Alto y Bajo Rendimiento pantallas con nematodos- Meloidogyne spp. Published: March 12, 2012 doi: 10.3791/3629

DOI

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Hagop S. Atamian¹, Philip A. Roberts¹, Isgouhi Kaloshian¹

¹Department of Nematology, University of California, Riverside

Summary

Dos métodos distintos a las plantas de pantalla con nematodos, se describen. Los enfoques descritos son de alto rendimiento de las pantallas con los nematodos en una manera no destructiva para facilitar el uso de estas plantas en los programas de mejoramiento.

Abstract

Los nematodos parásitos (del género Meloidogyne) son parásitos obligados de plantas. Son extremadamente polífaga y considerado uno de los nematodos parásitos de mayor importancia económica. El microscopio de la segunda etapa juvenil (J2), muda una vez en el huevo, es la etapa infecciosa. Los J2S salen de los huevos, se mueven libremente en el suelo dentro de una película de agua, y localizar puntas de las raíces de las especies vegetales adecuadas. Después de penetrar en la raíz de la planta, que migran hacia el cilindro vascular en el que establecer un sitio de alimentación e iniciar la alimentación con sus estiletes. El sitio de alimentación pluricelular está compuesto de varias células alargadas multinucleadas llamadas 'células gigantes' que se forman a partir de células que se sometieron a cariocinesis (se repite la mitosis) sin citocinesis. Las células vecinas periciclo dividir y ampliar de tamaño dando lugar a una agalla típica o nudo de la raíz, el síntoma característico de la infección por el nematodo agallador. Una vez que se inicia la alimentación, J2S una vida sedentaria y la ONUdergo tres mudas adicionales para convertirse en adultos. La hembra adulta pone 150-250 huevos en una matriz gelatinosa sobre o debajo de la superficie de la raíz. De los huevos eclosionan J2S nuevos infecciosos y comenzar un nuevo ciclo. El ciclo del nematodo del nudo de la vida se completa en 4-6 semanas a 26-28 ° C.

Aquí les presentamos el protocolo tradicional para infectar a las plantas, cultivadas en macetas con nematodos, y dos métodos de alto rendimiento ensayos. La primera de alto rendimiento método se utiliza para las plantas con semillas pequeñas como el tomate, mientras que el segundo es para las plantas con semillas grandes, como frijol caupí y común. Las semillas grandes apoyan el crecimiento de plántulas extendida con suplemento de nutrientes mínimos. El primer ensayo de alto rendimiento utiliza plántulas crecidas en arena en bandejas, mientras que en las plantas de ensayo segundo se cultivan en bolsas en la ausencia de suelo. El crecimiento de las plántulas bolsa está hecha de una mecha 15,5 x 12,5 cm de papel, doblada en la parte superior para formar un canal 2-cm de profundidad en la cual se coloca la semilla o las plántulas. Lamecha de papel se encuentra dentro de una bolsa de plástico transparente. Estas bolsas de crecimiento permiten la observación directa de síntomas de la infección por nematodos, escoriaciones de las raíces y la producción de masa de huevo, bajo la superficie de una bolsa transparente. Ambos métodos permiten el uso de las plantas examinadas, después de fenotipado, para el cruce o la producción de semillas. Una ventaja adicional del uso de bolsas de crecimiento es la necesidad de espacio pequeño, porque las bolsas de plástico se almacenan en carpetas colgantes dispuestos en bastidores.

Protocol

1. Crecimiento de las plántulas de tomate en macetas y bandejas

1. Para los ensayos de marihuana, semillas de plantas de tomate en una sola olla en un suelo rico en materia orgánica, como mezcla de sol. Mantener en un invernadero a 22-28 º C. Después de la germinación, fertilizar una vez a la semana con Miracle-Gro.
2. Unas dos semanas después de la germinación, en los dos verdadera hoja de etapa, el trasplante de forma individual las plantas de semillero en macetas (10 cm de diámetro y 17 cm de profundidad) con suelo de arena estéril que contiene un 90% de arena y 10% mezcla orgánica. Añadir Osmocote fertilizante de liberación lenta y mantener en un invernadero a 22-28 ° C durante dos semanas. Continuar para fertilizar las plantas una vez por semana con Miracle-Gro.
3. Para pantallas de alto rendimiento, las semillas de las plantas directamente en las bandejas en el suelo arenoso, cubrir la bandeja con papel plástico hasta la germinación y mantener que el anterior. Después de la germinación, agregar fertilizante de liberación lenta Osmocote y fertilizar una vez a la semana con Miracle-Gro.

