Summary
Burada açıklanan tespit ve akış sitometrisi ile analiz kemirgen doku ve izole mitokondri immün ile mitokondriyal dış membran proteinleri ölçmek için bir yöntemdir. Bu yöntem, mitokondriyal alt popülasyonlarının fonksiyonel özelliklerini değerlendirmek için genişletilebilir.
Abstract
Yöntem algılamak ve hayvansal dokular mitokondriyal fizyolojisi ve patofizyolojisi çalışma için hayati olan mitokondriyal dış membran proteini bileşenleri izlemek için. Bu protokol kemirgen dokusundan izole mitokondri immunolabeled ve flow sitometri ile analiz edilir bir yöntem açıklanır. Mitokondri kemirgen omurilik izole edildi ve miyelin, sinir dokusundan hazırlanan mitokondriyal parçaların büyük bir kirletici maddeyi bertaraf edilmesi için hızlı bir zenginleştirme adımına tabi tutulurlar. İzole mitokondri daha sonra tercih edilen bir antikoru ve bir floresan konjuge sekonder antikor ile etiketlenir. Akış sitometrisi ile analiz, algılama ve imüno-işaretli protein miktarının ölçülmesi ile takip mitokondriyal belirli bir boya ile boyanması ile mitokondriyal preparatların saflığı göreli doğrular. Bu teknik, numune başına mitokondri yüzbinlerce analizine izin veren, hızlı ölçülebilir ve yüksek verimli olduğunu. Bu yeni p değerlendirmek için geçerlidirNormal fizyolojik şartlar altında mitokondrial yüzeyinde roteinler gibi patoloji sırasında bu organele mislocalized olabilir proteinleri. Önemli olarak, bu yöntem, alt-popülasyonlarının mitokondriyal bazı etkinlikler rapor floresan göstergesi boyalar ile birleştirilebilir ve merkezi sinir sistemi (beyin ve omurilik) yanı sıra karaciğer, mitokondri için mümkün olduğunu edilebilir.
Introduction
Mitokondri, yüksek enerji talebinin sitelerine taşınan ve fizyolojik uyaranlara 1 hızla yanıt olan, fizyon ve füzyon birden fazla tur geçmesi son derece dinamik organellerdir. Giderek farklı dokularda olduğu mitokondri kabul edildiğinden, hatta farklı hücre bölmeleri, yeni yöntemler bu farklı mitokondriyal alt kümelerini tanımlamak için gerekli olan, farklı fonksiyonel profilleri var.
Mikroskopi bireysel mitokondri görselleştirilebilir sağlayan bir aracı ve bağışıklık 2 ile belirlenebilir veya mitokondrilerde bir proteinin varlığını içerir. Bununla birlikte, bu yöntem ile kantitatif analiz, emek yoğun ve ölümsüzleştirilmiş veya primer hücre çizgileri kullanılarak deneyler için daha uygundur. Dokusundan türetilen bireysel mitokondri çalışması çok daha zordur ve çok yöntem ile aynı zamanda mitokondriyal değerlendirmeleri mevcuttur alt gruplarının kolay tanımlama için izin vermezmitokondriyal fonksiyon 3 tirme.
Bu engel, akış sitometrisi ile kemirgen dokulardan izole edildi ve daha sonra analiz mitokondri immunolabel için yeni bir metot gidermek amacıyla geliştirilmiştir. Bu, hızlı bir şekilde saptanması ve mikroskobik inceleme ile karşılaştırıldığında mitokondriyal dış membran, lokalize proteinler ölçülmesini sağlar, daha az emek yoğun ve tek bir numunede bulunan mitokondri binlerce analiz edilmesini sağlar. Bu deney, mitokondri de yapısal olarak mevcut olduğu düşünülmektedir mitokondriyal dış zar proteinlerinin 'nin ve nispi miktarını izlemek için uygulanabilir, mitokondriyal yüzeyine proteinler işe ya da patolojik koşulların mitokondrilere mislocalized proteinlerin tespiti. Ayrıca, geleneksel floresan gösterge boyaların kuruluş farklı mitokondriyal mitokondriyal fonksiyonun bazı yönlerinin aynı anda değerlendirilmesini sağlarsubpopülasyonunun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu çalışmada kullanılan hayvanların Kanada tarafından belirtildiği gibi ulusal standartlar aşağıdaki Hayvanları Koruma Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Université de Montréal (CRCHUM) Kurumsal Komitesi tarafından onaylanmış bir protokol (N08001CVsr) sıkı göre tedavi edildi Hayvan Bakım Konseyi (ccac).
