Artículo de método

Inyección subretiniana de vectores de terapia génica y células madre en el ojo del ratón

DOI:

10.3791/4286

⸱

25 de noviembre de 2012

 ,  ,  ,  , 
1Bernard and Shirlee Brown Glaucoma Laboratory, Department of Ophthalmology, Columbia University , 2Institute of Human Nutrition, College of Physicians & Surgeons, Columbia University , 3Omics Laboratory, University of Iowa , 4Department of Ophthalmology and Visual Sciences, University of Iowa

En este artículo

Resumen

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Esta técnica quirúrgica ilustra la inyección de vectores de terapia génica y las células madre en el espacio subretiniano del ojo del ratón.

Resumen

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La pérdida de visión afecta aproximadamente a 3,4 millones de personas en los Estados Unidos y se espera que aumente en los próximos años. 1 Recientemente, la terapia génica y el trasplante de células madre se han convertido en importantes herramientas terapéuticas para el tratamiento de la ceguera como resultado de las enfermedades degenerativas de retina. Varias formas de trasplante autólogo para la degeneración macular relacionada con la edad (AMD), como iris trasplante de células del epitelio pigmentario, han generado resultados alentadores, y los ensayos clínicos humanos han comenzado a otras formas de terapias con células madre y genes. 2 Estos incluyen RPE65 sustitución de genes terapia en pacientes con amaurosis congénita de Leber y un trasplante de células RPE humanas usando madre embrionarias (ES) de células en la enfermedad de Stargardt. 3-4 Ahora que hay vectores de terapia génica y células madre disponibles para el tratamiento de pacientes con enfermedades de la retina, es importante verificar estas terapias potenciales en modelos animales antes de aplicarIng. ellos en estudios con humanos. El ratón se ha convertido en un importante modelo científico para probar la eficacia terapéutica de los vectores de terapia génica y trasplante de células madre en el ojo. 5-8 En este artículo de vídeo, se presenta una técnica para inyectar vectores de terapia génica o células madre en el espacio subretiniano de el ojo del ratón mientras que minimiza el daño al tejido circundante.

Protocolo

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1. Montar dispositivos para la inyección subretiniana

  1. Compre o haga una aguja de 100 m de diámetro de un tubo capilar de vidrio. Esto se puede hacer manualmente mediante el uso de un Sutter P-97 extractor de pipeta u otro equipo similar. El extremo del tubo capilar se calienta y se retiró hasta que alcanza el diámetro deseado (100 micras). Una aguja de diámetro más pequeño se puede utilizar para vectores de terapia génica, sin embargo, este es el diámetro recomendado para la inyección de células sin daño a las células o al ojo. En comparación con agujas de acero, la aguja capilar de vidrio tiene una punta muy fina, pero romo, para permitir la visualización....

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Resultados

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Un dibujo del ojo del ratón se muestra con grandes estructuras marcadas para referencia, con flechas que muestran las ubicaciones de los procedimientos de inyección intravítrea tanto subretinal y quirúrgicos (puntas de flecha, Figura 1). Vectores de terapia génica, tales como el vector lentiviral lacZ (Figura 2), se puede inyectar el uso de estas ubicaciones. Además, las células madre, tales como células madre embrionarias de ratón (Figura 3), también se pueden.......

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Discusión

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Esta técnica de vídeo proporciona instrucciones para completar el procedimiento de inyección subretiniana quirúrgica con éxito, y asegurar que el vector de terapia génica o de células madre se colocan en la posición necesaria para tratar eficazmente la enfermedad oftálmica. Esta técnica permite la focalización de las células de la retina tales como el RPE o fotorreceptores, puesto que coloca los vectores de terapia génica o tejidos derivados de células madre en la proximidad de estas células. Los métodos anteriores invo.......

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Divulgaciones

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No hay conflictos de interés declarado.

Agradecimientos

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Investigación para Prevención de la Ceguera, la asistencia Experimental de Takayuki Nagasaki; Esta investigación cumple con la Declaración de ARVO para el Uso de Animales en Investigación Oftalmológica y Visual. KJW es apoyado por el NIH subvenciones 5T32EY013933 y 5T32DK007647-20. VBM es apoyado por el NIH subvención K08EY020530.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Nombre Empresa Catálogo Comentarios
0.8-1.10 x 100 mm Tubo capilar (vidrio) Kimble Glass, Inc. 34502 99
Flaming / Brown Micropipeta Puller Sutter Instrument P-97 Narishige microforge se puede utilizar en su lugar. Catálogo # MF-900
Sigmacote Sigma Aldrich SL2-25ML Silicona
Fosfato de Dubecco salina tamponada con cloruro de calcio y cloruro de magnesio Gibco-Invitrogen 14040-133
Safety-Lok 3/4G 25 x 12 ", set de muestras de sangre BD Vacutainer 367298
1 ml Sub-Q 265/8G Slip-punta de la jeringa Becton-Dickinson 309597
0.5-10 l Finnpipette II-Volumen ajustable pipeteador Fisherbrand 21-377-815
1-200 mu l puntas biseladas Naturales EE.UU. Scientific, Inc. 1111-1700
Discovery.V8 Microscopio estéreo Zeiss MC1500
60 mm x 15 mm Estilo de células tratadas placa de cultivo de poliestireno Corning Incorporated 430166
Vannas rectas Tijeras Storz Ophthalmics E3383 S
Pinza Dressing curva con dientes delicados Storz Ophthalmics E1408
15 Grado Cuchillo Microcirugía Wilsen Oftálmica Corp. 091204
La ketamina Ketaset III NADA # 45-290
Xilazina Lloyd Laboratorios NADA # 139-236
Bupivacaína (bupivacaína) AstraZeneca N / A
La buprenorfina Sigma Aldrich B9275

Referencias

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  1. Prevalence of Blindness Data Tables [NEI Statistics and Data]. , National Eye Insitute. Available from: http://www.nei.nih.gov/eyedata/pbd_tables.asp (2011).
  2. Abe, T. Regeneration of the retina using pigment epithelial cell transplantation. Nihon Ganka Gakkai Zasshi. 106, 778-803 (2002).
  3. Jacobson, S. G., Cideciyan, A. V., Ratnakaram, R., Heon, E.....

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