Abstract
식균 작용은 선천성 면역 세포를 죽이거나 무력화 섭취 자료를, 또는 항원으로 제시하고 적응 면역 반응을 시작하기 위해 박테리아, 세포 사멸 세포 또는 다른 이물질을 삼켜 통해 기본적인 과정이다. phagosomes의 pH는 endomembranes 및 단백질 분해 효소, 식세포 공포가 degradative 세포 기관으로 성숙 할 수 있도록 이벤트의 활성화와 분열 또는 융합을 조절하는 중요한 매개 변수입니다. 또한, H +의 전위의 다른 숙주 조직으로 효율적으로 사멸에 필수적인 시그널링되어 반응성 산소 종 (ROS), 높은 수준의 생산을 위해 필요하다. 많은 세포 내 병원균, phagosomal 산성화를 제한 phagosome 생물학에서의 pH의 중요성을 강조 식세포 살해를 파괴. 여기에 우리가 형광 이소 티오 시아 네이트 (FITC)를 사용하여 호중구에 phagosomal의 산도를 측정하는 비율 계량 방법을 설명은 식세포의 TARG으로 모산를 - 표지ETS, 라이브 셀 이미징. 분석은 490 nm에서 여기 때 단일 염료, 오히려 절대 형광보다, pH에 의존하는 비율의 정량화를 허용, 440 nm에서 흥분하지 않을 경우 산성 pH에 의해 급냉 FITC의 형광 특성을 기반으로합니다. 현장 염료 교정 및 실제 pH 값에 대한 비율의 변환에 수행하기위한 세부적인 프로토콜도 제공됩니다. 그들은 같은 표백 등의 교란에 덜 민감로 단일 염료 비율 계량 방법은 일반적으로 단일 파장 또는 이중 염료 의사 비율 계량 프로토콜 우수 고려, 측정 된 신호를 왜곡 변화, 레이저 변화, 고르지 라벨, 초점을 맞 춥니 다. 이 방법은 용이하게 다른 포식 세포 유형에서의 pH를 측정하기 위해 수정 될 수 있으며, 자이 모산 불활성 비드에서 살아있는 미생물, 기타 아민 - 함유 입자에 의해 대체 될 수있다. 마지막으로,이 방법은 다양한 범위의 pH 또는 다른 phagosom 민감한 다른 형광 물질을 사용하도록 구성 될 수있다알 활동, 그것은 phagosomes의 기능 이미징을위한 일반화 된 프로토콜 만들기.
Protocol
윤리 선언문 : 모든 동물의 조작이 제네바 대학의 동물 연구위원회의 지침을 엄격히 준수 하였다.
식세포 대상 1. 준비
- 10 ml의 멸균 인산 완충 식염수 (PBS)에 건조 모산 20 mg을 추가합니다. 10 분간 끓는 수욕에서 와류 및 열. 5 분 2,000 XG에 시원하고 원심 분리기.
- 물 목욕 초음파기에서 10 분 동안 상층 액 1 ml의 PBS에 재현 탁하고 초음파 처리를 제거합니다. 두 개의 1.5 ml의 튜브에 500 μl를 전송합니다. 5 분 동안 11,000 XG에 원심 분리기.
- 500 μL PBS로 세척을 반복합니다. 자이 모산 비등 냉동 -20 ℃에서 보관, 분주 될 수있다.
- 갓 CO 3 0.1 M 나 2를 준비 500 μL, pH가 9.3로 위 (단계 1.2)에 두 번 모산을 씻으십시오.
- 최종 세척 후 490 μL에 재현 탁. 10 mg을 10 μl를 추가 / FITC 디메틸 sulfoxid에 용해 ㎖로E (DMSO), 소용돌이, 호일로 커버하고, 실온에서 4 시간 동안 교반 품어.
- 처음으로 0.5 ml의 DMSO + 300 μL PBS, 0.5 ml의 DMSO + 450 μL PBS, 다음 PBS 혼자 다음 + 150 μL PBS 0.5 ml의 DMSO와, 상기와 같이 (단계 1.2) 세척, 언 바운드 염료를 제거하십시오.
- 혈구를 사용하여 모산를 계산합니다. 500 μL PBS, 소용돌이에 모산의 1 μl를 추가, 다음은 중앙 그리드 위에 배치 커버 슬립을 충족 혈구 챔버의 가장자리에 10 μl를 추가합니다. 20X 목표를 장착 밝은 필드 현미경의 혈구를 탑재합니다.
- 16 사각형을 포함하는 왼쪽 상단에 초점 손 집계 카운터를 사용하여이 지역의 모든 모산 입자를 계산합니다. 오른쪽 하단에 반복합니다. = 모산 농도 / 2 × 500 × 104 모산 / ㎖ 카운트 : 다음의 방정식을 사용하여 농도를 산출 모산. 표지 모산 냉동 -20 ℃에서 보관, 분주 될 수있다.
- 레이블 모산 위스콘신 Opsonize(100) 희석 : 1 토끼 항 모산 항체 토륨. 소용돌이와는 37 ° C의 물을 욕조에서 1 시간 동안 배양한다. (단계 1.2) 위와 같이 500 μL PBS로 세척 할 것.