Bu protokolü (Tablo 1) gerçekleştirmek için gerekli tüm reaktifleri hazırlayın. Ekipman, malzeme ve tedarikçi ile ilgili diğer tüm detayları Malzeme Listesi bulunabilir.
Tablo 1. Tampon bileşimler.
Sıçan Omurilik 1. Koleksiyonu
- Derinden% 4 isofloran ile sıçan (Sprague Dawley) uyuşturan. Th sıkıştığı üzerine refleksi eksikliği ile anestezi doğrulayıne forepaw. Giyotin ile dekapitasyon yoluyla sıçan öldürülür. Ötenazi Bu yöntem omuriliği deforme olabilir başkaları üzerinde tercih edilir.
- Omurga ortaya çıkarmak için arka cilt kesin. Sadece leğen kemiği üzerinde kemik makası ile omuriliğe kesin. Vertebral kolonun açılmasını gözünüzde canlandırın.
- Vertebral kolona, Fosfat Tamponlu Salin (PBS) ile doldurulmuş bir 200 ul pipet ucu (alev biraz üzerinde eriyen yoluyla bağlanmış) ile, bir 10 ml şırınga yerleştirin.
- Pistonun basınç orta tatbik edilmek sureti ile omurilik yıkayın.
- Herhangi bir kan, omurilik mevcut ise, bir sonraki aşamaya geçmeden önce PBS ile yıkayın.
NOT: Bu yöntem aynı zamanda beyin ve karaciğer için valide edilmiştir. Bu dokular dahil olmak üzere, durumunda, yarısı kurban sıçandan beyin ve omurilik ağırlıkça eşit bir karaciğer parçası toplar. Diğer tüm adımlar aynıdır kalır.
Omurilik Mit 2. izolasyonuochondria (Vande Velde ve ark uyarlanmıştır. 4)
- 5 hacim (~ 3.25 mi) Homojenleştirme tamponu (HB) ile 5 ml'lik bir cam homojenizatör içinde, bütün dokunulmamış omurilik yeri ve toplayın. İzole mitokondri optimal kurtarma için, buz veya soğuk odada tüm adımları uygulayın. Doku hiçbir büyük parça kalmayıncaya kadar, elle yaklaşık sekiz vuruşları doku homojenize. İki (2 mi) ve üç (1.7 mi) mikrosantrifüj tüplerinde Homojenat yerleştirin. Bir tezgah üstü mikrosantrfuj, 4 ° C'de 10 dakika 1,300 x g santrifüj.
- 5 ml'lik bir ultrasantrifüjdeki tüpüne süpernatant ve yer kurtarın. Pelet içeren mikrosantrifüj tüp 750 ul (~ 0.5 hacimler) HB ekleyin ve hafifçe pelletini. Tekrar santrifüj ve yeniden süspansiyona iki kez daha yineleyin. Havuz yukarıdaki ile aynı 5 ml'lik bir ultra santrifüj tüpüne tüm üst sıvıları (S1a ve S1 B). Bu adım, küçük enkaz kaldırmak için hizmet vermektedir.
- Santrifüj S1 sallanan bir kova çürüklüğü ile donatılmış bir ultrasantrifüjdeki kullanılarak toplandıya da 4 ° C'de 15 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüjleyin.
- Sitosolik parçacık, (Western blot analizi için örneğin) ilgi ise daha sonraki işlemler için bir süpernatan (S2) muhafaza edilmelidir. 4 mi HB + 50 mM KCI pelet (P2) ham mitokondriyal fraksiyonu, yeniden süspanse edin. Bir sallanan kepçeli rotor içinde 4 ° C'de 15 dakika 17,000 x g santrifüj. Süpernatantı atın ve yavaşça 800 ul HB pelet (P3) tekrar süspansiyon.
