Modelo de rata de ruptura de la barrera sangre-cerebro para permitir dirigida Therapeutics neurovascular

Jacob A. Martin; Alexander S. Maris; Moneeb Ehtesham; Robert J. Singer

doi:10.3791/50019

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Modelo de rata de ruptura de la barrera sangre-cerebro para permitir dirigida Therapeutics neurovascular

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DOI:

10.3791/50019

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30 de noviembre de 2012

Jacob A. Martin¹ , Alexander S. Maris¹ , Moneeb Ehtesham¹ , Robert J. Singer¹

¹Department of Neurological Surgery, Vanderbilt University School of Medicine

En este artículo

Resumen

Hematoencefálica interrupción de la barrera ayuda a la entrega de ciertos medicamentos para el cerebro. Manitol entregado intraarterial células se contrae los vasos sanguíneos circundantes con el fin de perturbar físicamente la barrera.

Resumen

Células endoteliales con uniones estrechas a lo largo de la membrana basal y los pies de astrocitos finales rodean los vasos sanguíneos cerebrales para formar la barrera sangre-cerebro ^1. La barrera selectivamente excluye moléculas de cruce entre la sangre y el cerebro en base a su tamaño y carga. Esta función puede impedir el suministro de agentes terapéuticos para trastornos neurológicos. Una serie de fármacos quimioterapéuticos, por ejemplo, no será efectiva cruzar la barrera sangre-cerebro para alcanzar las células tumorales ^2. Por lo tanto, mejorar el suministro de fármacos a través de la barrera sangre-cerebro es un área de interés.

Los métodos más frecuentes para intensificar el suministro de fármacos al cerebro son la infusión directa cerebral y la barrera hematoencefálica interrupción ^3. Directos garantías infusión intracerebral que las terapias de alcanzar el cerebro, sin embargo, este método tiene una capacidad limitada para dispersar el fármaco ^4. Barrera hematoencefálica interrupción (BBBD) allos puntos bajos de medicamentos para fluir directamente desde el sistema circulatorio en el cerebro y así llegar más eficazmente células tumorales dispersas. Tres métodos de alteración de la barrera incluyen alteración de la barrera osmótica, alteración de la barrera farmacológico, y el ultrasonido focalizado con microburbujas. Rotura osmótica, iniciada por Neuwelt, utiliza una solución hipertónica de 25% de manitol que deshidrata las células de la barrera sangre-cerebro, causando que se encojan y alterar sus uniones estrechas. Alteración de la barrera también se puede lograr con compuestos farmacológicamente vasoactivas tales como histamina y bradiquinina ^{5 6.} Este método, sin embargo, es selectiva principalmente para la barrera cerebro-tumor ^7. Además, RMP-7, un análogo del péptido bradiquinina, se encontró que era inferior en comparación cabeza a cabeza con BBBD osmótico con 25% de manitol ^8. Otro método, ultrasonido focalizado (FUS), en relación con microburbujas agentes de contraste de ultrasonidos, también se ha demostradopara abrir reversiblemente la barrera sangre-cerebro ^9. En comparación con FUS, sin embargo, 25% de manitol tiene una larga historia de seguridad en pacientes humanos que hace que sea una herramienta probada para la investigación traslacional ^10-12.

Con el fin de lograr BBBD, manitol deben ser entregados a una tasa alta directamente en la circulación arterial del cerebro. En los seres humanos, un catéter endovascular es guiado hasta el cerebro donde se puede flujo rápido, directo logrado. Este protocolo modelos BBBD humana tan estrechamente como sea posible. Después de un corte hacia abajo a la bifurcación de la arteria carótida común, se inserta un catéter retrógrado en el TCE y utilizados para entregar el manitol directamente en la arteria carótida interna (ICA) la circulación. Propofol y N ₂ O anestesia se utilizan por su capacidad de maximizar la eficacia de la ruptura de la barrera ^13. Si se ejecuta correctamente, este procedimiento tiene la capacidad de forma segura, eficaz y reversible abrir la barrera sangre-cerebro y mejorare la administración de fármacos que normalmente no llegan al cerebro ^8,13,14.

