Summary
여기서 설명하는 것은 감지하고 유세포 짐승 조직으로부터 분리 및 분석 미토콘드리아 immunolabeling 의해 미토콘드리아 외막 단백질을 정량하는 방법이다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군의 기능적 측면을 평가하기 위해 확장 될 수있다.
Abstract
방법은 검색과 동물의 조직은 미토콘드리아 생리학 및 병태 생리를 연구하는 필수적인 미토콘드리아 외막 단백질 구성 요소를 모니터링 할 수 있습니다. 이 프로토콜은 쥐의 조직에서 분리 된 미토콘드리아가 immunolabeled 및 유동 세포 계측법에 의해 분석하는 기술에 대해 설명합니다. 미토콘드리아는 설치류 척수로부터 단리 미엘린, 신경 조직으로부터 제조 미토콘드리아 분획의 주요 오염 물질을 제거하기 위하여 빠른 농축 공정을 실시한다. 고립 된 미토콘드리아는 다음 선택의 항체와 형광 접합 된 이차 항체로 표시되어 있습니다. 유동 세포 계측법에 의한 분석은 검출 및 immunolabeled 단백질의 정량 하였다 미토콘드리아 특정 염료로 염색하여 미토콘드리아 제제의 상대적 순도를 검증한다. 이러한 기술은 샘플 당 미토콘드리아 수십만의 분석을 허용 급속한 정량화 및 높은 처리량이다. 이 소설의 페이지를 평가에 적용 할 수있다정상적인 생리적 조건하에 미토콘드리아 표면 roteins뿐 아니라 병리 과정이 소기관에 mislocalized 될 수 단백질. 중요한 것은,이 방법은 미토콘드리아 개체군의 특정 활동에 대한보고를 형광 표시 염료에 결합 및 중추 신경계 (뇌와 척수)뿐만 아니라 간에서 미토콘드리아에 대한 가능하다 할 수있다.
Introduction
미토콘드리아는 높은 에너지 수요의 사이트로 이송 및 생리 학적 자극 하나에 빠르게 반응하는 핵분열 및 융합의 여러 라운드를 거쳐 매우 동적 인 세포 소기관이다. 그것이 점점 다른 조직에서 미토콘드리아를 인식하고 있기 때문에, 심지어 다른 세포 구획, 새로운 방법은 이러한 고유 한 미토콘드리아의 하위 집합을 식별하는 데 필요한 별개의 기능 프로파일을 가지고있다.
현미경 개별 미토콘드리아가 가시화 될 수있다 수단 및이 면역에 의해 결정될 수있다이나 미토콘드리아에서 단백질의 존재를 제공한다. 그러나,이 방법에 의해 정량 분석은 노동 집약적이고, 일차 또는 무한 증식 세포주를 이용한 실험에 더 적합하다. 조직에서 파생 된 개별 미토콘드리아의 연구는 훨씬 더 어렵고 대부분의 방법은 evalu과 동시에 미토콘드리아 부분 집합을 쉽게 식별 할 수 있도록하지 않습니다미토콘드리아 기능 3의 ation.
이 장애물, 유동 세포 계측법에 의해 짐승 조직으로부터 분리 및 후속 분석 미토콘드리아 immunolabel하는 신규 한 방법을 해결하기 위해 개발되었다. 이는 신속한 검출 및 현미경으로 분석하여 비교 미토콘드리아 외막으로 지역화 단백질의 정량화를 허용 훨씬 덜 노동 집약적이고, 단일 샘플에서 미토콘드리아의 수천의 분석을 허용한다. 이 분석은 미토콘드리아에서 항시 존재하는 것으로 생각되는 미토콘드리아 외막 단백질의 거동 및 상대적인 양을 모니터에 적용 할 수있는, 미토콘드리아 표면 단백질의 채용, 또는 병리학 적 조건의 미토콘드리아에 mislocalized 단백질의 검출. 또한, 종래의 형광 인디케이터 염료의 혼입은 별개의 미토콘드리아에서 미토콘드리아 기능의 특정 측면의 동시 평가를 가능하게소집단.
