El uso de matrices inversas de proteínas de fase (RPPA) para explorar la variación de expresión de proteínas individuales dentro de cánceres de células renales

Resumen

RPPA permite la expresión de la proteína de cientos de muestras, impresos en portaobjetos de nitrocelulosa para ser interrogado simultáneamente, usando anticuerpos marcados con fluorescencia. Esta técnica se ha aplicado para estudiar el efecto de la heterogeneidad de tratamiento de drogas dentro de células claras carcinoma renal.

Resumen

Actualmente no existe ningún tratamiento curativo para el cáncer metastásico de células renales de células claras, el más común de variante de la enfermedad. Un factor clave en esta resistencia al tratamiento se cree que es la complejidad molecular de la enfermedad de ^1. La terapia dirigida, tales como el inhibidor de la tirosina cinasa (ITC)-sunitinib han sido utilizados, pero sólo el 40% de los pacientes responderán, con la gran mayoría de estos pacientes que recaen dentro de 1 año ^2. Por ello, la cuestión de la resistencia intrínseca y adquirida en pacientes renales de células cancerosas es muy relevante ^3.

Con el fin de estudiar la resistencia a TKIs, con el objetivo final de desarrollar tratamientos eficaces y personalizados, tejido secuencial después de un período específico de terapia dirigida se requiere, un enfoque que ha resultado exitoso en leucemia mieloide crónica ^4. Sin embargo, la aplicación de esta estrategia en el carcinoma de células renales se complica por el alto nivel de bOTH inter e intratumoral heterogeneidad, que es una característica de carcinoma de células renales ^5,6, así como otros tumores sólidos ^7. Heterogeneidad Intertumoral debido a las diferencias transcriptomic y genética está bien establecida incluso en pacientes con presentación similar, estadio y grado del tumor. Además es evidente que existe un gran morfológica (intratumoral) heterogeneidad en RCC, que es probable que represente heterogeneidad molecular aún mayor. Mapa detallado y clasificación de los tumores RCC por análisis morfológico combinada y la clasificación de Fuhrman permite la selección de áreas representativas para el análisis proteómico.

El análisis de proteínas basado en ⁸ de CCR es atractivo debido a su amplia disponibilidad en los laboratorios de patología, sin embargo, su aplicación puede ser problemática debido a la limitada disponibilidad de anticuerpos específicos ^9. Debido a la naturaleza de dot blot de las matrices de la proteína de fase inversa (RPPA), la especificidad del anticuerpo debe be pre-validado; como tal control de calidad estricto de los anticuerpos utilizados es de suma importancia. A pesar de esta limitación, el formato de dot blot sí permite la miniaturización de ensayo, lo que permite la impresión de cientos de muestras en un portaobjetos de nitrocelulosa sola. Diapositivas impresas se pueden analizar de una forma similar a análisis de Western con el uso de anticuerpos primarios específicos y anticuerpos secundarios marcados con fluorescencia, lo que permite la multiplexación. La expresión diferencial de proteínas en todas las muestras en un portaobjetos se pueden analizar simultáneamente al comparar el nivel relativo de fluorescencia de una manera más rentable y de alto rendimiento.

Protocolo

1. La identificación de la heterogeneidad morfológica y molecular del tumor

1. Tumores extraídos de -80 ° C congelador y se mantuvo en hielo seco.
2. Dividir los tumores en secciones de aproximadamente 1 cm ^3. Mapear la posición original de cada sección del tumor respecto a la otra y la etiqueta con un nombre único. Almacenar las muestras en crioviales individuales a -80 º C hasta que esté listo para su uso.
3. Muestras de abrigo en octubre y cortadas en un criostato a -22 ° C.
4. Las muestras se tiñeron con hematoxilina y eosina método counterstaining.
5. El análisis microscópico de cortes congelados para asegurar que s....

Resultados

Un ejemplo de una diapositiva escaneada RPPA se puede ver en la Figura 4 (i) con dos canales 680 y 800 nm mostradas. La separación de las imágenes por longitud de onda, la Figura 4 (ii) permite a cada almohadilla en la diapositiva RPPA a analizar y expresión de la proteína individual determinada Figura 4 (iii). Como se puede ver en la Figura 4 (iii) la expresión de las proteínas individuales en las muestras es único con gelsolina tiene un alto nivel de .......

Discusión

El método que aquí se presenta RPPA representa una alternativa de alto rendimiento para la técnica de transferencia rendimiento ampliamente utilizado, pero relativamente baja occidental de análisis de proteínas. El método permite a cientos de muestras a ser semi-cuantitativamente analizados y comparados simultáneamente permitiendo la comparación directa de las proteínas clave a través de una amplia selección de líneas celulares y muestras de tejidos. Multiplexación con especies diferentes de anticuerpo aumenta aún más l.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Nombre del reactivo	Empresa	Número de catálogo
aprotinina	Sigma	A6279
cóctel de inhibidores de fosfatasa 2	Sigma	P5726
cóctel de inhibidores de fosfatasa 3	Sigma	P0044
cóctel inhibidor de la proteasa	Roche	11836153001
Triton X-100	Triton-X	T8787
Li-Cor Odyssey tampón de bloqueo	Li-Cor	927-40000
TissueLyser	Qiagen	85600
MicroGrid II robot vigilante	Biorrobótica
Cuatro FastFrame 'bay soporte de diapositivas	Whatman	10486001
RÁPIDO Slide - 2-Pad	Whatman	10485317
IRDye 680LT cabra anti-ratón IgG	Licor	926-68020
IRDye 800CW cabra anti-conejo IgG	Licor	926-32211