Summary
Hier beschreven is een methode voor het opsporen en kwantificeren mitochondriale buitenmembraan eiwitten door immunokleuring van mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel en analyseren door flowcytometrie. Deze werkwijze kan worden uitgebreid tot functionele aspecten mitochondriale subpopulaties beoordelen.
Abstract
Methoden voor het opsporen en monitoren mitochondriale buitenste membraan eiwit componenten in dierlijke weefsels zijn van vitaal belang om mitochondriale fysiologie en pathofysiologie bestuderen. Dit protocol beschrijft een techniek waarbij mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsel immunologisch en door flow cytometrie geanalyseerd. Mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren ruggenmerg en onderworpen aan een snelle verrijkingsstap om myeline, een belangrijke verontreiniging van mitochondriale fracties bereid uit zenuwweefsel verwijderen. Geïsoleerde mitochondria worden dan gelabeld met een antilichaam van keuze en een fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam. Analyse door flow cytometrie controleert de relatieve zuiverheid van mitochondriale preparaten door kleuring met een mitochondriale specifieke kleurstof, gevolgd door detectie en kwantificering van eiwit immunologisch. Deze techniek is snel, kwantificeerbare en high-throughput, waardoor de analyse van honderden duizenden mitochondria per monster. Het is van toepassing op nieuwe p beoordelenroteins het mitochondriale oppervlak onder normale fysiologische omstandigheden en de eiwitten die in pathologie mislocalized kunnen worden bij dit organel. Belangrijk is, kan deze methode worden gekoppeld met fluorescentie-indicator kleurstoffen verslag over bepaalde activiteiten van mitochondriale subpopulaties en haalbaar is voor mitochondriën van het centrale zenuwstelsel (hersenen en ruggenmerg) en lever.
Introduction
Mitochondriën zijn zeer dynamische organellen die meerdere rondes van kernsplijting en kernfusie ondergaan, worden vervoerd naar sites van hoge vraag naar energie en snel te reageren op fysiologische stimuli 1. Aangezien meer en meer erkend dat mitochondriën in verschillende weefsels, zelfs verschillende cellulaire compartimenten, hebben verschillende functionele profielen nieuwe methoden nodig om deze verschillende mitochondriale subsets identificeren.
Microscopie verschaft een middel waarmee individuele mitochondria worden gevisualiseerd en de aanwezigheid van een eiwit op of in mitochondriën kan worden bepaald door immunofluorescentie 2. Echter, kwantitatieve analyse van deze methode is arbeidsintensief en is meer geschikt voor experimenten met geïmmortaliseerde of primaire cellijnen. De studie van individuele mitochondria uit weefsel aanzienlijk moeilijker en de meeste methoden niet mogelijk voor gemakkelijke identificatie van mitochondriale subsets gelijktijdig met de evaluatie van de mitochondriale functie 3.
Om deze hindernis, een nieuwe werkwijze voor mitochondriën geïsoleerd uit knaagdieren weefsels en vervolgens geanalyseerd door flow cytometrie immunolabel aanpakken ontwikkeld. Dit maakt de snelle detectie en kwantificering van eiwitten gelokaliseerd in de buitenste mitochondriale membraan, die aan microscopie opzichte analyse is veel minder arbeidsintensief en maakt de analyse van duizenden mitochondria in een enkel monster. Deze test kan worden toegepast op het lot en de relatieve hoeveelheid mitochondriaal buitenste membraaneiwitten die geacht constitutief aanwezig in de mitochondriën te volgen, de rekrutering van eiwitten aan het oppervlak mitochondriale of de detectie van proteïnen mislocalized naar de mitochondriën bij pathologische omstandigheden. Bovendien is de integratie van conventionele fluorescente indicator kleurstoffen maakt het gelijktijdige evaluatie van bepaalde aspecten van mitochondriale functie in verschillende mitochondrialesubpopulaties.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dieren die in deze studie werden in strikte overeenstemming met een protocol (N08001CVsr) door het Centre de Recherche du Centre Hospitalier de l'Universite de Montreal (CRCHUM) Institutionele Commissie voor de bescherming van dieren goedgekeurd die de nationale normen zoals die door de Canadese volgt behandeld Raad over Animal Care (CCAC).
Bereid alle reagentia die nodig zijn om dit protocol (Tabel 1) uitvoeren. Alle andere details met betrekking tot uitrusting, voorraden en leveranciers zijn te vinden in de lijst van materialen.