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Protocol
본 연구에 사용 된 동물은 캐나다에 의해 설명 된대로 국가 표준을 다음과 동물의 보호를위한 센터 드 공들인 뒤 센터 Hospitalier 드 난 4 대학 몬트리올 (CRCHUM) 기관위원회의 승인 프로토콜 (N08001CVsr)에 따라 엄격하게 처리하여, 동물 관리 협의회 (CCAC).
이 프로토콜 (표 1)을 수행하는 데 필요한 모든 시약을 준비합니다. 장비, 소모품 및 공급 업체에 대한 다른 모든 세부 사항은 재료의 목록에서 찾을 수 있습니다.
표 1 버퍼 조성물은.
쥐 척수의 1 컬렉션
- 깊이 4 % isoflorane와 쥐 (스프 라그)를 마취시키다. 일의 곤란에 반사의 부족에 의해 진통제를 확인전자 앞발. 단두대를 통해 잘린 쥐를 안락사. 안락사이 방법은 척수 왜곡이있는 다른 사람들보다 더 선호된다.
- 척추를 노출 뒤의 피부를 잘라. 다만 골반 뼈 위의 뼈 가위로 척추를 잘라. 척주의 개통을 시각화.
- 척추에, 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)로 채워진 200 μL 피펫 팁 (불꽃을 통해 약간 녹는 통해 부착)로, 10 ML의 주사기를 삽입합니다.
- 플런저 압력의 매체 량을 적용하여 척수 세척.
- 모든 혈액 척수에 존재하는 경우, 다음 단계로 진행하기 전에 PBS로 헹군다.
참고 :이 방법은 또한 뇌와 간을 위해 검증되었습니다. 이러한 조직을 포함하는 경우, 절반 안락사 래트에서 뇌 및 척수에서 동일 간 중량의 조각을 모은다. 다른 모든 단계는 동일 남아있다.
척수에 Mit의 2 절연ochondria (반데 Velde 외 각색. 4)
- 5 볼륨 (~ 3.25 ml)에 균질화 버퍼 (HB) 5 ㎖의 유리 균질의 전체 손상 척수과 장소를 수집합니다. 격리 된 미토콘드리아의 최적의 복구의 경우, 얼음 또는 차가운 방에서 모든 단계를 수행합니다. 조직의 더 큰 조각이 남아 있지 않을 때까지 손으로 약 8 스트로크를 조직을 균질화. 둘 (2 ㎖) 또는 셋 (1.7 ml)에 마이크로 원심 튜브에 균질를 놓습니다. 벤치 탑 마이크로 원심에서 4 ° C에서 10 분 동안 원심 분리기 1300 XG.
- 5 ML의 초 원심 분리기 튜브에 상층 액과 장소를 복구 할 수 있습니다. 펠릿 함유 microcentrifuge 관에 750 μL (~ 0.5 권) HB를 추가하고 부드럽게 펠렛을 재현 탁. 원심 분리를 반복하고 재 부상은 두 번 더 반복합니다. 위의 수영장 같은 5 ML의 초원 심 분리기 튜브에 모든 상층 액 (S1A 및 S1B). 이 단계는 작은 파편을 제거하는 역할을한다.
- 원심 분리기는 S1이 스윙 버킷 부패가 장착 된 초 원심 분리기를 사용하여 풀링또는 4 ° C에서 15 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기.
- 세포질 분획 (웨스턴 블롯 분석을위한 예를 들어) 관심사 인 경우 추가 처리를 위해 상등액 (S2)를 유지한다. 4 ML의 HB + 50 mM의 KCl을 펠릿에 (P2), 조 미토콘드리아 분획을 재현 탁. 스윙 버킷 로터에서 4 ° C에서 15 분 동안 원심 분리기 17,000 XG. 뜨는을 취소하고 부드럽게 800 μL의 HB에서 펠렛 (P3)을 재현 탁.