Not: Mitokondri herhangi bir özel olmayan mitokondriyal ilişkili kirleri çıkarmak HB ile + 50 mM KCI ile yıkanmıştır. - Yeni 5 ml'lik bir ultra santrifüj tüp içinde, süspansiyon haline getirilen tanelere, (P3) tam olarak 800 ul ekleyin.
- Bu tüp, böylece% 12 iyodiksanol bir nihai konsantrasyonu yaratırken, iyodiksanol (yoğunluk gradyan ortamı) 200 ul ilave edin. Yavaşça ancak iyice P1000 ile pipetleme yoluyla tüpün içindekiler karıştırılır. İlk iyodiksanol eklenmesi ve daha sonra tekrar askıda topak (P3) iyice karışmasını kolaylaştırmak için tercih edilir. Bir Ult yılında santrifüj4 ° C'de 15 dakika boyunca 17,000 x g'de bir sallanan kepçeli rotor ile donatılmıştır racentrifuge.
- Not: Karaciğer miyelin içermeyen ve sadece karaciğer işlenirken, bu nedenle, bu adım gerekli değildir. Karaciğer MSS mitokondri ile eş zamanlı olarak, işlenmekte olan, ancak eşit tüm dokularını tedavi etmek için önerilmektedir.
- Tüpün üst miyelin tabakasını aspire ve dikkatli bir şekilde çıkarın ve süpernatantı atın. Pelet gevşek olabilir. 4 ml HB pelletini. Tekrar santrifüj 4 ° C'de 10 dakika boyunca 17,000 x g'de. Süpernatantı atın ve 4 ml HB pelletini. Santrifüj tekrarlayın ve süpernatant kaldırmak.
- 100-200 ul HB nihai pelet (P7) tekrar ve bir 1.7 ml mikrosantrifüj tüp transfer. Bu örnek izole mitokondri içerir.
- Protein miktar tayini geçin. Mitokondri pahalı ne yeterli çözülmesini sağlamak için örnekler ve% 2 sodyum dodesil sülfat (SDS) standart eğri seyreltinng protein ölçümü.
Akış Sitometrinin için İzole Mitokondri 3. ile immün
- Her boyama karışımı test edilebilmesi için, pipet 1,7 ml mikrosantrifüj tüp içine izole mitokondri 25 mcg. Her deneyde bir boyanmamış örnek sayılabilir; ve her bir antikor için, uygun izotip kontrolü için bir örnek eklemeyi unutmayın.
- Bir tezgah üstü mikrosantrifüj 4 ° C'de 2 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüjleyin.
- Süpernatantı ve 4 ° C (bloke etme adımı) 'de 15 dakika boyunca% 10-yağ asitsiz BSA ile takviye edilmiş 50 ul mitokondri tamponu (Tampon E) olarak izole mitokondri tekrar süspansiyon.
Not: etiketleme sırasında, 4 ° C'de bir buzdolabı içinde inkubasyon gerçekleştirmek. - Tüpüne birincil antikor (tavşan anti-Mfn2, ml başına 20 ug) ilave edildi ve 4 ° C'de 30 dakika inkübe edilir.
NOT: titrasyonu ile ampirik olarak her antikor optimal konsantrasyonunu belirleyin. Nedeniyle konsantrasyon ve / veya p değişkenliğeurity, aynı üreticinin aynı antikorun farklı partiler, farklı sonuçlara yol açabilir; Dolayısıyla antikor titrasyonu her yeni lot için gereklidir. - Bağlanmamış birinci antikorları yıkayın: Santrifüj 17,000 x g'de 2 dakika süre ile 4 ° C 'de. Süpernatantı ve yavaşça 200 ul M Tampon pelletini. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı ve 50 ul M Tampon pelletini.
- Tüpüne ikincil antikoru (Eşek anti-tavşan IgG Fikoeritrin (PE), ml başına 0.5 ug) ilave edilir ve ışıksız bir ortamda 4 ° C sıcaklıkta 30 dakika boyunca inkübe örnekleri.