Protocolo

1. Preparar Animal y Equipo para efectuar el procedimiento

Antes de comenzar la cirugía, prepare el área quirúrgica y el animal. Hacer que el catéter de la carótida mediante la inserción de una aguja de punta roma de calibre 23-en un extremo de 12 "de tubo de PE50. Cortar un bisel aproximadamente 45 ° en el extremo opuesto del catéter. Esterilizar el equipo antes del procedimiento. Use un capó cabello, máscara quirúrgica y guantes estériles.
Coloque una almohadilla térmica sobre la superficie donde se realizará la cirugía. Actívalo y deje que se caliente. Cubra el área con una almohadilla absorbente banco.
Compruebe que tiene 25% de manitol en solución sin cristales. Si hay cristales, que se disuelvan colocando el vial en un baño de agua caliente a 80 ° C y agitando periódicamente.
Registrar la masa del animal.
Hacer una dilución de propofol para la entrega a 0,8 mg / kg / min a una velocidad de 0,1 ml / min.
Coloque la rata en la caja de la inducción durante 3 min. Configuración: 5% de isoflurano, 2 L / minCaudal ventilador.
En la parte superior de una toalla desechable, afeitarse el cuello y los muslos internos.

2. Intube la Rata

Volver a colocar el animal en el cuadro de la inducción durante 3 min.
Prepare el tubo endotraqueal con un catéter intravenoso. Para este tamaño y raza de ratas, se utiliza un catéter de calibre 18. El tubo debe ser suficientemente grande para permitir la circulación de aire adecuada, pero lo suficientemente pequeño para encajar en la tráquea sin causar daños. Tire de la aguja fuera del catéter plástico con cuidado y romper la aguja aprox. 1 cm de su punta afilada. La aguja tocada será su lápiz. Vuelve a colocar la aguja en el catéter.
Colgar la rata por los dientes en una superficie inclinada.
Enciende una luz directamente sobre el cuello del animal y alineados entre sus orejas.
Inserte una pequeña espátula aprox. 3 cm en la orofaringe. Levante hacia arriba mientras tira suavemente la lengua fuera de la boca.
Visualizar la apertura de la tráquea. Lo harás síea agujero pequeño abierto y cercano con cada respiración.
Inserte suavemente catéter en el orificio. A veces se puede sentir el plástico entrar en el cartílago de la tráquea. La tráquea es sensible. No fuerce el catéter.
Ajuste el ventilador a 1 L / min y 60 lpm y el isoflurano al 2%.
Conectar el catéter al ventilador y el tubo de cinta a la superficie de operación.
Verificar que el animal es anestesiado mediante la realización de un sujetador del pie.

3. Establecer anestesia Propofol IV

Asegure la rata con cinta adhesiva las cuatro extremidades y la cola a la superficie de operación.
Frote el cuello afeitado y sitios de la ingle con clorhexidina jabón tres veces. Luego frote con clorhexidina enjuague tres veces.
Conecte una jeringa de propofol a un conjunto de extensión IV. Monte la jeringa en una bomba de infusión.
Con un escalpelo, cortar a través de la piel del muslo rasurada. Evite cortar el músculo.
Abra la incisión con fuerzaps para visualizar la vena femoral.
Tire el tejido sobre la arteria para exponer el recipiente.
Inserte un 26 ga Monoject veterinario catéter IV en la vena. Cuando la aguja perfora la pared de la vena se siente que son más fáciles de empujar. Retraer la aguja y empuje el catéter en el vaso.
Iniciar la infusión de propofol a 0,1 ml / min.
3-5 min después de comenzar la infusión de propofol, cambiar el gas de la anestesia a una mezcla de 50% O ₂ y 50% N O ₂ y apagar el isoflurano.

