La inmunodetección de la membrana externa proteínas por Citometría de Flujo de mitocondrias aisladas

Resumen

Se describe aquí es un método para detectar y cuantificar proteínas de la membrana externa mitocondrial por inmunomarcaje de las mitocondrias aisladas de tejido de roedores y análisis por citometría de flujo. Este método puede ampliarse para evaluar los aspectos funcionales de subpoblaciones mitocondriales.

Resumen

Métodos para detectar y controlar los componentes de proteína de membrana externa mitocondrial en los tejidos animales son vitales para estudiar la fisiología mitocondrial y la fisiopatología. Este protocolo describe una técnica donde las mitocondrias aisladas de tejido de roedores se immunolabeled y se analizaron por citometría de flujo. Las mitocondrias se aislaron a partir de roedores médulas espinales y se sometieron a una etapa de enriquecimiento rápido a fin de eliminar la mielina, un contaminante principal de las fracciones mitocondriales preparadas a partir de tejido nervioso. Mitocondrias aisladas se marcaron a continuación con un anticuerpo de elección y un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia. Análisis por citometría de flujo verifica la pureza relativa de las preparaciones mitocondriales por tinción con un colorante específico mitocondrial, seguido por la detección y cuantificación de la proteína immunolabeled. Esta técnica es rápida, cuantificable y de alto rendimiento, lo que permite el análisis de cientos de miles de mitocondrias por muestra. Es aplicable para evaluar novela proteins en la superficie mitocondrial en condiciones fisiológicas normales, así como las proteínas que pueden convertirse en mislocalized a este orgánulo durante la patología. Es importante destacar que este método puede ser acoplado a colorantes indicadores fluorescentes para informar sobre ciertas actividades de las subpoblaciones mitocondriales y es factible para las mitocondrias del sistema nervioso central (cerebro y médula espinal), así como el hígado.

Introducción

Las mitocondrias son orgánulos muy dinámicos que se someten a múltiples rondas de la fisión y la fusión, son transportados a sitios de alta demanda energética y responder rápidamente a los estímulos fisiológicos ^1. Dado que se reconoce cada vez más que las mitocondrias dentro de los diferentes tejidos, incluso diferentes compartimentos celulares, tienen perfiles funcionales distintos, se necesitan nuevos métodos para identificar estos subconjuntos mitocondriales distintos.

Microscopía proporciona un medio por el cual las mitocondrias individuales se pueden visualizar y la presencia de una proteína en, o en las mitocondrias puede ser determinada por inmunofluorescencia ^2. Sin embargo, el análisis cuantitativo por este método es laborioso y es más adecuado para experimentos utilizando líneas celulares inmortalizadas o primarios. El estudio de las mitocondrias individuales derivados de tejido es significativamente más difícil y la mayoría de los métodos no permiten una fácil identificación de subconjuntos mitocondriales simultáneamente con la evaación de la función mitocondrial ^3.

Para hacer frente a este obstáculo, un nuevo método para inmunomarcador mitocondrias aisladas de tejidos de roedores y posteriormente analizadas por citometría de flujo se ha desarrollado. Esto permite la rápida detección y cuantificación de proteínas localizadas en la membrana mitocondrial externa, que en comparación con el análisis por microscopía, es mucho menos mano de obra intensiva y permite el análisis de miles de mitocondrias en una sola muestra. Este ensayo se puede aplicar para controlar el destino y la cantidad relativa de proteínas de la membrana externa mitocondrial que se cree que son constitutivamente presente en la mitocondria, el reclutamiento de proteínas a la superficie mitocondrial, o la detección de proteínas mislocalized a la mitocondria en condiciones patológicas. Por otra parte, la incorporación de colorantes indicadores fluorescentes convencionales permite la evaluación simultánea de ciertos aspectos de la función mitocondrial en distinta mitocondrialsubpoblaciones.

Protocolo

Los animales utilizados en este estudio fueron tratados en estricta conformidad con un protocolo (N08001CVsr) aprobado por el l'Université de Montréal (CRCHUM) Comité Centre de Recherche du Centre Hospitalier de de Institucional para la Protección de los Animales que sigue los estándares nacionales tal como se indica por la Canadian Consejo de los Animales (CCPA).

Preparar todos los reactivos necesarios para llevar a cabo este protocolo (Tabla 1). Todos los demás detalles relacionados con el equipo, los suministros y proveedores se encuentran en la Lista de Materiales.

Tabla 1. Buffer composiciones.