- Bağlanmamış ikinci antikorları yıkayın: Santrifüj 17,000 x g'de 2 dakika süre ile 4 ° C 'de. Süpernatantı ve 200 ul M Tampon pelletini. 4 ° C'de 2 dakika boyunca 17,000 x g'de santrifüjleyin. Süpernatantı ve 500 ul M Tampon pelletini.
- Olaylar aslında mitokondri içinde emin olmak için, bir ile leke izole mitokondriışıksız bir ortamda oda sıcaklığında 15 dakika boyunca mitokondri özel floresan boya. Diğer fonksiyonel parametreler (mitokondriyal transmembran potansiyeli veya süperoksit üretimi) boyama isteniyorsa, değilse, edinimi için 5. adıma 4. adıma geçin.
NOT: Bu ikincil antikor emisyon spektrumu fonksiyonel boyaların olduğu ile uyumlu olduğunu doğrulamak için önemlidir. (: Örnek 650 nm / Em 660 nm APC), örneğin, tetrametilrodamin metil ester (TMRM) FITC ve zar potansiyeline benzer spektral özelliklere sahip ticari bir boya ile mitokondriyal saflık doğrulanması durumunda, uygun bir ikincil antikor alofikosiyanin olacaktır. Tazminatlar kontrolleri ekleyin, yani bir örnek immunolabeled veya uygulanabilir olduğunda tek bir floroforla ile boyandı. - Sitometresiyle yükleme akışı için uygun bir tüp aktarın. (. Küçük örneklem büyüklüğü bir mikro tüp ml'lik bir tüp akış sitometresini 3 içine yerleştirilir kolaylaştırmak için) buz üzerinde örnekleri tutun ve hemen devamedinimi için akış sitometresi.
4. Assaying Mitokondriyal Transmemebran Potansiyeli ve Sitometrisi ile Mitokondriyal süperoksit Üretimi
- Izole edilmiş mitokondri ışıktan koruyarak oda sıcaklığında 15 dakika boyunca aşama 3.8 ile 100 nM TMRM (Örnek 548 nm / Em 574 nm): 5 ile lekeleme ile bir dokunulmamış zar potansiyeline sahip olduğundan emin olun. Örnekler ve popülasyonlar, TMRM (1-30 nM) 'nin alt / olmayan söndürme konsantrasyonlarının kullanımı arasındaki zar potansiyeli Karşılaştırma için, 6 daha uygun olabilir.
- TMRM boyama, 100 uM karbonil siyanit m-kloro fenil hidrazin (CCCP) varlığında 100 nM TMRM boyanan izole mitokondri, mitokondri depolarize bir mitokondriyal uncoupler için bir kontrol olarak. Boyanın daha düşük konsantrasyonlar kullanıldığı takdirde mitokondri depolarize için gerekli CCCP konsantrasyonu daha az olabilir.
- İzole mitokondri st tarafından mitokondriyal süperoksit üretmek doğrulayınışıksız bir ortamda oda sıcaklığında 15 dakika boyunca, aynı zamanda adım 3.8 değerinde, uygun bir mitokondriyal süperoksit gösterge 7, geri kalan.
- Mitokondriyal süperoksit üretimi, 10 uM Antimycin A, mitokondriyal süperoksit üretimini artıracak solunum zinciri kompleksi III bir inhibitörün mevcudiyetinde boya ile leke izole mitokondri için bir kontrol olarak.
Sitometrisi ile kondriyayı İzole immunolabeled 5. Toplama ve Analiz
- Enstrüman kurmak: doğrusal geçiş gerilimleri izole mitokondri ve set gerilimlerin analizi kolaylaştırmak için log modu için (FSC: 450; SSC: 250). Olaylar FSC-A (alan) modu yanı sıra FSC-W (genişlik) ve FSC-H (yükseklik) toplanan emin olun, ikilileri (dışlamak mümkün yani, aynı zamanda dedektör geçen iki olay, ) analizi sonrası veri toplama. Olayların Set sayısı 100,000 ile tahsil edilecek. Tazminat kontrolleri EdinmeVarsa.