NOTE : 미토콘드리아 어떤 비특이적 미토콘드리아 관련 오염 물질을 제거하기 위해 HB + 50 mM의 KCl을로 세정된다. - 새로운 5 ㎖의 초 원심 분리기 튜브에서 재 부유 펠렛 (P3)의 정확히 800 μl를 추가합니다.
- 이에 의해이 튜브에 12 % Iodixanol의 최종 농도를 만들어, Iodixanol (밀도 구배 배지) 200 μl를 추가한다. 온화하지만, 철저 P1000 피펫을 통해 함께 튜브의 내용물을 혼합한다. 제 Iodixanol 첨가하고 재현 탁 펠릿 (P3)의 철저한 혼합을 촉진하는 것이 바람직 할 수있다. ULT에서 원심 분리기4 ° C에서 15 분 동안 17,000 XG에서 스윙 버킷 로터가 장착 racentrifuge.
- NOTE : 간이 미엘린을 제공하지 않으며, 단지 간 처리되는 경우에는, 따라서이 단계는 필요하지 않다. CNS 간 미토콘드리아와 동시에 처리되는 경우, 그것은 동일하게 모든 조직을 치료하는 것을 권장한다.
- 튜브의 상단에 미엘린의 레이어를 대기음 조심스럽게 제거하고 상층 액을 버린다. 펠렛이 느슨 할 수 있습니다. 4 ML의 HB에서 펠렛을 재현 탁. 원심 분리기 다시 4 ℃에서 10 분 동안 17,000 XG에. 뜨는을 취소하고 4 ML의 HB에서 펠렛을 재현 탁. 원심 분리를 반복하여 상층 액을 제거합니다.
- 100 ~ 200 μL의 HB에 최종 펠릿 (P7)을 재현 탁하고, 1.7 ml의 microcentrifuge 관에 전송합니다. 이 샘플은 격리 된 미토콘드리아가 포함되어 있습니다.
- 단백질 정량 진행합니다. 미토콘드리아 두리의 충분한 용해를 보장하기 위해 샘플 및 2 % 도데 실 황산나트륨 (SDS)의 표준 곡선을 희석NG 단백질 정량.
유동 세포 계측법에 대 한 격리 된 미토콘드리아의 3 Immunolabeling
- 각 염색 믹스를 테스트하기 위해서는, 피펫 1.7 ML microcentrifuge 관에 고립 된 미토콘드리아의 25 μg. 각 실험에서 흠없는 샘플을 포함; 각 항체에 대한 적절한 이소 타입 제어를위한 샘플을 포함해야합니다.
- 벤치 탑 마이크로 원심에서 4 ° C에서 2 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기.
- 상층 액을 제거하고 4 ° C (차단 단계)에서 15 분 동안 10 % 지방산 무료 BSA와 보충 50 ㎕의 미토콘드리아 버퍼 (M 버퍼)에 격리 된 미토콘드리아를 재현 탁.
참고 : 라벨 동안 4 ° C에서 냉장고에 인큐베이션을 수행합니다. - 튜브에 차 항체 (토끼 항 Mfn2, ML 당 20 μg)을 추가하고 4 ℃에서 30 분 동안 배양한다.
참고 : 적정에 의해 경험적으로 각 항체의 최적 농도를 결정합니다. 집중력 및 / 또는 P의 변동urity, 동일한 제조업체의 같은 항체의 다른 많은 다른 결과가 발생할 수 있습니다; 따라서 적정 항체의 새 많이 필요합니다. - 언 바운드 차 항체를 씻어 : 원심 분리기를 17,000 XG에서 2 분 동안 4 ° C에서. 상층 액을 제거하고 부드럽게 200 μL M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 2 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 50 ㎕의 M 버퍼에 펠렛을 재현 탁.
- 튜브에 차 항체 (당나귀 항 - 토끼 IgG의 피코 에리 트린 (PE) ML 당 0.5 μg)을 추가하고 빛으로부터 보호 4 ° C에서 30 분, 위해 샘플을 배양한다.