1. Colección de rata de la Médula Espinal

1. Profundamente anestesiar la rata (Sprague Dawley) con 4% isoflorane. Verifique la anestesia por la falta de reflejo a pellizcos de jue pata. La eutanasia a las ratas por decapitación a través de la guillotina. Se prefiere este método de eutanasia sobre otros, que puedan distorsionar la médula espinal.
2. Cortar la piel de la espalda para exponer la columna vertebral. Cortar la columna vertebral con sus tijeras de hueso justo por encima del hueso de la pelvis. Visualice la apertura de la columna vertebral.
3. Inserte una jeringa de 10 ml, con una punta de pipeta de 200 l (unido a través de la fusión de un poco más de la llama), lleno de tampón fosfato salino (PBS), en la columna vertebral.
4. Enjuague la médula espinal mediante la aplicación de una cantidad media de la presión en el émbolo.
5. Si alguno de sangre está presente en la médula espinal, enjuagar con PBS antes de proceder al siguiente paso.
   NOTA: Este método también ha sido validado para el cerebro y el hígado. Si estos tejidos incluyendo, recoger media del cerebro de la rata sacrificados y un trozo de hígado igual en peso a la médula espinal. Todos los otros pasos permanecen idénticas.

2. Aislamiento de la médula espinal Mitochondria (Adaptado de Vande Velde et al. ⁴⁾

1. Recoger toda la médula espinal y el lugar intacto en 5 ml homogeneizador de vidrio con 5 volúmenes (~ 3,25 ml) tampón de homogeneización (HB). Para una recuperación óptima de las mitocondrias aisladas, realizar todos los pasos en el hielo o en la cámara frigorífica. Homogeneizar el tejido a mano hasta que no hay grandes trozos de tejido permanecen, aproximadamente ocho golpes. Coloque homogeneizado en dos (2 ml) o tres (1,7 ml) tubos de microcentrífuga. Centrífuga 1300 xg durante 10 min a 4 ° C en una microcentrífuga de sobremesa.
2. Recuperar sobrenadante y colocar en un tubo de ultracentrífuga 5 ml. Añadir 750 l (~ 0,5 volúmenes) HB al tubo de microcentrífuga que contiene pellets y resuspender suavemente el pellet. Repita centrifugación y resuspensión pasos dos veces más. Piscina todos los sobrenadantes (S1a y S1b) en el mismo tubo de ultracentrífuga 5 ml por encima. Este paso sirve para eliminar los desechos pequeños.
3. Centrífuga agruparon S1 utilizando una ultracentrífuga equipado con una podredumbre basculanteo y centrifugar a 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
4. Mantenga sobrenadante (S2) para su posterior procesamiento si la fracción citosólica es de interés (por ejemplo, para el análisis de Western blot). Resuspender el precipitado (P2), la fracción mitocondrial crudo, en 4 ml HB + 50 mM de KCl. Centrifugar 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C en un rotor de cubeta oscilante. Descartar el sobrenadante y resuspender suavemente el pellet (P3) en 800 l HB.
   NOTA: Las mitocondrias se lavaron con mM KCl + HB 50 para eliminar cualquier contaminante asociados mitocondrialmente no específicos.
5. En un nuevo tubo de ultracentrífuga 5 ml, añadir exactamente 800 l de precipitado resuspendido (P3).
6. A este tubo agregar, 200 l de iodixanol (medio de gradiente de densidad), creando así una concentración final de 12% Iodixanol. Mezcle el contenido del tubo suavemente, pero a fondo a través de pipeteo con un P1000. La adición de iodixanol primero, y después se resuspendieron pellets (P3) pueden ser preferibles para facilitar la mezcla completa. Se centrifuga en un ultracentrifuge equipado con un rotor basculante a 17.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
7. NOTA: Hígado no contiene mielina y, por tanto, este paso no es necesario si se está procesando sólo el hígado. Sin embargo, si el hígado se está procesando al mismo tiempo que las mitocondrias del SNC, se recomienda para el tratamiento de todos los tejidos por igual.
8. Aspirar la capa de mielina en la parte superior del tubo y cuidadosamente retirar y desechar el sobrenadante. Pellet puede estar suelto. Resuspender el precipitado en 4 ml HB. Centrifugar de nuevo a 17.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Descartar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 4 ml HB. Repetir la centrifugación y eliminar el sobrenadante.
9. Resuspender el sedimento final (P7) en 100-200 l HB y transferir a un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Esta muestra contiene mitocondrias aisladas.
10. Proceder a la cuantificación de proteínas. Diluir las muestras y la curva estándar en el 2% de dodecilsulfato de sodio (SDS) para asegurar la solubilización adecuada de duri mitocondriasng cuantificación de proteínas.