Tabel 1 Buffer Samenstellingen.
1 Verzameling van Rat Spinal Cord
- Diep verdoven van de rat (Sprague Dawley) met 4% isoflorane. Verifiëren verdoving door een gebrek aan reflex na knijpen van the voorpoot. Euthanaseren de ratten onthoofd via guillotine. Deze methode van euthanasie de voorkeur boven andere, die het ruggenmerg kan vervalsen.
- Snijd de huid van de rug naar de ruggengraat bloot. Snijd de wervelkolom met been schaar net boven het schaambeen. Visualiseer de opening van de wervelkolom.
- Plaats een injectiespuit 10 ml, met een 200 ul pipetpunt (verbonden via enigszins smelten boven vlam), gevuld met fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS), in de wervelkolom.
- Spoel het ruggenmerg door een medium voldoende druk op de plunjer.
- Als er bloed aanwezig is op het ruggenmerg, spoelen met PBS alvorens de volgende stap.
OPMERKING: Deze methode is ook gevalideerd voor de hersenen en de lever. Als waaronder deze weefsels verzamelen halve hersenen van de rat gedood en een stuk lever gelijk gewicht aan het ruggenmerg. Alle andere stappen blijven identiek.
2 Isolatie van Spinal Cord Mitochondria (Aangepast van Vande Velde et al. 4)
- Verzamel de gehele intact ruggenmerg en plaats in 5 ml glashomogenisator met 5 volumes (~ 3,25 ml) homogenisatiebuffer (HB). Voor een optimaal herstel van geïsoleerde mitochondriën, voeren alle stappen op het ijs of in een koude kamer. Homogeniseren weefsel met de hand tot er geen grote stukken weefsel blijven, ongeveer acht slagen. Plaats homogenaat in twee (2 ml) of drie (1,7 ml) microcentrifuge buisjes. Centrifuge 1300 xg gedurende 10 min bij 4 ° C in een microcentrifuge benchtop.
- Recover supernatant en plaats in een 5 ml ultracentrifuge buis. Voeg 750 ul (~ 0,5 volumes) HB aan de pellet met microcentrifugebuisje en voorzichtig resuspendeer de pellet. Herhaal centrifugeren en resuspensie stappen nog twee keer. Pool alle bovenstaande vloeistoffen (S1a en S1b) in dezelfde 5 ml ultracentrifuge buis boven. Deze stap dient om kleine vuil te verwijderen.
- Centrifuge gepoolde S1 met behulp van een ultracentrifuge uitgerust met een swingende emmer rotof en centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- Blijf supernatant (S2) voor verdere verwerking als de cytosolische fractie van belang (bijvoorbeeld Western blot analyse). Resuspendeer de pellet (P2), het ruwe mitochondriale fractie in 4 ml HB + 50 mM KCl. Centrifuge 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C in een swinging bucket rotor. Verwijder het supernatant en voorzichtig resuspendeer de pellet (P3) in 800 ul HB.
OPMERKING: Mitochondria worden gewassen met HB + 50 mM KCl alle niet-specifieke mitochondriën geassocieerde verontreinigingen. - In een nieuwe 5 ml ultracentrifuge buis, voeg precies 800 ul geresuspendeerde pellet (P3).
- Om deze tube, 200 pl iodixanol (dichtheidsgradiënt medium), waardoor een eindconcentratie van 12% iodixanol maken. Meng de inhoud van de buis voorzichtig maar grondig door pipetteren met een P1000. Toevoeging van iodixanol eerste, en vervolgens opnieuw gesuspendeerd pellet (P3) kan de voorkeur verdienen om grondig mengen te vergemakkelijken. Centrifugeren in een ultracentrifuge met een swinging bucket rotor bij 17.000 xg gedurende 15 min bij 4 ° C.
- OPMERKING: Lever geen myeline bevatten en daarom is deze stap is niet nodig als alleen de lever wordt verwerkt. Echter, als de lever wordt gelijktijdig verwerkt met CNS mitochondriën, is het raadzaam om alle weefsels gelijk te behandelen.
- Zuig de laag van myeline bovenaan de buis en verwijder de bovenstaande vloeistof. Pellet mogelijk los zit. Resuspendeer de pellet in 4 ml HB. Centrifugeer opnieuw bij 17.000 xg gedurende 10 min bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 4 ml HB. Herhaal het centrifugeren en de bovenstaande vloeistof.