2. Caupí crecimiento de las plántulas en bolsas

1. SEEDS son o bien germinaron en una placa de Petri, revestida con varias capas de papel Kimwipe, y se transfieren individualmente a bolsas o coloca directamente en la ranura de papel de la bolsa y se germinaron.
2. Coloque las bolsas en una carpeta de plástico colgando, dos por cada carpeta, y organizar las carpetas en un bastidor en posición vertical. Coloque el bastidor en una cámara controlada entorno mantenido a una temperatura de 25-28 ° C y 16 h luz / 8 h oscuridad ciclo. Bastidores también se puede mantener en un invernadero, pero requieren una lámina o cubierta de papel rígido colocado sobre el bastidor en ambos lados de los tallos de las plantas, para reducir el potencial de contaminación por hongos.
3. Las bolsas de agua una o dos veces por día con agua de ósmosis inversa. Alrededor de 10 a 14 días después de la siembra, cuando un sistema radicular adecuado, con puntas de las raíces terciarias ha desarrollado (Figura 1), las plántulas están listas para la inoculación.

3. La extracción de huevos de nematodos

Extracción de correoSGG de las raíces infectadas se modifica a partir de un protocolo desarrollado por Hussey y Barker (1973).

1. Tres o cuatro días antes de la inoculación de nematodos, extraer nódulo de la raíz huevos de nematodos de las raíces de tomate infectadas. Antes de iniciar la extracción de huevos, lave el área de trabajo a fondo con agua caliente para evitar la contaminación. También lave en agua caliente una. Licuadora, dos cubos, un soporte de malla de alambre, un mazo de goma, tres tamices de 425, 90 y 25 m de apertura, una probeta graduada y unas tijeras
2. Apilar los tamices de arriba a abajo en el siguiente orden: 425, 90 y 25 m de apertura. Los huevos se recogerán en el tamiz 25 micras en la parte inferior. Coloque los tamices sobre una rejilla metálica apoyada en el fregadero. Coloque una cubeta debajo de la malla de alambre para recoger la solución de ejecución a través.
3. Cortar la parte superior de la planta infectada (s), utilizados como la fuente del inóculo, y desechar. Retire con cuidado la planta de la maceta. Lavar las raíces por inmersión en un cubo de plástico lleno de agua. Aclarar las raíces más en ejecutarseNing agua hasta que las partículas del suelo son arrastradas desde las raíces.
4. Cortar las raíces con tijeras en trozos pequeños. Deshágase de la raíz principal.
5. Coloque las raíces cortadas de una sola planta en un frasco grande de plástico con tapa, agregar suficiente solución de lejía al 10% para cubrir las raíces y cierre la tapa.
6. Agite bien el frasco que contiene las raíces de 2 min.
7. Abra el frasco y vierte las raíces en el tamiz superior y lavar con una manguera conectada a una boquilla de nebulización. Lavar bien hasta que todo el olor a lejía se ha ido. Utilice un martillo para insertar las caras de los tamices para evitar la obstrucción de los poros del tamiz.
8. Retire el tamiz superior y enjuagar los restos en el segundo tamiz.
9. Eliminar el segundo tamiz y recoger la basura fina, que incluye los huevos, desde el tamiz pasado. Con una corriente suave de una botella de agua, mover los escombros a un lado del tamiz. Recoger la basura y los huevos en un recipiente limpio con una cantidad mínima de agua.
10. Tamizar una vez más el agua recogida en elcubeta a través del tamiz 25 micras para recoger los huevos que pueden haber escapado. Enjuague bien con agua y se acumulan en el mismo vaso.
11. Desechar los restos de la planta desde el tamiz superior y lavar a fondo los tres tamices con agua a presión. No toque la parte de malla de los tamices, ya que puede distorsionar el tamaño de los poros.

