的，和3套孔钻针在使用激光束。然后，修改后的针粘到5毫升的枪头。

图4。感染根结线虫番茄的根系统。

一个豇豆染色erioglaucine接种后30天内增长的鸡蛋群众的根系统图5。28°C。

Discussion

有两个关键步骤为一个成功的线虫屏幕：一个高度感染接种和使用植物在适当的发展阶段的准备。根结线虫卵孵化率是充满变数和范围介于5 - 50％。因此，要获得最佳水平的舱口和高度传染性J2S必须支付给鸡蛋提取和孵化过程中，密切关注。鸡蛋应为最短的时间内暴露漂白和漂白剂应冲洗根混合。孵蛋时，泥浆含有鸡蛋不应该被淹没在水中。此外，避免蔓延到鸡蛋孵化的幼鱼收集底层的培养皿。避免溢出的鸡蛋在孵化过程中的一种方式是不加水直接到Kimwipe的文件有可能打破。而不是直接加水的培养皿中。

为了达到最佳效果，请使用新鲜孵化J2S。如果在hatch的速度低，需要更多的接种，J2S可以储存在15°C一段较长的时间。暖存储接种到室温复苏之前接种线虫。但是，不要长时间存放，J2S即使在15°C为饥饿J2S不会感染有效。

幼苗是最好的根结线虫接种的发展阶段。然而，这需要形成足够的根系统提供足够数量的根尖作为切入点，J2S平衡。保持最佳的植物生长条件也是至关重要的屏幕。避免过度浇水，特别是那些生长在袋。过度浇水袋，站立袋底部的水，能促进霉菌的生长，减少根健康。

与这两种检测方法的进一步评价线虫感染和鸡蛋/根系统和鸡蛋的数量计算/克的频率SH根可以执行。为番茄的检测中，个别基层称重和鸡蛋中提取描述为接种准备（第3节）。当处理大量的植物样本，个别根系统可以浸渍鸡蛋提取使用搅拌机。鸡蛋的数量应计算在至少三个等分和蛋/克鲜根系统计算。根系统的邮袋检测，被拉到纸张插入，称重，鸡蛋中提取。