- 언 바운드 차 항체를 씻어 : 원심 분리기를 17,000 XG에서 2 분 동안 4 ° C에서. 상층 액을 제거하고 200 ㎕의 M 버퍼에 펠렛을 재현 탁. 4 ° C에서 2 분 동안 17,000 XG에 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 500 ㎕의 M 버퍼에 펠렛을 재현 탁.
- 이벤트가 사실 미토콘드리아에있는 보장하기 위해,와 얼룩 고립 미토콘드리아빛으로부터 보호 RT에서 15 분 동안 미토콘드리아 특정 형광 염료. 다른 기능 매개 변수 (미토콘드리아 막 횡단 전위 또는 슈퍼 옥사이드 생산)의 염색이 필요한 경우가 아닌 경우, 수집을 위해 5 단계로 진행 4 단계로 진행합니다.
참고 :이 차 항체의 발광 스펙트럼은 기능 염료의와 호환되는지 확인하는 것이 중요합니다. (: 예 650 내지 / 엠 660 nm의 APC)를 예를 들어, 테트라 메틸 메틸 에스테르 (TMRM)와 FITC 및 횡단 전위 유사한 스펙트럼 특성을 갖는 상용 염료 미토콘드리아 순도를 확인하는 경우, 가능한 이차 항체 알로 피코된다. 보상 컨트롤을 추가, 즉, 샘플 immunolabeled 또는 적용 할 때 하나의 형광 물질로 염색. - 사이토로드 흐름에 적합한 튜브에 전송합니다. (. 작은 샘플 크기, 미세 적정 튜브 ML 튜브의 유동 세포 계측기 (3) 내부에 배치를 용이하게하기 위해) 얼음에 샘플을 유지하고 즉시 진행취득 흐름 cytometer.
4 시금 미토콘드리아 막 횡단 잠재력 및 유동 세포 계측법에 의해 미토콘드리아 과산화물 생산
- 격리 된 미토콘드리아가 빛으로부터 보호 실온에서 15 분, 대한, 단계 3.8에서, 100 nm의 TMRM (예 548 nm의 / 엠 574 nm의) 오 염색하여 그대로 횡단 잠재력을 가지고 있는지 확인합니다. 샘플 및 인구, TMRM (1-30 nm의)의 상 / 비 담금질 농도의 사용 사이 횡단 잠재력의 비교를 위해, 6 더 적합 할 수있다.
- TMRM 염색법, 100 μM 카르 보닐 시아 나이드 m-클로로 페닐 하이드라진 (CCCP)의 존재하에 100 nM의 TMRM 가진 얼룩 절연 미토콘드리아 미토콘드리아 탈분극 것이다 미토콘드리아 uncoupler 대 대조군. 낮은 농도의 염료가 사용되는 경우 미토콘드리아 탈분극 필요 CCCP의 농도는 작을 수있다.
- 격리 된 미토콘드리아가 성하여 미토콘드리아 과산화물을 생성되었는지 확인빛으로부터 보호 RT에서 15 분에 대해, 또한 단계 3.8에서, 적합한 미토콘드리아 과산화물 표시기 7 aining.
- 미토콘드리아 수퍼 옥사이드 생산, 10 μM Antimycin A, 미토콘드리아 수퍼 옥사이드 생성을 보강한다 호흡 연쇄의 복합체 III의 억제제의 존재 하에서 염료 얼룩 절연 미토콘드리아 대 대조군.
유동 세포 계측법에 의해 미토콘드리아를 고립 Immunolabeled의 5 수집 및 분석
- 악기 설정 : 선형에서 스위치 전압 절연 미토콘드리아 및 설정 전압의 분석을 용이하게하기 위해 모드를 기록 (FSC : 450, SSC : 250). 이벤트가 FSC-A (영역) 모드뿐만 아니라 FSC-W (폭) 및 FSC-H (높이)에 수집되어 있는지 확인, 이중선을 (배제 할 수 있어야합니다 즉, 같은 시간에 검출기를 통과하는 두 개의 이벤트, ) 분석 후 데이터 수집. 이벤트의 설정 번호는 100000로 수집합니다. 보상 컨트롤 획득(해당되는 경우).