- Veri toplama: veri toplama önce numune vorteks kaçının. Bunun yerine hafifçe tüp dokunarak karıştırın. Başlangıçta gating sırasında düşük bir basınçta olay toplamak. Toplam nüfus Kapısı. , Buna göre histogramlarının gerilimler ayarlayın genellikle boyanmamış numunenin tepe ikinci on (10 2) karşılık gelir. Kapılar kurulmuş, ve örnekler işleniyor sonra, basıncı yüksek geçirilebilir.
- Analiz: FSC-W FSC karşı komplo tarafından ikilileri gözünüzde canlandırın. Singletlerini ve ikilileri tanımlayın. Singletlerin üzerinde Kapısı. Mitokondriyal-selektif boya ile pozitif boyandı olaylar kapılayarak mitokondriyal nüfusu seçin.
- Izotop kontrolden plan etiketleme belirleyin. Izotip kontrol örneği kullanarak, Mfn2 antikor için pozitif popülasyon mitokondriyal etiketleme yüzdesini belirlemek.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Sıçan omurilik türetilen mitokondri Mitofusin2 (Mfn2), mitokondri 8 dış membran füzyon rol oynayan bir protein hedefli bir antikor ile imüno edilebilir. Bir Mfn2 spesifik antikor ve bir floresan konjuge sekonder antikor ile izole edilmesini ve ardından etiketleme, mitokondri akış sitometrisi (Şekil 1) tarafından işlenir. Veri toplama sonra, numuneler ilk olarak, bir nokta arsa (Şekil 2A) ilgili toplanan tüm olayları görselleştirerek, analiz yazılımı akış sitometri ile analiz edilmiştir. FSC olaylar, genişlik (B) karşı alanı (A) (Şekil 2B) olarak çizilmiştir zaman çiftlerin ve mayoları ayrılır. Mayoları FSC / SSC (Şekil 2C) üzerinden, gate the mitokondriyal nüfusu seçilmiş ve tarafından mitokondri özel boya için pozitif boyanma olayların sayısını doğrulamak kez mitokondri-SPE ile boyanmış bir örneği ile boyanmamış örnek bir histogram co-komplo, spesifik boya. Mitokondrial olayları belirlemek için, iki adet tepe noktasına (Şekil 2D) kesiştiği yerde bir kapı yerleştirin. Omurilik hazırlıkları için, genellikle> olayların% 90 mitokondri spesifik boya için olumlu. Olayların% 98 boya ile etiketleyecektir ~ karaciğer gibi diğer dokuların için, (veriler gösterilmemiştir). Yalnızca mitokondriye özgü boya için pozitif olarak etiket olguların seçiminde sonra,% 1 ya da daha az izotip etiketleme (sol Şekil 2E) içeren bir kapı (Mfn2 +) seçerek izotip kontrolü ile arka etiketleme belirler. Dış mitokondriyal zarın üzerinde mevcut olan mitokondri Mfn2 yüzdesini (Şekil 2E, sağ) belirlemek için antikor Mfn2 ile etiketlenmiş tüm örnekler için de aynı şekilde bu kapıdan uygulanır. Bu deneyde,% 30 mitokondri Mfn2 pozitif omurilik etiket türetilmiştir. Bu Mfn2 bir yerde ifade mit olarak kabul edilir, ancak bu, burada dikkat etmek önemlidirochondrial dış zar proteini, bir önceki miktarı edilmemiştir. Ayrıca, kültürlenmiş hücrelerde Mfn2 bir imüno, analiz tek tek mitokondri 9 bir homojen olmayan etiketleme gösterir. Bu epitop Mfn2 nedeniyle kendisi ile etkileşim ya da diğer bağlayıcı ortaklar veya translasyonel modifikasyonlar yayınlamak için nedeniyle kullanılamaz olduğu da mümkündür. Dikkat çekici bir şekilde, bu çalışmada söz konusu antikor, N-terminal (amino asitler 38-55) için sentetik bir peptit kullanılarak oluşturulmuştur. Bu varyant henüz deneysel olarak teyit (UniProt veritabanı) edilecek olmasına rağmen, ilk 302 amino asidi eksik Mfn2 tahmin edilen bir uç uca ekleme varyantı bulunmaktadır. Bu durumda, bu deney, ikinci antikor verilmiş, N-terminal sekansından yoksun alternatif olarak kesilmiş Mfn2 tespit edemez.