- Resuspendeer de uiteindelijke pellet (P7) in 100-200 ul HB en overbrengen in een 1,7 ml microcentrifugebuis. Deze steekproef bevat geïsoleerde mitochondriën.
- Ga verder met eiwit kwantificering. Verdun monsters en de standaard kromme in 2% natriumdodecylsulfaat (SDS) passende solubilisatie van mitochondria duri waarborgenng eiwit kwantificering.
3 immunolabeling van Geïsoleerde Mitochondriën voor flowcytometrie
- Voor elke kleuring mengsel te testen, pipet 25 ug geïsoleerde mitochondria in een 1,7 ml microcentrifugebuis. Inclusief een ongekleurde monster in elk experiment; en voor elk antilichaam, moet u een monster voor de juiste isotypecontrole bevatten.
- Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C in een bench-top microcentrifuge.
- Verwijder de supernatant en resuspendeer geïsoleerde mitochondria in 50 ul Buffer Mitochondria (M buffer) aangevuld met 10% vetzuurvrij BSA gedurende 15 min bij 4 ° C (blokkeringsstap).
OPMERKING: Bij etikettering incubaties uitgevoerd in een koelkast bij 4 ° C. - Voeg primair antilichaam (konijn anti-MFN2, 20 ug per ml) aan de buis en incubeer gedurende 30 minuten bij 4 ° C.
OPMERKING: Bepaal een optimale concentratie van elk antilichaam empirisch door titratie. Vanwege de variabiliteit in concentratie en / of purity, verschillende partijen van hetzelfde antilichaam van dezelfde fabrikant kan leiden tot verschillende resultaten; Daarom titratie nodig voor elke nieuwe partij antilichamen. - Spoel ongebonden primaire antilichaam: Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet voorzichtig in 200 pl M-buffer. Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder en resuspendeer de pellet in 50 ul M Buffer.
- Voeg secundair antilichaam (ezel anti-konijnen IgG fycoerythrine (PE), 0,5 ug per ml) aan de buis en incubeer de monsters gedurende 30 min bij 4 ° C, beschermd tegen licht.
- Spoel ongebonden secundair antilichaam: Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 minuten bij 4 ° C. Verwijder het supernatant en resuspendeer de pellet in 200 pl M-buffer. Centrifugeer bij 17.000 xg gedurende 2 min bij 4 ° C. Verwijder en resuspendeer de pellet in 500 pi M Buffer.
- Om ervoor te zorgen gebeurtenissen zijn in feite mitochondriën, vlek geïsoleerd mitochondria met eenmitochondriën specifieke fluorescente kleurstof gedurende 15 minuten bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Als kleuring van andere functionele parameters (mitochondriale transmembraanpotentiaal- of superoxide productie) gewenst is, ga dan naar stap 4 Zo niet, ga dan naar stap 5 voor de overname.
OPMERKING: Het is belangrijk om te controleren of het emissiespectrum van het secundaire antilichaam is compatibel met dat van de functionele kleurstoffen. Bijvoorbeeld als controle mitochondriale zuiverheid met een commercieel kleurstof met spectrale eigenschappen die vergelijkbaar FITC en transmembraanpotentiaal met tetramethylrhodamine methyl ester (TMRM), een levensvatbare tweede antilichaam moet allofycocyanine (APC: Ex 650 nm / Em 660 nm). Voeg compensaties controles, dat wil zeggen, een monster immunolabeled of gekleurd met een enkele fluorofoor, indien van toepassing. - Over te dragen aan een buis die geschikt zijn voor het laden doorstroomcytometer. (Voor de kleine steekproef, een microtiterplaat buis wordt geplaatst binnen 3 ml stromingscytometer buis te vergemakkelijken.) Houd monsters op ijs en onmiddellijk overgaan totstromingscytometer voor overname.
4 Het testen Mitochondriale transmembraanpotentiaal- en Mitochondriale superoxide productie door flowcytometrie
- Controleer geïsoleerde mitochondria een intact transmembraanpotentiaal door kleuring met 100 nM TMRM (Ex 548 nm / Em 574 nm) 5, in stap 3.8, gedurende 15 min bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht. Ter vergelijking van transmembraanpotentiaal tussen monsters en populaties, gebruik van lagere / niet-quenching concentratie van TMRM (1 tot 30 nM) meer geschikt kunnen zijn 6.