- 데이터 수집 : 데이터 수집하기 전에 샘플을 텍싱 마십시오. 대신에 부드럽게 튜브를 활용하여 혼합한다. 처음 게이팅하는 동안, 낮은 압력에서 이벤트를 수집. 전체 인구에 문입니다. 이에 따라 히스토그램의 전압을 조정 일반적으로 흠없는 샘플의 피크는 두 번째 10 년 (10 두)에 해당됩니다. 게이트가 확립되고, 샘플이 처리되고 나면, 높은 압력으로 전환 할 수있다.
- 분석 : FSC-W FSC 대 플롯에 의해 이중선을 시각화. 단봉과 이중선을 확인합니다. 단봉에 문입니다. 미토콘드리아 선택적 염료 긍정적으로 염색 이벤트에 게이팅에 의해 미토콘드리아 인구를 선택합니다.
- 이소 타입 컨트롤에서 배경 표시를 확인합니다. 이소 제어 샘플을 사용 Mfn2 항체 양성 미토콘드리아 인구 라벨의 비율을 결정합니다.
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Representative Results
래트 척수 유래의 미토콘드리아는 Mitofusin2 (Mfn2), (8)의 미토콘드리아 외막의 융합에 관여 단백질에 표적 항체 immunolabeled 수있다. Mfn2 특정 항체와 형광 접합 된 이차 항체 분리 및 라벨에 따라, 미토콘드리아는 유동 세포 계측법 (그림 1)에 의해 처리된다. 데이터 수집 후, 샘플은 제 도트 플롯 (도 2A)에 수집 된 모든 이벤트를 가시화하여 분석 소프트웨어를 이용하여 유세포 분석된다. 이벤트가 FSC, 폭 (W) 대 영역 (A) (그림 2B)에서 플롯 할 때 이중선과 단봉는 차별화된다. 단일체가 FSC / SSC (그림 2C)을 통해 게이트에게 미토콘드리아 인구 선택에 의해 미토콘드리아 특정 염료에 대한 긍정적 인 염색 이벤트의 수 확인되면 미토콘드리아-SPE 물들 샘플 흠 샘플의 히스토그램을 공동 - 플로팅cific 염료. 미토콘드리아 이벤트를 확인하려면이 피크 (그림 2D)의 교차점에 게이트를 배치합니다. 척수 제제, 전형적으로> 이벤트의 90 %는 미토콘드리아 특정 염료 양성이다. 사건의 98 %는 색소로 레이블링된다 ~ 같은 간 같은 다른 조직에 대해서는 (데이터는 미도시). 만 미토콘드리아 특정 염료에 대한 긍정적 라벨 이벤트를 선택한 후, 1 % 이하 이소 라벨 (왼쪽 그림 2E를) 포함하는 게이트 (Mfn2 +)를 선택하여 아이소 타입 컨트롤 배경 라벨을 결정합니다. 외부 미토콘드리아 막에 존재 Mfn2와 미토콘드리아의 비율 (그림 2E 오른쪽)를 결정하기 위해 항체 Mfn2로 표시된 모든 시료에 균일하게 게이트를 적용합니다. 이 실험에서, 미토콘드리아의 30 %는 Mfn2 양성 척수 유래의 라벨. 그것은 Mfn2는 재하 표현 MIT로 간주되지만 것으로, 여기에 주목하는 것이 중요하다ochondrial 외막 단백질, 그것은 이전 정량화되지 않았다. 또한, 배양 된 세포에서 Mfn2의 면역 조직 화학적 분석은 개개의 미토콘드리아 (9)의 비 균일 한 라벨을 도시한다. 그것은 Mfn2 에피토프 인해 자신과의 상호 작용 또는 다른 바인딩 파트너 또는 번역 수정을 게시 인해 사용할 수없는 것을 가능하다. 참고로, 본 연구에서 항체는 N-말단 (아미노산 38-55)에 합성 펩티드를 사용하여 생성 하였다. 이 변형은 아직 실험적으로 확인 (UniProt 데이터베이스) 할 수 있지만 첫번째 302 아미노산이 부족 Mfn2의 예측 스플 라이스 변종이있다. 따라서, 이러한 분석은 사용 된 특정 항체의 N-말단 서열을 결여 대안 접합 Mfn2를 감지 할 수 없다.