4. Exponer la bifurcación de la arteria carótida común

Hacer una incisión en la línea media del cuello con hoja de bisturí.
Cortar entre las dos grandes glándulas salivales con tijeras o bisturí.
Diseccionar tejido lateral a la línea media para exponer la arteria carótida. Utilice unas pinzas para abrir capas de tejido. Usted puede utilizar tijeras para retirar las piezas que lo expongan con las pinzas y determinar que minimally vascular. Controlar el sangrado con una gasa, hisopos de algodón, y cauterización si es necesario.
Inyectar 3 ml de solución salina IP si ha habido sangrado moderado a fuerte.
Utilice separadores para extraer el tejido fuera de la carótida. Encuentra la bifurcación.
Exponer la arteria occipital, justo distal a la bifurcación. Cauterize que entre pinzas y separarlo con un electrocauterio.
Use pinzas para exponer completamente la bifurcación de la carótida y como mucho de la ECA como sea posible.
Exponer la arteria tiroidea superior se desvía la ECA distal a la arteria occipital. Cauterize que entre pinzas y separarlo con un electrocauterio.

5. Cateterización de la arteria carótida externa

Coloque dos trozos de 4/0 seda bajo el ACA.
Coge un trozo de sutura con su pinza hemostática y retraer la ECA atrás caudalmente (hacia los pies de la rata).
Tomar la otra sutura y atar en la medida de cranealmente (hacia la boca de la rata) como sea posible won un nudo de cirujano. Esto forma una ligadura permanente a sacrificar la ECA.
Retire la pinza hemostática primero (el que se aplica la tensión caudal) y coge la otra sutura (la que se anuda alrededor de la ECA) y aplique una ligera tensión craneal con la pinza hemostática.
Atar nudo otro cirujano suelta (no aseguran - dejar apenas atado) distal a la bifurcación y proximal a la ligadura permanente.
Irrigar con lidocaína al 1% para relajar la arteria.
Llenar el catéter con solución salina heparinizada.
Colocar una grapa de vaso temporal lo más cerca posible a la bifurcación. Place grapa de vaso en un ángulo para maximizar el espacio para la cateterización. Deslice el nudo flojo hacia el clip.
Hacer una arteriotomía pequeña (corte) en la CEPA justo proximal a la ligadura usando micro tijeras. No debe haber sangrado y si el clip de ligadura son seguras.
Utilizando pinzas para controlar las paredes de ECA, alimentar el extremo biselado del catéter en el vaso.
Fijar el catéter con el nudo de sutura sueltos. Ate la arteria alrededor del catéter.
Retire el clip y limpiar la zona con un bastoncillo de algodón.
Avanzar el catéter a aproximadamente 1 mm distal a la bifurcación. Mantener la arteria con fórceps proximales al nudo para asegurar el recipiente se inmoviliza.

6. Administre Manitol

Llenar un 8 "juego de extensión IV y una jeringa de 6 ml con manitol sin crear burbujas de aire en la tienda de esta incubadora a 37 ° C. Nota: el trabajo rápidamente con el manitol -, será fácil de precipitar de la solución a temperatura ambiente..
Para visualizar BBBD, puede administrar colorante azul de Evans y verlo entrar en las áreas del cerebro donde se ha interrumpido la barrera. Para ello, dar al animal 2 ml / kg de Evans 2% Blue a través de un nuevo sitio IV en la pierna contralateral a la infusión de propofol.
Conecte el juego de extensión a un filtro de 5 micras y llenarlo con manitol para eliminar el aire bubbles. A continuación, conecte esta a la llave de paso sin crear burbujas.
Administrar manitol a 0,09 ml / seg para 25 seg. Reloj para el manitol para alcanzar el equilibrio con el flujo en la carótida común en un punto justo proximal a la ICA. Se debería aparecer a pulso con una frecuencia cardiaca de la rata. Si el manitol simplemente fluye hacia el corazón que hayas superado la presión arterial de la rata. Esto puede causar complicaciones potencialmente mortales y BBBD pobres.