3. Immunolabeling de mitocondrias aisladas de Citometría de Flujo

1. Para cada mezcla de tinción a ensayar, una pipeta 25 g de mitocondrias aisladas en un tubo de microcentrífuga de 1,7 ml. Incluya una muestra sin mancha en cada experimento; y para cada anticuerpo, asegúrese de incluir una muestra para el control de isotipo apropiado.
2. Centrifugar a 17.000 xg durante 2 min a 4 ° C en una microcentrífuga de sobremesa.
3. Eliminar el sobrenadante y resuspender las mitocondrias aisladas en 50 l Buffer mitocondrias (M Buffer) suplementado con BSA libre de ácidos grasos 10% durante 15 min a 4 ° C (etapa de bloqueo).
   NOTA: Durante el etiquetado, realizar incubaciones en un refrigerador a 4 ° C.
4. Añadir anticuerpo primario (anti-conejo Mfn2, 20 g por ml) al tubo y se incuba durante 30 min a 4 ° C.
   NOTA: Determine la concentración óptima de cada anticuerpo empíricamente por titulación. Debido a la variabilidad en la concentración y / o pureza, diferentes lotes del mismo anticuerpo del mismo fabricante pueden llevar a diferentes resultados; Por lo tanto, se necesita de titulación para cada nuevo lote de anticuerpos.
5. Lave anticuerpo primario no unido: Se centrifuga a 17.000 xg durante 2 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender suavemente el sedimento en 200 l M Buffer. Se centrifuga a 17.000 xg durante 2 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el precipitado en 50 l M Buffer.
6. Añadir anticuerpo secundario (anti-conejo de burro IgG ficoeritrina (PE), 0,5 g por ml) al tubo e incubar las muestras durante 30 min a 4 ° C, protegido de la luz.
7. Lave anticuerpo secundario no unido: Se centrifuga a 17.000 xg durante 2 min a 4 ° C. Eliminar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 200 l M Buffer. Se centrifuga a 17.000 xg durante 2 min a 4 ° C. Aspirar el sobrenadante y resuspender el sedimento en 500 l M Buffer.
8. Para asegurarse de eventos están en la mitocondria hecho, mancha aislada mitocondrias con unamitocondrias colorante fluorescente específico para 15 min a RT, protegido de la luz. Si se desea la tinción de otros parámetros funcionales (potenciales transmembrana mitocondrial o de producción de superóxido), continúe con el paso 4 Si no es así, continúe con el paso 5 para la adquisición.
   NOTA: Es importante verificar que el espectro de emisión del anticuerpo secundario es compatible con la de los colorantes funcionales. Por ejemplo, si la verificación de la pureza mitocondrial con un colorante comercial con propiedades espectrales similares a FITC y potencial transmembrana con éster metílico de tetrametilrodamina (TMRM), un anticuerpo secundario viable sería aloficocianina (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Añadir compensaciones controles, es decir, una muestra immunolabeled o teñido con un solo fluoróforo, cuando sea aplicable.
9. Transferir a un tubo adecuado para el flujo de carga citómetro. (Para facilitar el tamaño de muestra pequeño, un tubo de microtitulación se coloca dentro de 3 ml citómetro de flujo del tubo.) Mantener las muestras en hielo y se procederá de inmediato acitómetro de flujo para la adquisición.

4. Dosificación mitocondrial potencial transmembrana mitocondrial de superóxido y de Producción por Citometría de Flujo

1. Verificar que las mitocondrias aisladas tienen un potencial transmembrana intactas mediante tinción con 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) ^5, en el paso 3.8, durante 15 min a RT, protegido de la luz. Para la comparación de potencial transmembrana entre las muestras y las poblaciones, el uso de concentraciones menores / no extinción de la TMRM (1 a 30 nM), puede ser más apropiado ^6.
   1. Como control para la tinción TMRM, aislado mancha mitocondrias con 100 nM TMRM en presencia de 100 mM fenil cianuro de carbonilo m-cloro hidrazina (CCCP), un desacoplador mitocondrial que despolarizar las mitocondrias. La concentración de CCCP requerido para despolarizar las mitocondrias puede ser menor si se utilizan concentraciones más bajas de tinte.
2. Verifique que las mitocondrias aisladas producen superóxido mitocondrial por staining con un indicador de superóxido mitocondrial apropiado ^7, también en el paso 3.8, durante 15 min a RT, protegido de la luz.
   1. Como control para la producción de superóxido mitocondrial, aislado mancha mitocondrias con el tinte en presencia de 10 mM antimicina A, un inhibidor del complejo III de la cadena respiratoria que aumentar la producción de superóxido mitocondrial.