미토콘드리아 막 횡단 전위 (ΔΨ의 m) 및 슈퍼 옥사이드 생산은이 분석에서 평가 될 수있다. 미토콘드리아 내막에 걸쳐, 전하의 분리 ㅁ가있다무형 문화 유산은 산화 적 인산화를 통해 ATP 생산을 구동한다. TMRM는 막 전위에 의존하는 방식으로 5 미토콘드리아 안에 축적 양이온 염료이므로, 미토콘드리아 막 관통 전위의 리포터로 사용될 수있다. 미토콘드리아 (95 %)의 대부분은 제어 흠 (도 3a)에 비해, 염색 후 TMRM 긍정적이다. 그러나 uncoupler의 CCCP 첨가 TMRM 때 (도 3A)을 유지할 수 미토콘드리아 수의 유의 한 감소가있다. CCCP은 본질적으로 전하의 분리를 파괴하고 세포막을 탈분극, 미토콘드리아 내막을 가로 질러 이온의 자유로운 통과를 허용한다.
복소 I 및 전자 수송 체인의 III에서 산화 적 인산화의 정상적인 부산물로서 미토콘드리아 분리 과산화물. 미토콘드리아 슈퍼 옥사이드는 미토콘드리아에 표적과 형광 FOLLO이된다 막 투과성 염색을 통해 측정 할 수있다날개 슈퍼 옥사이드 7 반응. 기능 미토콘드리아는 흠없는 샘플 (그림 3B)에 비해 초과 산화물의 기저 양을 생산하고 있습니다. 복합 III 억제제 Antimycin 첨가 개화의 우측 시프트 및 미토콘드리아 높은 숫자로 된 것과 같이, 초과 산화물의 증가를 산출한다 (일반적으로 ~ 10 %)이 미토콘드리아 과산화물 지시 염료 (도 3B)와 형광체이다.
격리, immunolabeling와 미토콘드리아의 분석 그림 도식. 1 단계 : 조직을 수집하고 균질화 2 단계 :. 분리 절차는 팔 원심 분리 단계가 포함되어 있습니다. 미엘린은 중추 신경계 조직의 주요 밀폐 Iodixanol (밀도 구배 매질) 및 센트리으로 미토콘드리아를 희석에 의해 제거된다미토콘드리아는 펠렛 동안 fuging, 튜브의 상단에 떠있는 수초의 결과로 3 단계 :. 격리 및 금액을 계산하고, 미토콘드리아 1 차 항체로 표지 및 세척이 차단됩니다. 형광 접합 차 항체는 추가됩니다. 언 바운드 항체는 세척되는 4 단계 :. 미토콘드리아 순도, 또는 미토콘드리아 기능에 대해보고 형광 염료를 추가 할 수있는이 시점에서 5 단계 :. 미토콘드리아는 이제 유세포 분석 할 준비가 된 것입니다.