Mitokondriyal zar potansiyeli (ΔΨ m), ve süperoksit üretiminin, bu deneyde tespit edilebilir. Iç mitokondrial membran genelinde, ücretsiz bir ayrılık wh vardırich oksidatif fosforilasyon yoluyla ATP üretimini sürücüler. TMRM bir zar potansiyeli bağlı bir şekilde 5, mitokondri içinde biriken bir katyonik boya ve bu nedenle mitokondriyal transmembran potansiyel bir muhabir olarak kullanılabilir. Mitokondri (% 95) büyük bir kısmı boyanmamış kontrol (Şekil 3A) ile karşılaştırıldığında, boyama sonrası TMRM olumludur. Bununla birlikte, uncoupler CCCP eklendiğinde TMRM (Şekil 3A) muhafaza edebilmektedir mitokondri sayısında önemli bir azalma vardır. CCCP esas şarj ayırma yok ve membran depolarize, iç mitokondriyal zarın iyonların serbest geçişine izin verir.
Kompleks I ve elektron taşıma zincirinin III oksidatif fosforilasyon normal bir yan ürün olarak mitokondri serbest süperoksit. Mitokondriyal süperoksit mitokondriyaya hedefli ve floresan haline follo bir zar geçirgen bir boya ile ölçülebilirkanat süperoksit 7 ile bir reaksiyon. Fonksiyonel mitokondri lekesiz örneği (Şekil 3B) ile karşılaştırıldığında süperoksid bir taban miktarda üretir. Kompleks III inhibitörünün bir Antimycin eklenmesi çiçeklenme sağa doğru bir kayma ve mitokondri daha yüksek bir sayı tarafından görüldüğü gibi, süperoksit bir artışa sebebiyet verir (tipik olarak ~% 10) Bu mitokondriyal süperoksit gösterge boya (Şekil 3B) ile floresan.
Izolasyon, immunolabeling ve mitokondri analizi Şekil 1. Şematik. Adım 1: doku toplayın ve homojenize Adım 2:. Izolasyon prosedürü sekiz santrifüj adımları içerir. Miyelin, merkezi sinir sistemi dokusu, bir ana muhafaza iyodiksanol (yoğunluk gradyan ortamı) ve merkezkaç mitokondri seyreltilmesi ile çıkarılırmitokondri pelet haline ise fuging, tüpün üst yüzen miyelin sonuçlanan Adım 3:. izolasyon ve miktar izlenerek, mitokondri birincil antikor ile etiketlenir ve yıkandı engellenir. Bir florofora konjüge edilmiş ikincil bir antikor daha sonra ilave edilir. Bağlanmamış antikor yıkanmakta Adım 4:. Mitokondriyal saflığı veya mitokondriyal fonksiyonun rapor flüoresan boyalar ilave edilebilir, bu noktada, 5 Adım a:. Mitokondri hemen akış sitometrisi ile analiz edilmesi için hazırdır.
Akışı izole mitokondri analizi için Şekil 2. Strateji sitometri. Forward Scatter (FSC) ve Side Scatter (SSC) gerilimler logaritmik modda hem parametreleri kullanarak, küçük etkinlikler için ayarlanması gerekir. FSC genişliği (FSC-W) veri olmalıdırçiftli dışlamak için toplandı. Not, çoğu akış sitometrelerinde, FSC ve SSC için varsayılan ayar doğrusal modu (B) ikilileri,. Bir nokta arsa üzerinde toplanan tüm olayları gözünüzde canlandırın (A). Olduğu, aynı zamanda lazer tarafından geçen iki mitokondri, ayırt edilebilir FSC-W (lineer modu) karşı FSC komplo tarafından mayoları. FSC-W değeri, yani olayların, yoğun bulut parçası olanların çoğunluğu iki katından daha fazla ortalama FSC-W değeri ise olaylar hariçtir. Bu eşiğin altında Olaylar singletler kapılı. (C) Yine, bir nokta arsa olayları görselleştirmek ve kapı kalan olaylar. (D) boyanmamış örnek bir histogram çiziniz (katı, dolu, gri) ve örnek ile boyandı Bir mitokondriyal özgü boya (MSD: katı, yeşil). Kapı MSD (MSD *). (E) izotip kontrolü, tavşan IgG Histogram pozitif lekeleme olaylar (siyah kesik) ve Mfn2 etiketli örneği (katı pembe).Izotop kontrol zirvede ≤ 1% Mfn2 + verim ve Mfn2 (Mfn2 +) pozitif etiketleme olayların yüzdesini belirlemek için deney örneği için aynı kapı uygulamak şekilde kapıyı ayarlayın. , bu daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız rakam.