- Als controle voor TMRM kleuring, vlek geïsoleerde mitochondria 100 nM TMRM in aanwezigheid van 100 uM carbonyl cyanide m-chloor fenyl hydrazine (CCCP), een mitochondriale ontkoppelaar die mitochondria zal depolariseren. De concentratie van CCCP vereist om de mitochondriën depolariseren kan lager zijn indien lagere concentraties kleurstof worden gebruikt.
- Controleer of geïsoleerde mitochondria produceren mitochondriale superoxide door staining met een geschikt mitochondrial superoxide indicator 7, ook in stap 3.8, gedurende 15 min bij kamertemperatuur, beschermd tegen licht.
- Als controle voor mitochondriële superoxideproductie, vlek geïsoleerde mitochondria kleurstof in aanwezigheid van 10 uM Antimycin A, een remmer van complex III van de mitochondriale ademhalingsketen dat superoxide productie verhogen.
5 Verwerving en Analyse van immunolabeled Geïsoleerde Mitochondriën door flowcytometrie
- Instrument opgezet: Switch voltages van lineair naar de modus te melden bij de analyse van geïsoleerde mitochondriën en stel spanningen vergemakkelijken (FSC: 450; SSC: 250). Controleer of gebeurtenissen verzameld FSC-A (stippellijn) modus als FSC-W (breedte) en FSC-H (hoogte), kunnen wambuizen (exclusief dwz twee gebeurtenissen, die door de detector tegelijkertijd ) in de analyse van de collectie post-data. Stel het aantal evenementen te innen tot 100.000. Verwerven compensatie controles, Indien van toepassing.
- Data-acquisitie: Voor data-acquisitie, vermijd vortexen monsters. In plaats meng door zachtjes te tikken buis. Aanvankelijk events verzamelen bij een lage druk gedurende gating. Poort op de totale bevolking. Pas spanningen histogrammen bijgevolg meestal de piek van het ongekleurde monster is gelijk aan het tweede decennium (10 2). Zodra poorten zijn gevestigd, en monsters worden verwerkt, kan de druk worden overgeschakeld naar hoog.
- Analyse: Visualiseer wambuizen door het plotten van FSC-W versus FSC. Identificeer borstrokken en wambuizen. Poort op singlets. Selecteer de mitochondriale populatie door gating op gebeurtenissen die positief zijn gekleurd met een mitochondriaal-selectieve kleurstof.
- Bepaal achtergrond labeling van isotype controle. De isotype controlemonster, het percentage bepalen van de mitochondriale etikettering positief MFN2 antilichaampopulatie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Mitochondriën afgeleid van rat ruggenmergen kunnen immunologisch met een antilichaam gericht op Mitofusin2 (MFN2), een eiwit betrokken bij de fusie van de buitenmembraan van mitochondria 8. Na isolatie en labeling met een MFN2 specifiek antilichaam en een fluorescent geconjugeerd secundair antilichaam, mitochondria worden verwerkt door flowcytometrie (figuur 1). Volgende data-acquisitie, worden monsters geanalyseerd met behulp van flowcytometrie analyse software, door eerst te visualiseren alle verzamelde gebeurtenissen op een dot plot (Figuur 2A). Wambuizen en singlets worden onderscheiden als de gebeurtenissen zijn uitgezet in FSC, breedte (B) versus ruimte (A) (Figuur 2B). Zodra singlets zijn geselecteerd, de poort van de mitochondriale populatie via FSC / SSC (figuur 2C), en controleer het aantal evenementen die positief kleuren voor mitochondria-specifieke kleurstof door co-plotten van een histogram van de ongekleurde monster met een monster gekleurd met de mitochondriën-spefieke kleurstof. De mitochondriale gebeurtenissen bepalen plaats een poort aan het snijpunt van de twee pieken (figuur 2D). Voor ruggenmerg preparaten, kenmerkend> 90% van de gebeurtenissen zijn positief voor mitochondriën specifieke kleurstof. Voor andere weefsels zoals lever, ~ 98% van de evenementen label met de kleurstof (data niet getoond). Na het selecteren van slechts gebeurtenissen die positief label voor mitochondriën specifieke kleurstof Bepaal achtergrond labeling met het isotype controle door het selecteren van een poort (MFN2 +) dat 1% of minder isotype labeling (figuur 2E, links) omvat. Breng deze poort eenvormige wijze voorziene monsters antilichaam MFN2 het percentage mitochondria MFN2 aanwezig op de buitenste mitochondriale membraan (figuur 2E, rechts) te bepalen. In dit experiment werd 30% van mitochondriën afkomstig van ruggenmerg label positief MFN2. Het is belangrijk om hier op te merken, dat MFN2 maar wordt beschouwd als een alomtegenwoordig uitgedrukt mit zijnochondrial buitenste membraaneiwit het is niet eerder gekwantificeerd. Bovendien is een immunocytochemische analyse van MFN2 in gekweekte cellen geeft een niet-homogene kenmerken van individuele mitochondria 9. Het is ook mogelijk dat de MFN2 epitoop was niet beschikbaar vanwege translationele modificaties plaatsen of door interacties met zichzelf of andere bindingspartners. Opmerkelijk is het antilichaam in deze studie werd gegenereerd met een synthetisch peptide met de N-terminus (aminozuren 38-55). Er is een voorspelde splice variant van MFN2 zonder de eerste 302 aminozuren, hoewel deze variant nog experimenteel bevestigd (UniProt database). Aldus is deze test niet kan alternatief gesplitste MFN2 zonder de N-terminale sequentie te detecteren, aangezien het antilichaam gebruikt.