4. Los huevos para incubar de nematodos

1. Línea de una canasta de metal limpio, con unas pocas capas de papel Kimwipe y cabe en un plato de Petri de vidrio. Permitir una distancia de 1 cm entre la parte inferior de la cesta y el plato.
2. Verter los huevos de nematodos extraídos en el papel en el cesto de alambre. Añadir suficiente líquido de modo que la parte inferior de la cesta de alambre toca la superficie del agua, pero no está sumergido en agua. Cubra la parte superior con una tapa de plástico.
3. Cada día visita para la evaporación de agua y añadir algo de agua en la placa de Petri de modo que el fondo de la cesta toca el agua. Esto evitará que los huevos de la desecación.
4. Cada dos días, recogerá el water que contiene los J2S de las placas de Petri en un vaso de precipitados. Si no se utiliza inmediatamente, airear el inóculo recogido a temperatura ambiente usando un suministro de aire o de laboratorio de aire generada por una bomba de acuario. Utilizar el inóculo celular dentro de 2 días. J2S se puede recoger de la eclosión establecido durante un período de 6-8 días.

5. Infección de las raíces de tomate en macetas o bandejas y evaluación de la infección

1. Utilizar tres alícuotas de los nematodos recogidos para contar el número de J2S en una diapositiva o plato contando, calcular el promedio y determinar el volumen deseado para la inoculación. Normalmente se utilizan J2S 3000 por planta en macetas y 500 J2S para las plantas cultivadas en bandejas de plántulas.
2. Agitar el inóculo en una placa de agitación magnética a baja velocidad.
3. Antes de inocular las plantas, asegúrese de que el suelo está húmedo pero no mojado también. Para la inoculación olla, hacer tres agujeros alrededor de la mitad de la olla de profundidad en la arena alrededor de cada sistema de raíces de tomate con un lápiz (Figura 2
4. Para las pantallas de alto rendimiento en las bandejas, utilice una aguja modificada punta sellada con agujeros en los lados pegados a una punta de pipeta de 5 ml a lo largo de un pipeteador (Figura 3) para entregar los J2S en el suelo. Alternativamente, los nematodos se puede enviar como en el paso 5,3.
5. Mantener las plantas en un invernadero a 24-27 ° C durante seis a ocho semanas. Continuar para fertilizar dos veces al mes con Miracle-Gro.
6. Para la evaluación de la infección, retirar con cuidado las plantas de las macetas y lavar las raíces (como se describe en el paso 3,3).
7. Mancha de las masas de huevos azules, sumergiendo las raíces en 1 mg / L erioglaucine, durante 15 minutos.
8. Lavar las raíces en agua y evaluar contando las masas de huevos manchados en el sistema de raíz individual. Una lupa de mesa de iluminación se puede utilizar para ayudar a visualizar las masas de huevos.
9. Si las plantas apantallados son necesarios para g másLos estudios enetic, no corte la parte superior antes de lavar las raíces para su evaluación. Después de la tinción y recuento de las masas de huevos, trasplantar las plántulas en suelo orgánico, podar las copas en gran medida a reducir la transpiración, y mantener en un invernadero.

6. Caupí infección de las raíces en bolsas y evaluación de la infección

1. Contar el inóculo de nematodos y se agita en una placa de agitación magnética como se describió anteriormente.
2. Eliminar las bolsas de las carpetas colgantes y colocar en una superficie horizontal. Inocular cada bolsa con 1500 J2S en 5 ml. Levante la cubierta de plástico de la bolsa y distribuir los nematodos uniformemente sobre la superficie de las raíces.
3. Mantenga las bolsas en posición horizontal durante 24 horas después de la inoculación, cubierto con papel oscuro para evitar la luz, a continuación, volver a las carpetas que cuelgan en la cámara de crecimiento.
4. Riegue las plantas cuando sea necesario, una o dos veces al día, con Hoagland medio-concentración de la solución (Hoagland y Arnon, 1950, Tabla 1
5. Aproximadamente 30 días (rango 28-35 días) después de la inoculación, infusión de cada bolsa con alrededor de 10-20 ml de 75 mg / L erioglaucine. Mantener las bolsas inundadas con el colorante en una posición horizontal durante la noche.
6. Vacíe las bolsas y evaluar los sistemas de raíces, contando las masas de huevos en una lupa mesa iluminada.
7. Si las plantas examinadas son necesarios para posteriores estudios genéticos o el trabajo de reproducción, tire con cuidado las raíces del papel, el trasplante en suelo orgánico en macetas y mantener en un invernadero.