Flow sitometri ile izole mitokondri Şekil 3. Assaying mitokondriyal transmembran potansiyeli (ΔΨ m) ve süperoksit üretimi. (Katı, gri, dolu) boya transmembran potansiyeli olan mitokondri birikir için lekelenmemiş kontrol grubu ile karşılaştırıldığında tüm aktif mitokondri (katı, siyah) TMRM ile etiketleyecektir bazal koşullar altında (A). Addi (kesikli, mavi) protonophore CCCP yon depolarize ve daha az bazal koşullar karşılaştırıldığında boyasına korumak için mitokondri neden transmembran potansiyelini dağıtır. Veriler bazal koşullar altında, flüoresan yoğunluğu, numunenin ortalama floresan yoğunluğu çıkartılır boyanmamış kontrolün ortalama floresan yoğunluğu (ΔMFI). (B) olan delta olarak rapor edilir, mitokondri oksidatif bir yan ürün olarak Superoksit üretmek fosforilasyon. Boyanmamış kontrolü (katı, gümüş, dolu) ile karşılaştırıldığında: süperoksit Bu mitokondriyal kaynak mitokondriyal süperoksit göstergesi, (katı, siyah MitoO 2) ile analiz edilebilir. Kompleks III inhibitörü, Antimycin A eklenmesi artmış süperoksit üretimi (kesikli, turuncu) sonuçları, bazal seviyeleri ile karşılaştırıldığında. Veri MitoO 2 göstergesi için pozitif lekeleme yapan hücrelerin yüzdesi olarak rapor edilir.k "> Bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu mitokondri normal fizyoloji ve hastalık hem de kilit oyuncular olduğu giderek açıktır. Imünoblotting, belli bir durumda mitokondri içinde veya mitokondriyal yüzeyinde tüm nüfusun ortalama bu yöntem raporlar bulundu hangi proteinlerdir çıkarabilirler. Bu yöntem mitokondriyal alt popülasyonlarının veya altkümelerin göreceli bolluk hakkında bilgi elde edemez. O olmuştur iken daha önce tüm mitokondri eşit, alan giderek bir hücre içinde bu mitokondri kabulüdür oluşturulan morfolojisi ve / veya fonksiyon 10 açısından geniş bir farklılığa sahip olduğu varsayılır.
Floresan mikroskopi yaklaşımlar dikkate mitokondri heterojenliğini alıyoruz. Bununla birlikte, bu tür verilerin ölçümü emek yoğundur. Ayrıca, bu yaklaşım / yerinde nedeniyle excès zordur in vivo mitokondri etiketleme gibi, kültür hücreleri kullanılarak çalışmalara daha uygundurMevcut mitokondri sive sayısı, bireysel organel farklılaşması doğal zorlaştırır. En immünsitokimya protokollerinde, nedeniyle antikor etiketleme için gerekli hücresel Permeabilization adıma aynı anda dış mitokondrial membran proteinleri etiketlemek ve mitokondriyal fonksiyonunu değerlendirmek mümkün değildir. Mevcut yöntem, permeabilizasyon adımı gerektirmeyen şekilde izole mitokondri ile çalışır ve. Buna ek olarak, ayrı ayrı mitokondri görselleştirme mitokondriyal fonksiyonun ürün analizi için uygun değildir, elektron mikroskobu ile mümkündür. Yani biz dokudan mitokondri izolasyonu mitokondriyal ağının bozulmasına yol açar ve bu mitokondriyal fonksiyonun bazı unsurları etkileyebilir tanımak, söyleniyor. Bununla birlikte, aynı şekilde işlenir dokulardan izole mitokondri fonksiyonel açıdan karşılaştırılması geçerli kalır.