Mitochondriale transmembraanpotentiaal- (ΔΨ m) en superoxide productie kan worden beoordeeld in deze test. Over het binnenste mitochondriale membraan, is er een scheiding van lading which drijft ATP productie via oxidatieve fosforylering. TMRM is een kationische kleurstof die zich ophoopt in de mitochondria in een membraanpotentiaal afhankelijke wijze 5, en daarom worden gebruikt als een reporter van mitochondriale transmembraanpotentiaal. De meeste mitochondria (95%) zijn positief TMRM na kleuring, vergeleken met de ongekleurde controle (Figuur 3A). Wanneer de ontkoppelaar CCCP wordt toegevoegd is er een significante daling in het aantal mitochondria kunnen TMRM (figuur 3A) behouden. CCCP kan de vrije doorgang van ionen door de binnenste mitochondriale membraan, wezen vernietigen de scheiding van lading en depolariseren het membraan.
Mitochondriën afgifte superoxide als normaal bijproduct van oxidatieve fosforylering van complex I en III van het elektron transport keten. Mitochondriale superoxide kan worden gemeten via een membraan permeabel kleurstof die is gericht op mitochondriën en wordt fluorescent following reactie met superoxide 7. Functionele mitochondria een basale hoeveelheid superoxide tegenover ongekleurde monsters (Figuur 3B). Toevoeging van het complex III inhibitor Antimycin A levert een toename van superoxide, zoals gezien door een verschuiving naar rechts in bloei en een groter aantal mitochondria (meestal ~ 10%) dat fluorescente deze mitochondriale superoxide indicatorkleurstof (figuur 3B) zijn.
Figuur 1 Schematische isolatie, immunokleuring en analyse van mitochondria. Stap 1: Verzamel materiaal en homogeniseren. Stap 2: De isolatie procedure bevat acht centrifugeren stappen. Myeline, wordt een belangrijke inperking van het centrale zenuwstelsel weefsel verwijderd door verdunning van mitochondriën in iodixanol (dichtheidsgradiënt- medium) en centrifuging, resulteert in de myeline drijven naar de top van de buis, terwijl de mitochondriën gepelleteerd. Stap 3: Na isolatie en kwantificering zijn mitochondria geblokkeerd gelabeld met primair antilichaam en gewassen. Een secundair antilichaam geconjugeerd aan een fluorofoor wordt toegevoegd. Ongebonden antilichaam wordt uitgewassen. Stap 4: Op dit punt fluorescente kleurstoffen die rapporteren over mitochondriale zuiverheid, of mitochondriale functie kan worden toegevoegd Stap 5:. Mitochondriën zijn nu klaar om te worden geanalyseerd door middel van flowcytometrie.