5. Adquisición y Análisis de immunolabeled mitocondrias aisladas por citometría de flujo

1. Instrumento creado: tensiones cambia de lineal a modo de registro para facilitar el análisis de las mitocondrias aisladas y voltajes establecidos (FSC: 450; SSC: 250). Asegúrese de que los eventos se recogen en el modo de FSC-A (área), así como FSC-W (ancho) y FSC-H (altura), para poder excluir dobletes (es decir, dos acontecimientos, que pasan por el detector al mismo tiempo ) en la recopilación de post-análisis de datos. Establecer el número de eventos que se percibe para 100.000. Adquirir los controles de compensación, En su caso.
2. Adquisición de Datos: Antes de la adquisición de datos, evitar vortex muestras. En lugar mezclar golpeando suavemente el tubo. Inicialmente recopilar eventos en una baja presión, durante gating. Puerta en la población total. Ajuste tensiones de histogramas en consecuencia, por lo general el pico de la muestra sin teñir corresponderá a la segunda década (10 ^2). Una vez establecidas las puertas, y se están procesando las muestras, la presión puede ser cambiado a alta.
3. Análisis: Visualice dobletes trazando FSC W frente a FSC. Identificar singletes y dobletes. Puerta en interiores. Seleccione la población mitocondrial, colocando puertas en los eventos que se tiñen positivamente con un tinte mitocondrial selectiva.
4. Determinar el etiquetado de fondo de control de isotipo. Usando la muestra de control de isotipo, determinar el porcentaje de la población mitocondrial etiquetado positivo para el anticuerpo Mfn2.

Resultados

Las mitocondrias derivadas de médula espinal de rata se pueden immunolabeled con un anticuerpo dirigido a Mitofusin2 (Mfn2), una proteína implicada en la fusión de la membrana externa de las mitocondrias ^8. Tras el aislamiento y el etiquetado con un anticuerpo específico Mfn2 y un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia, las mitocondrias son procesados ​​por citometría de flujo (Figura 1). Después de la adquisición de datos, las muestras se analizaron mediante citometría de flujo de...

Discusión

Es cada vez más evidente que las mitocondrias son actores clave en la fisiología normal y la enfermedad. Mientras inmunotransferencia puede determinar qué proteínas se encuentran dentro de las mitocondrias o en la superficie mitocondrial en una cierta condición, este método informes sobre la media de toda la población. Este método no puede dar información sobre la abundancia relativa de las subpoblaciones o subconjuntos mitocondriales. Si bien ha sido asumido previamente que todas las mitocondrias son iguales, el campo ...

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratas	Charles River	Código de cepa 400	Adulto (9 semanas a 18 semanas) Se pueden utilizar ratas macho o hembra para el protocolo de aislamiento. El peso de las ratas depende del sexo y la edad (los machos entre 300 y 500 g y las hembras entre 200 y 350 g) se suelen utilizar.
Homogeneizador de onzas	Kontes Glass Co.	885450-0022	Microcentrífuga Duall 22
	Thermo Scientific		Sorvall Legend Micro 17 R
Tubos ultracentrífugos ultratransparentes	Beckman Coulter	344057	Transparente, de pared fina
Ultracentrífuga Sorvall Thermo	Scientific		Sorvall WX UltraSeries
AH-650	Thermo Scientific
Opti-prep	Axis-Shield	1114542	Iodixanol, medio de gradiente de densidad
Sin ácidos grasos Albúmina sérica bovina Sigma		A8806	Debe estar libre de ácidos grasos para las mitocondrias
Succinato de sodio dibásico hexahidratado	Sigma	S9637
Anticuerpo anti-Mitofusina2 para conejos	Sigma	M6319
IgG para conejos	Jackson Immuno Research	011-000-003
Anti-Rabbit IgG PE	eBioscience	12-4739-81
Micro tubo de titulación	Bio-Rad	223-9391	Para la adquisición de muestras por citometría de flujo
MitoTrackerGreen (MTG)	Invitrogen	M7514	100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm
TMRM	Invitrogen	T668	100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm
CCCP		Sigma C2759
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008	5 µ M: Ex 540 nm/Em 600 nm
Antimicina A	Sigma	A8874
LSR II citómetro de flujo	BD
BD FACSDiva Software	BD
FlowJo	TreeStar Inc.		Software utilizado para el análisis
del kit de ensayo de proteínas BCA	Bradford Pierce/Thermo Scientific	23225	ya que no es compatible con altas concentraciones de SDS