Doku türevli yalıtımlı bir immunolabeling yöntemiakış ile ed mitokondri ve sonraki analiz sitometrisi algılar ve dış membranı üzerinde yer alan bir proteinin varlığını tespit etmek için hızlı ve nicel bir yöntem sağlar. (Mfn2 gibi) yüksek miktardaki mitokondriyal protein tespiti Bu teknik ile mümkündür. Benzer şekilde, bu yöntem sadece Amyotrofik Lateral Skleroz (ALS), 11 bağlamında yanlış katlanmış SOD1 gibi hastalık mitokondriyal zarın üzerinde biriken düşük bolluk proteinleri algılayabilir. Buna ek olarak, bu yöntem, geçici olarak normal fonksiyon parçası olarak mitokondriyal yüzeyi ile ilişkilendirmek proteinleri izlemek için yararlı olabilir. Örnekleri arasında Dynamin-ilişkili protein-1 (Drp1) gibi mitokondriyal reaktif oksijen türleri artırmak üzere mitokondriyaya doğru yer değiştirir mitokondriyal fizyon 12 ve tümör nekroz faktörü reseptör-bağlantılı faktör 6 (TRAF6) teşvik etmek mitokondri için görevlendirilir Bir hücre sıvısı protein doğuştan gelen bağışıklık tepkisinin 13 bir parçasıdır.
Hücre içi etiketleme için standart protokoller permeabilizasyon mitokondri yapısal bütünlüğünü bozan bir deterjan gerektirir gibi günümüzde bu teknik sadece mitokondriyal yüzeyinde yerleşik proteinlerden elverişlidir. Olası reaktif bir dizi (yayımlanmamış) denenmiş olsa da, immünoyaftalama protokol daha fazla optimizasyon hala içi mitokondriyal bileşenleri tespit mükellef bu protokolü yapmak için gereklidir.
Bu teknik, geniş uygulama alanına sahiptir ve çeşitli deneysel paradigmaların altında mitokondri varlığını veya bir veya daha fazla protein işe tespit etmek için kullanılabilir. Bundan başka, iki farklı antikorun mitokondri, yanı sıra göstergeler floresan 11 ile ko-etiketli olabilir. Diğer floresan probları, aynı zamanda mitokondriyal fonksiyonun değişik yönleri karakterize etmek için dahil edilebilir. Örneğin, ticari olarak temin edilebilen boya mitokondriyal pH 14 izlemek 15, ve ATP seviyeleri 16 ile kalsiyum alımı mümkündür.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarlar ifşa hiçbir şey yok.
Acknowledgments
Biz sitometresi akış erişimi için Laurie Destroismaisons ve üstün teknik destek için Sarah PEYRARD ve Dr.Alexandre Prat teşekkür ederiz. Biz de hazırlıkları miyelin kaldırılması ile ilgili yaptığı katkılarından dolayı Dr Timothy Miller kabul etmek istiyorum. Bu çalışma Sağlık Araştırması (CIHR) Nöromusküler Araştırma Ortaklığı, Yenilik için Kanada Vakfı, Kanada ALS Derneği, ALS Araştırma Frick Vakfı, CHUM Vakfı ve Fonds de la Recherche en Santé du Québec (CVV) olan Kanada Enstitüleri tarafından desteklenmiştir. Hem CVV ve NA olan Araştırma Âlimler Fonds de la Recherche en Santé du Québec ve CIHR Yeni Müfettişler. SP Kanada ALS Derneği'nin Tim Noël Öğrencilik tarafından desteklenmektedir.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BD FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H.
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
- Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
- Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
- Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
- Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
- Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
- Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H. Jr, Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
- Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
- West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
- Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
- Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550 (2013).