Figuur 2 Strategie voor de analyse van geïsoleerde mitochondria door flowcytometrie. Forward Scatter (FSC) en zijwaartse verstrooiing (SSC) spanningen worden aangepast kleine gebeurtenissen, waarbij zowel parameters logaritmische functie. FSC breedte (FSC-W) gegevens moeten wordenverzameld om wambuizen te sluiten. Let op, op de meeste flowcytometers, de standaardinstelling voor FSC en SSC is lineaire modus. (A) Visualiseer alle verzamelde gebeurtenissen op een dot plot. (B) wambuizen, twee mitochondria langs de laser op hetzelfde moment, kan worden onderscheiden van singlets door het plotten van FSC versus FSC-W (lineaire modus). Gebeurtenissen worden uitgesloten als de FSC-W waarde meer dan tweemaal de gemiddelde FSC-waarde W van de meeste gebeurtenissen, dat wil zeggen die deel uitmaken van de dichte wolk. Agendapunt onder deze drempel zijn gated als singlets. (C) Nogmaals, visualiseren van de gebeurtenissen in een dot plot, en hek aan de overige evenementen. (D) Maak een histogram van de ongekleurde monster (vaste, grijs, gevuld) en monster gekleurd met een mitochondriale specifieke kleurstof (MSD: massief, groen). De poort van de gebeurtenissen die positief kleuren voor de MSD (MSD +). (E) Histogram van de isotypecontrole, konijn IgG (gestippelde, zwart) en MFN2 gelabelde monster (vaste, roze).Stel de poort om zo ≤ 1% MFN2 + opbrengst op de isotypecontrole piek en deze zelfde poort van toepassing op experimentele monster om het percentage van de gebeurtenissen labelen positief voor MFN2 (MFN2 +) te bepalen. Klik hier om een grotere versie van deze foto figuur.
Figuur 3 Het testen van mitochondriale transmembraanpotentiaal- (ΔΨ m) en superoxide productie in geïsoleerde mitochondria door flowcytometrie. (A) Onder basisomstandigheden alle actieve mitochondria zal label met TMRM (vast, zwart), vergeleken met ongekleurde control (vast, grijs, vol) omdat de kleurstof accumuleert in mitochondria een transmembraanpotentiaal. Addi tie van de protonophore CCCP (stippellijn, blauw) verdwijnt de transmembraanpotentiaal- waardoor de mitochondriën te depolariseren en te behouden minder kleurstof in vergelijking met basale voorwaarden. Gegevens worden gerapporteerd als het delta gemiddelde fluorescentie-intensiteit (ΔMFI), de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van de ongekleurde control afgetrokken van de gemiddelde fluorescentie-intensiteit van het monster. (B) Onder basale omstandigheden, mitochondria superoxide als bijproduct van oxidatieve fosforylering. Deze mitochondriale bron van superoxide kan worden getest met een mitochondriale superoxide indicator (MitoO 2-vaste, zwart) vergeleken met ongekleurde control (vast, grijs, vol). Toevoeging van het complex III inhibitor, Antimycin A (onderbroken, oranje) resulteert in een verhoogde superoxide productie, vergeleken met basale niveaus. Gegevens worden gerapporteerd als percentage cellen die positief kleuren voor de MitoO 2-indicator.k "> Klik hier om een grotere versie van deze afbeelding te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Het wordt steeds duidelijker dat de mitochondriën zijn belangrijke spelers in zowel de normale fysiologie en ziekte. Terwijl immunoblotting kan bepalen welke eiwitten binnen mitochondria of het mitochondriale oppervlak in een bepaalde toestand, deze methode rapporten over het gemiddelde van de gehele populatie. Deze methode kan geen informatie over de relatieve abundanties van mitochondriale subpopulaties of subsets opleveren. Hoewel het is al eerder werd aangenomen dat alle mitochondriën zijn gemaakt gelijk, wordt het gebied steeds meer het besef dat mitochondriën in een cel hebben uitgebreide variatie qua morfologie en / of functie 10.
Fluorescentiemicroscopie benaderingen rekening houden met de heterogeniteit van mitochondria. Echter, kwantificering van dergelijke data is arbeidsintensief. Verder heeft deze methode beter geschikt voor studies met gekweekte cellen, als kenmerken van mitochondriën in vivo / in situ is moeilijk door de excessive aantal mitochondria aanwezig, waardoor differentiatie van individuele organellen inherent moeilijk. In de meeste immunocytochemie protocollen, is het ook niet mogelijk om tegelijkertijd te labelen buitenste mitochondriale membraan eiwitten en mitochondriale functie zoals deze door de cellulaire permeabilisatie stap vereist antilichaam labeling. De huidige methode werkt met geïsoleerde mitochondria en dus geen permeabilisatie stap vereist. Bovendien, de visualisatie van afzonderlijke mitochondriën is alleen mogelijk via elektronenmicroscopie, die niet vatbaar is voor de analyse van mitochondriale functie. Dat gezegd zijnde, we erkennen dat de isolatie van de mitochondriën van weefsel leidt tot verstoring van de mitochondriale netwerk en dit kan invloed hebben op een aantal elementen van de mitochondriale functie. Echter, een vergelijking van de functionele aspecten van geïsoleerde mitochondriën uit weefsels die op dezelfde wijze worden verwerkt, blijven geldig.