7. Los resultados representativos

Las etapas apropiadas de las plantas de tomate y caupi para inoculaciones de nematodos de los dos sistemas descritos se muestra en las figuras1 y 2. Además, los ejemplos de bien infectadas raíces de tomate y caupi se muestran en las figuras 4 y 5. Como en la mayoría de las pantallas de resistencia a enfermedades, es aconsejable utilizar al menos 6-10 plantas por genotipo para la inoculación de nematodos para calcular el promedio de la tasa de infección. La variación en la infección por nematodos entre las plantas, del mismo genotipo, se puede reducir mediante el uso de tamaño de la planta uniforme y la cantidad exacta y la entrega de inóculo.

El uso de bandejas y bolsas de crecimiento permite el cribado de los cientos de miles de plantas en un espacio pequeño crecimiento. Bolsas de crecimiento también permiten rápida y eficiente evaluación no destructiva de infecciones por nematodos agalladores sin necesidad de raíces de lavado (Figura 4).

Figura 1. Un dos semanas de edad planta caupi crecido en una bolsa y listo para agallador NEMATode la inoculación.

Figura 2. A tres semanas de edad, planta de tomate preparada para la inoculación nematodo agallador.

Figura 3. Una aguja modificado y punta de la pipeta utilizada para la inoculación de alto rendimiento de los nematodos. La parte inferior de una aguja se selló y tres conjuntos de agujeros se perforaron en la aguja utilizando un rayo láser. Entonces, la aguja modificado fue pegado a una punta de pipeta de 5 ml.

Figura 4. Un sistema de raíces de tomate infectadas con el nematodo agallador.

Figura 5. Un sistema de raíces de caupí, con masas de huevos teñidos con erioglaucine 30 días después de la inoculación crecido a28 ° C.

Discussion

Hay dos pasos fundamentales para una pantalla de nematodos éxito: preparación de un inóculo muy infecciosos y el uso de plantas en la etapa de desarrollo adecuado. Tasa de eclosión de huevos de nematodos nudo de la raíz es muy variable y oscila entre 5 a 50%. Por lo tanto para obtener niveles óptimos de escotilla y J2S altamente infecciosos, se debe prestar mucha atención a la extracción de huevos para incubar y de los procedimientos. Los huevos deben ser expuestos a cloro por un período mínimo de tiempo y cloro debe enjuagarse bien de la mezcla de las raíces. Cuando la eclosión de los huevos, la suspensión que contiene los huevos no deben ser sumergidas en agua. Además, evitar el derrame de los huevos en la caja de Petri subyacente, donde los juveniles nacidas son capturadas. Una forma de evitar el derrame de los huevos durante el proceso de incubación no es añadir agua directamente a la Kimwipe que el papel puede romperse. En su lugar se añade el agua directamente a la placa de Petri.

Para obtener los mejores resultados, utilice J2S recién nacidos. Si el HATCtasa h es baja y más inóculo se necesita, J2S puede ser almacenado a 15 ° C durante un período más largo. Caliente el inóculo almacenado a temperatura ambiente para revivir los nematodos antes de la inoculación. Sin embargo, no guarde los J2S durante períodos prolongados, incluso a 15 ° C como J2S muertos de hambre no se infectan de manera eficiente.

Las plántulas son la mejor etapa de desarrollo para la inoculación nematodo agallador. Sin embargo, esto tiene que ser equilibrada con la formación de un sistema radicular adecuado que proporcione un número suficiente de puntas de las raíces como puntos de entrada para los J2S. El mantenimiento de un estado óptimo crecimiento de las plantas también es fundamental para las pantallas. Evitar el exceso de riego las plantas especialmente los que crecen en las bolsas. El exceso de riego de las bolsas, como se indica por el agua estancada en la parte inferior de la bolsa, puede promover el crecimiento de hongos y disminuir salud de las raíces.

Con los dos ensayos de evaluación adicional de la infección por nematodos y el cálculo del número de huevos por sistema radicular y los huevos / gramo de frecuenciaraíz sh se puede realizar. Para los ensayos de tomate, las raíces individuales se pesan y se extrajeron los huevos como se describe para la preparación de inóculo (sección 3). Al procesar gran número de muestras de plantas, los sistemas individuales de raíz podría ser macerado utilizando un mezclador para la extracción de huevo. El número de huevos deben ser contados por lo menos en tres partes alícuotas y se calculan los huevos / gramo de sistema de raíces fresca. Para los ensayos de bolsa, el sistema de raíces es arrancado de la inserción de papel, se pesaron, y se extrajo huevos.