흐름에 의해 격리 된 미토콘드리아의 분석을 위해 그림 2 전략은 세포 계측법. 앞으로 분산 형 (FSC)와 사이드 분산 형 (SSC) 전압은 로그 모드에서 두 매개 변수를 사용하여 작은 이벤트를 조정해야합니다. FSC 폭 (FSC-W) 데이터가 있어야합니다이중선을 제외 수집. 주, 가장 유동 세포 계측기에, FSC 및 SSC에 대한 기본 설정 값은 선형 모드 (B) 이중선. 도트 플롯에 수집 된 모든 이벤트를 시각화 (A). 인 동시에 레이저로 흘러가이 미토콘드리아는 구별 될 수있다 FSC-W (선형 모드) 대 FSC 플롯에 의해 단봉. FSC-W 값, 즉 이벤트, 짙은 구름 내의 경우는 대부분의 배 이상의 평균 FSC-W 값이있는 경우 이벤트는 제외됩니다. 이 임계 값에 따라 이벤트가 단일체로 문이있다. (C) 다시 말하지만, 도트 플롯의 이벤트를 시각화 및 게이트 나머지 이벤트에 대한. (D)가 흠없는 샘플의 히스토그램 플롯 (고체, 충전, 회색) 및 샘플 염색 미토콘드리아 특정 염료 (MSD : 고체, 녹색). 게이트 MSD (MSD +). (E) 이소 타입 제어, 토끼의 IgG의 히스토그램에 대한 긍정적 인 얼룩 이벤트 (검은 점선)과 Mfn2 표시된 샘플 (고체, 핑크).이소 제어 피크 ≤ 1 % Mfn2 + 수율 및 Mfn2 (Mfn2 +)에 대한 긍정적 인 라벨 사건의 비율을 결정하는 실험 샘플이 동일한 게이트를 적용 할 수 있도록 게이트를 설정합니다. 이의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오 그림.
유동 세포 계측법에 의해 격리 된 미토콘드리아의 그림 3 시금 미토콘드리아 막 횡단 전위 (ΔΨ의 m) 및 슈퍼 옥사이드 생산. (고체, 회색, 충전) 염료가 막 횡단 잠재력을 가진 미토콘드리아에 축적하기 때문에 흠없는 컨트롤에 비해 모든 활성 미토콘드리아가 (고체, 검은 색) TMRM와 라벨을 붙인다 기초 조건에서 (A). 아디 (점선, 파랑) protonophore의 CCCP의 기는 탈분극 적은 기저 상태에 비해 염료 유지하기 위해 미토콘드리아의 원인이되는 횡단 잠재력을 소비한다. 데이터는 기저 조건에서 형광 강도가 샘플의 평균 형광 강도로부터 감산 흠 제어의 평균 형광 강도를 나타낸다 (ΔMFI). (B)를 의미 델타로보고, 미토콘드리아 산화의 부산물로서 과산화물을 생성 인산화. 흠 제어 (고체, 회색, 작성)에 비해 : 슈퍼 옥사이드의이 미토콘드리아 소스는 미토콘드리아 슈퍼 옥사이드 표시, (고체, 검은 색 MitoO 2)으로 정량 할 수있다. 복합 III 억제제 Antimycin의 첨가는 증가 된 수퍼 옥사이드 생산 (점선, 오렌지) 결과, 기저 수준과 비교 하였다. 데이터는 MitoO 2 표시기에 양성 염색 세포의 비율로보고됩니다.K ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이는 미토콘드리아가 정상적인 생리와 질병 모두에서 핵심 선수임을 점점 더 분명하다. 면역 블로는 특정 조건에서 미토콘드리아 내에서 또는 미토콘드리아 표면에 전체 인구의 평균이 방법 보고서를 발견되는 단백질을 확인할 수있다. 이 방법은 미토콘드리아 개체군 또는 부분 집합의 상대적 농도에 대한 정보를 얻을 수 없습니다. 이 왔지만 이전에 모든 미토콘드리아가 동등하게 필드가 점점 세포 내 미토콘드리아 인식되어 만든 형태 및 / 또는 기능 (10)의 측면에서 광범위한 변화를하고 있다고 가정.
형광 현미경의 접근 방식이 계정에 미토콘드리아의 이질성을 않습니다. 그러나, 이러한 유형의 데이터의 정량화는 노동 집약적이다. 또한,이 접근법은 / 반응계에서 기인 exces하기 어려운 생체 내 미토콘드리아의 표지로서, 배양 된 세포를 사용하는 연구에 더 적합현재 미토콘드리아의 시브 수, 개별 세포 기관의 분화가 본질적으로 어렵게 만든다. 대부분의 면역 세포 화학 프로토콜에서는 인해 항체 라벨링 필요한 셀룰러 permeabilization 단계와 동시에 외부 미토콘드리아 막 단백질에 라벨 및 미토콘드리아 기능을 평가하는 것은 불가능하다. 현재의 방법은 permeabilization 단계를 필요로하지 않는, 따라서 고립 된 미토콘드리아와 함께 작동합니다. 또한, 개별 미토콘드리아의 시각화는 미토콘드리아 기능의 분석 의무가없는 전자 현미경을 통해서만 가능하다. 그게 우리가 조직에서 미토콘드리아의 분리는 미토콘드리아 네트워크의 중단에 이르게하고이 미토콘드리아 기능의 일부 요소에 영향을 미칠 수 있음을 인식했다되고. 그러나 유사하게 처리 조직으로부터 격리 된 미토콘드리아의 기능적인 측면의 비교는 유효한 상태로 유지됩니다.