Deze methode van immunokleuring van weefsel afgeleide isolated mitochondria en daaropvolgende analyse door flowcytometrie maakt een snelle en kwantificeerbare methode voor het opsporen en controleren van de aanwezigheid van een eiwit op het buitenste membraan. Detectie van een zeer overvloedige mitochondriale eiwitten (zoals MFN2) is mogelijk met deze techniek. Evenzo kan deze methode lage abundantie proteïnen die alleen worden afgezet op de mitochondriale membraan ziekte, zoals verkeerd gevouwen SOD1 in de context van amyotrofische laterale sclerose (ALS) 11 te detecteren. Bovendien kan deze werkwijze nuttig zijn om de eiwitten die tijdelijk associëren met het mitochondriale oppervlak als deel van hun normale functie te controleren. Voorbeelden omvatten Dynamin-gerelateerde eiwit-1 (Drp1), een cytosolisch eiwit dat wordt aangetrokken naar de mitochondriën mitochondriale splijting 12 en tumornecrosefactor-receptor-geassocieerde factor 6 (TRAF6), die translokeert naar mitochondriën mitochondrial reactieve zuurstofsoorten vergroten als bevorderen Een deel van een aangeboren immuunrespons 13.
Momenteel is deze techniek vatbaar is alleen eiwitten bij het mitochondriale oppervlak standaard permeabilisatie protocollen voor intracellulaire labeling vereisen een detergent dat de structurele integriteit van mitochondria verstoort. Terwijl een aantal mogelijke reagentia zijn geprobeerd (niet gepubliceerd), wordt verdere optimalisatie van de immunokleuring wordt echter nog nodig om het protocol ontvankelijk voor detectie intra-mitochondriale delen ontstaan.
Deze techniek heeft brede toepassingen en kan worden gebruikt om de aanwezigheid of de werving van een of meer eiwitten naar de mitochondriën onder verschillende experimentele paradigma detecteren. Verder mitochondria samen worden gelabeld met twee verschillende antilichamen, evenals met fluorescerende indicatoren 11. Andere fluorescerende probes kunnen ook worden opgenomen om aanvullende aspecten van mitochondriale functie karakteriseren. Bijvoorbeeld commercieel beschikbare kleurstoffen mitochondriale pH 14 monitoren 15, en ATP niveaus 16 zijn mogelijk.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
Wij danken Laurie Destroismaisons en Sarah Peyrard voor uitstekende technische ondersteuning en Dr.Alexandre Prat voor de toegang tot de flowcytometer. Wij zouden ook graag Dr Timothy Miller erkennen voor zijn bijdrage met betrekking tot de verwijdering van myeline van de voorbereidingen. Dit werk werd ondersteund door de Canadese Institutes of Health Research (CIHR) Neuromusculaire Research Partnership, de Canadese Stichting voor Innovatie, ALS Society of Canada, de Frick Stichting ALS onderzoek, CHUM Stichting en het Fonds de la Recherche en Sante du Quebec (CVV). Zowel CVV en NA zijn wetenschappelijke onderzoekers van het Fonds de la Recherche en Sante du Quebec en CIHR nieuwe onderzoekers. SP wordt ondersteund door de Tim Noël studententijd van de ALS Society of Canada.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Rats | Charles River | Strain code 400 | Adult (9 weeks to 18 weeks) male or female rats can be used for the isolation protocol. Weight of rats is dependent on gender and age (males between 300 to 500 g and females between 200 to 350 g) are typically used. |
| Dounce homogenizer | Kontes Glass Co. | 885450-0022 | Duall 22 |
| Microcentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall Legend Micro 17 R | |
| Ultra-Clear Ultracentrifuge tubes | Beckman Coulter | 344057 | Transparent, thin walled |
| Sorvall Ultracentrifuge | Thermo Scientific | Sorvall WX UltraSeries | |
| AH-650 rotor and buckets | Thermo Scientific | ||
| Opti-prep | Axis-Shield | 1114542 | Iodixanol, density gradient medium |
| Fatty acid free Bovine Serum Albumin | Sigma | A8806 | Must be fatty acid free for mitochondria |
| Sodium succinate dibasic hexahydrate | Sigma | S9637 | |
| Rabbit anti-Mitofusin2 antibody | Sigma | M6319 | |
| Rabbit IgG | Jackson Immuno Research | 011-000-003 | |
| Anti-Rabbit IgG PE | eBioscience | 12-4739-81 | |
| Micro titer tube | Bio-Rad | 223-9391 | For sample acquisition by flow cytometry |
| MitoTrackerGreen (MTG) | Invitrogen | M7514 | 100 nM: Ex 490 nm/Em 516 nm |
| TMRM | Invitrogen | T668 | 100 nM: Ex 548 nm/Em 574 nm |
| CCCP | Sigma | C2759 | |
| MitoSOX Red | Invitrogen | M36008 | 5 µM: Ex 540 nm/Em 600 nm |
| Antimycin A | Sigma | A8874 | |
| LSR II flow cytometer | BD | ||
| BD FACSDiva Software | BD | ||
| FlowJo | TreeStar Inc. | Software used for analysis | |
| BCA protein assay kit | Pierce/Thermo Scientific | 23225 | Bradford assay is not recomended as it is not compatible with high concentrations of SDS |
References
- Itoh, K., Nakamura, K., Iijima, M., Sesaki, H.
