La inmunodetección de la membrana externa proteínas por Citometría de Flujo de mitocondrias aisladas

Resumen

Se describe aquí es un método para detectar y cuantificar proteínas de la membrana externa mitocondrial por inmunomarcaje de las mitocondrias aisladas de tejido de roedores y análisis por citometría de flujo. Este método puede ampliarse para evaluar los aspectos funcionales de subpoblaciones mitocondriales.

Resumen

Métodos para detectar y controlar los componentes de proteína de membrana externa mitocondrial en los tejidos animales son vitales para estudiar la fisiología mitocondrial y la fisiopatología. Este protocolo describe una técnica donde las mitocondrias aisladas de tejido de roedores se immunolabeled y se analizaron por citometría de flujo. Las mitocondrias se aislaron a partir de roedores médulas espinales y se sometieron a una etapa de enriquecimiento rápido a fin de eliminar la mielina, un contaminante principal de las fracciones mitocondriales preparadas a partir de tejido nervioso. Mitocondrias aisladas se marcaron a continuación con un anticuerpo de elección y un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia. Análisis por citometría de flujo verifica la pureza relativa de las preparaciones mitocondriales por tinción con un colorante específico mitocondrial, seguido por la detección y cuantificación de la proteína immunolabeled. Esta técnica es rápida, cuantificable y de alto rendimiento, lo que permite el análisis de cientos de miles de mitocondrias por muestra. Es aplicable para evaluar novela proteins en la superficie mitocondrial en condiciones fisiológicas normales, así como las proteínas que pueden convertirse en mislocalized a este orgánulo durante la patología. Es importante destacar que este método puede ser acoplado a colorantes indicadores fluorescentes para informar sobre ciertas actividades de las subpoblaciones mitocondriales y es factible para las mitocondrias del sistema nervioso central (cerebro y médula espinal), así como el hígado.

Introducción

Las mitocondrias son orgánulos muy dinámicos que se someten a múltiples rondas de la fisión y la fusión, son transportados a sitios de alta demanda energética y responder rápidamente a los estímulos fisiológicos ^1. Dado que se reconoce cada vez más que las mitocondrias dentro de los diferentes tejidos, incluso diferentes compartimentos celulares, tienen perfiles funcionales distintos, se necesitan nuevos métodos para identificar estos subconjuntos mitocondriales distintos.

Microscopía proporciona un medio por el cual las mitocondrias individuales se pueden visualizar y la presencia de una proteína en, o en las mitocondrias pued....

Protocolo

Los animales utilizados en este estudio fueron tratados en estricta conformidad con un protocolo (N08001CVsr) aprobado por el l'Université de Montréal (CRCHUM) Comité Centre de Recherche du Centre Hospitalier de de Institucional para la Protección de los Animales que sigue los estándares nacionales tal como se indica por la Canadian Consejo de los Animales (CCPA).

Preparar todos los reactivos necesarios para llevar a cabo este protocolo (Tabla 1). Todos los demás detalles relacionados con el equipo, los suministros y proveedores se encuentran en la Lista de Materiales.

Resultados

Las mitocondrias derivadas de médula espinal de rata se pueden immunolabeled con un anticuerpo dirigido a Mitofusin2 (Mfn2), una proteína implicada en la fusión de la membrana externa de las mitocondrias ^8. Tras el aislamiento y el etiquetado con un anticuerpo específico Mfn2 y un anticuerpo secundario conjugado con fluorescencia, las mitocondrias son procesados ​​por citometría de flujo (Figura 1). Después de la adquisición de datos, las muestras se analizaron mediante citometría de flujo de.......

Discusión

Es cada vez más evidente que las mitocondrias son actores clave en la fisiología normal y la enfermedad. Mientras inmunotransferencia puede determinar qué proteínas se encuentran dentro de las mitocondrias o en la superficie mitocondrial en una cierta condición, este método informes sobre la media de toda la población. Este método no puede dar información sobre la abundancia relativa de las subpoblaciones o subconjuntos mitocondriales. Si bien ha sido asumido previamente que todas las mitocondrias son iguales, el campo .......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ratas	Charles River	Código de cepa 400	Adulto (9 semanas a 18 semanas) Se pueden utilizar ratas macho o hembra para el protocolo de aislamiento. El peso de las ratas depende del sexo y la edad (los machos entre 300 y 500 g y las hembras entre 200 y 350 g) se suelen utilizar.
Homogeneizador de onzas	Kontes Glass Co.	885450-0022	Microcentrífuga Duall 22
	Thermo Scientific		Sorvall Legend Micro 17 R
Tubos ultracentrífugos ultratransparentes	Beckman Coulter	344057	Transparente, de pared fina
Ultracentrífuga Sorvall Thermo	Scientific		Sorvall WX UltraSeries
AH-650	Thermo Scientific
Opti-prep	Axis-Shield	1114542	Iodixanol, medio de gradiente de densidad
Sin ácidos grasos Albúmina sérica bovina Sigma		A8806	Debe estar libre de ácidos grasos para las mitocondrias
Succinato de sodio dibásico hexahidratado	Sigma	S9637
Anticuerpo anti-Mitofusina2 para conejos	Sigma	M6319
IgG para conejos	Jackson Immuno Research	011-000-003
Anti-Rabbit IgG PE	eBioscience	12-4739-81
Micro tubo de titulación	Bio-Rad	223-9391	Para la adquisición de muestras por citometría de flujo
MitoTrackerGreen (MTG)	Invitrogen	M7514	100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm
TMRM	Invitrogen	T668	100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm
CCCP		Sigma C2759
MitoSOX Red	Invitrogen	M36008	5 µ M: Ex 540 nm/Em 600 nm
Antimicina A	Sigma	A8874
LSR II citómetro de flujo	BD
BD FACSDiva Software	BD
FlowJo	TreeStar Inc.		Software utilizado para el análisis
del kit de ensayo de proteínas BCA	Bradford Pierce/Thermo Scientific	23225	ya que no es compatible con altas concentraciones de SDS