조직 유래 isolat와의 immunolabeling이 방법유동에 의한 ED 미토콘드리아 및 후속 분석 계측법 감지 외막에있는 단백질의 존재를 모니터링하는 신속하고 정량적 방법을 허용한다. (Mfn2 등) 매우 풍부한 미토콘드리아 단백질의 검출이 기술로 가능하다. 마찬가지로,이 방법은 근 위축성 측삭 경화증 (ALS) (11)의 맥락에서 잘못 폴딩 된 SOD1 같은 질환에서 미토콘드리아 막 상에 증착되는 낮은 풍부한 단백질을 검출 할 수있다. 또한,이 방법은 일시적으로 정상 기능의 일부로서 미토콘드리아 표면과 연관 단백질을 모니터링하는 것이 유용 할 수있다. 예로 Dynamin 관련 단백질 -1 (Drp1)으로 미토콘드리아 활성 산소 종을 보강 미토콘드리아에 옭 미토콘드리아 분열 (12) 및 종양 괴사 인자 수용체 - 연관된 인자 6 (TRAF6)를 촉진하기 위해 미토콘드리아에 채용되는 세포질 단백질 선천성 면역 반응 (13)의 일부.
세포 내 표지 용 표준 프로토콜 permeabilization 미토콘드리아의 구조적 완전성을 방해 세제를 필요로 현재이 기술은, 단지 표면에 위치 미토콘드리아 단백질 의무가있다. 가능한 시약의 개수 (미공개) 시도되었지만, immunolabeling 프로토콜의 추가적인 최적화는 여전히 내 미토콘드리아 성분을 검출하는 의무가이 프로토콜을 만들기 위해 필요하다.
이 기술은 광범위한 응용을 가지며 다른 실험 패러다임 하에서 미토콘드리아에 존재하거나 하나 이상의 단백질의 모집을 검출하는데 사용될 수있다. 또한, 미토콘드리아는 두 개의 서로 다른 항체와뿐만 아니라 형광 표시 (11)와 공동으로 편집 할 수 있습니다. 기타 형광 프로브는 미토콘드리아 기능의 추가 측면을 특성화 혼입 될 수있다. 예를 들어, 시판되는 염료는 미토콘드리아의 pH가 14을 모니터링 (15), 및 ATP 수준 (16) 칼슘의 흡수는 가능합니다.
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Disclosures
저자가 공개하는 게 없다.
Acknowledgments
우리는 흐름 cytometer에 액세스 로리 Destroismaisons과 뛰어난 기술 지원을 사라 Peyrard 및 Dr.Alexandre 프라 감사합니다. 우리는 또한 준비에서 수초의 제거에 대한 그의 기여에 대한 박사 티모시 밀러를 인정하고 싶습니다. 이 작품은 건강 연구 (CIHR) 신경 근육 학 연구 파트너십, 혁신에 대한 캐나다 재단, 캐나다의 ALS 협회, ALS 연구를위한 프릭 재단, 미끼 재단과 퐁 드 라 공들인 엉 상테 퀘벡 (CVV)의 캐나다 연구소에 의해 지원되었다. 두 CVV 및 NA는 연구 학자 퐁 드 라 공들인 엉 상테 퀘벡 및 CIHR 새로운 수사. SP 캐나다의 ALS 협회에서 팀 노엘 재학 지원됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BD FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
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