- Narendra, D., Tanaka, A., Suen, D. F., Youle, R. J. Parkin is recruited selectively to impaired mitochondria and promotes their autophagy. J Cell Biol. 183, 795-803 (2008).
- Zorov, D. B., Kobrinsky, E., Juhaszova, M., Sollott, S. J. Examining intracellular organelle function using fluorescent probes: from animalcules to quantum dots. Circ Res. 95, 239-252 (2004).
- Vande Velde, C., Miller, T., Cashman, N. R., Cleveland, D. W. Selective association of misfolded ALS-linked mutant SOD1 with the cytoplasmic face of mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 105, 4022-4027 (2008).
- Loew, L. M., Tuft, R. A., Carrington, W., Fay, F. S. Imaging in five dimensions: time-dependent membrane potentials in individual mitochondria. Biophys J. 65, 2396-2407 (1993).
- Perry, S. W., Norman, J. P., Barbieri, J., Brown, E. B., Gelbard, H. A. Mitochondrial membrane potential probes and the proton gradient: a practical usage guide. Biotechniques. 50, 98-115 (2011).
- Xu, X., Arriaga, E. A. Qualitative determination of superoxide release at both sides of the mitochondrial inner membrane by capillary electrophoretic analysis of the oxidation products of triphenylphosphonium hydroethidine. Free Radic Biol Med. 46, 905-913 (2009).
- Otera, H., Ishihara, N., Mihara, K. New insights into the function and regulation of mitochondrial fission. Biochim Biophys Acta. 1833, 1256-1268 (2013).
- de Brito, O. M., Scorrano, L. Mitofusin 2 tethers endoplasmic reticulum to mitochondria. Nature. 456, 605-610 (2008).
- Wikstrom, J. D., Twig, G., Shirihai, O. S. What can mitochondrial heterogeneity tell us about mitochondrial dynamics and autophagy. Int J Biochem Cell Biol. 41, 1914-1927 (2009).
- Pickles, S., Destroismaisons, L., Peyrard, S. L., Cadot, S., Rouleau, G. A., Brown, R. H. Jr, Julien, J. P., Arbour, N., Vande Velde, C. Mitochondrial damage revealed by immunoselection for ALS-linked misfolded SOD1. Hum Mol Genet. 22, 3947-3959 (2013).
- Frank, S., Gaume, B., Bergmann-Leitner, E. S., Leitner, W. W., Robert, E. G., Catez, F., Smith, C. L., Youle, R. J. The role of dynamin-related protein 1, a mediator of mitochondrial fission, in apoptosis. Dev Cell. 1, 515-525 (2001).
- West, A. P., Brodsky, I. E., Rahner, C., Woo, D. K., Erdjument-Bromage, H., Tempst, P., Walsh, M. C., Choi, Y., Shadel, G. S., Ghosh, S. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472, 476-480 (2011).
- Abad, M. F., Di Benedetto, G., Magalhães, P. J., Filippin, L., Pozzan, T. Mitochondrial pH monitored by a new engineered green fluorescent protein mutant. J Biol Chem. 279, 11521-11529 (2004).
- Murphy, A. N., Bredesen, D., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria. Proc Natl Acad Sci U S A. 93, 9893-9898 (1996).
- Tantama, M., Martinez-François, J. R., Mongeon, R., Yellen, G. Imaging energy status in live cells with a fluorescent biosensor of the intracellular ATP-to-ADP ratio. Nat Commun. 4, 2550 (2013).