참고 : 모산 나중에 분석을 더 어렵게 만들 수 있습니다 덩어리를 형성하는 경향이 초음파 처리는 매우, 특히 옵 소닌 후, 권장합니다. 65 % V / V 쥐 또는 인간 혈청과 옵 소닌은 대안으로 사용될 수있다. - 단계 1.7에서 1.8 사이에서 설명한대로 혈구 계를 사용 모산을 계산하고, 100 × 106 입자 / ㎖로 희석한다. 이러한 보완 또는 전혀 옵 소닌과 같은 다른 식세포 자극과 옵 소닌은 선택적으로 수행 될 수있다.
2. 라이브 비디오 현미경
- 다른 곳에서 38 세부 사항에 설명 된대로 기본 마우스 호중구를 분리합니다.
- 또한, 모든 탐식 세포 유형을 사용합니다. 로스웰 파크 메모리얼 연구소 (RPMI) 5 % 소 태아 혈청 (V / V), 200 U 페니실린 / streptomyci 보충 1640 배지에서 얼음에 호중구 유지N, 10 × 106 세포 / ml의 농도로 사용 전까지. 다른 세포 유형 1-4 일전 접종 할 수있다.
- , 35mm 유리 - 바닥 접시의 중앙에 호중구의 2 × 105 (20 μL)를 첨가 배지의 50 μl를 첨가하여 강하를 확산 및 세포가 부착 할 수 있도록 5 분 동안 37 ℃에서 배양한다.
- 행크의 균형 잡힌 염 용액 (HBSS) 1 ㎖가 특정 MPO 억제제 4- 아미노 히드라 지드 (4- ABH, 10 μM)을 함유하는 37 ℃로 가온 추가. 나트륨 아 지드 (5 mM)을 불특정 MPO 억제제도 이용 될 수 있지만, 최근의 pH 39에서 추가 비특이적 효과를 발휘하기 위해 제안되어왔다.
- 37 ° C 난방 시스템과 40X 오일 목적으로 장착 된 위드 형광 현미경에 접시를 탑재합니다. 세포 및 장비 평형화 있도록 10 분 동안 촬상 않고 세포를 배양한다.
- 명 시야 투과 이미지를 획득 현미경 설정 조정 [PHA자체 또는 440 nm의 또는 490 nm의 여기 및 535 nm의 방출 매 30 초와 가능한 경우 미분 간섭 대비 (DIC)].
- 너무 광표백 및 광독성 및 실험 질문에 따라 요구되는 것은 피하기 위해 현미경 시스템에있어서의 노출 시간 및 주파수 획득을 조정한다. 이미지 수집을 시작합니다.
- 2 분 후, 10 × 106 (50 μL)를 FITC-모산 접시의 중앙에 추가 옵 소닌. 사용 식세포와 대상의 종류에 따라 세포의 비율 : 대상을 조정합니다.
- 30 분 동안 이미지를 계속합니다. 30 분 후 시간 경과 수집을 중지하고 타이머를 시작합니다. 무대를 이동하고 모든 5 분 이내에, 이미지 다른 phagosomes에보기의 다른 분야에서 10 개 이상의 스냅 샷을 캡처합니다.
3. 교정 및 제어 실험
- 실험 일에 (레시피는 표 1에 기재되어있다) 이전에 pH 보정 용액을 제조하고 10 ㎖ 분취 량으로 동결.수조에서 37 ℃로 교정 솔루션과 따뜻하게 녹여. pH 미터와 pH를 확인하고 솔루션의 실제 산도를 기록합니다.
- 이전 이미지 수집에 유리 바닥 접시에 연동 펌프를 장착하고 (제 2) 상기와 같이 라이브 비디오 현미경을 수행합니다.
- 30 분 획득주기의 끝에서, 접시 내의 용액을 제거에 펌프를 켜고 제 교정 액 1ml를 추가 펌프를 멈춘다.
- 신호가 보통 5 분 안정 될 때까지 기다립니다. 각각의 보정 용액으로 반복합니다.
- 실험 하루에 적어도 하나의 보정을 수행하고, 높은 pH를 시작하여 순차적으로 낮은 작동뿐만 아니라 낮은 산도에서 시작하여 가장 높은쪽으로 순차적으로 보정 작업.
- 대조군으로서, 유리 접시 바닥에 900 ㎕의 세포 HBSS HBSS로 희석 된 100 μM NADPH 산화 효소 억제제, 디 페닐 요오드 propionium 100 ㎕ (DPI)를 추가하고,10 분 동안 품어.
- 인수를 시작하고 (단계 2.7) 위와 같이 모산를 추가합니다. 식세포의 15 분 후, HBSS로 희석 (콘카) concanamycin 10 μM V-ATPase의 억제제의 10 μL를 추가하고 추가로 15 분 동안 영상을 계속한다.
4. 분석
- 시간 경과 영화와 phagosome 스냅 샷의 분석.
참고 : 다음 지침은 ImageJ에 대한 특정이다. 단계별 설명은 사용되는 소프트웨어 따라 광범위하게 변할 수 있지만,이 섹션에 설명 된 기능은 가장 전문 이미지 분석 소프트웨어로 제공된다.- 전문 이미지 분석 소프트웨어 이미지를 연다. 어떤 세포가없는 지역에 사각형 다각형 선택 도구를 사용하여 작은 사각형 투자 수익 (ROI)을 그리기 및 투자 수익 (ROI)에서 플러그인> BG의 뺄셈을 클릭하여 490 채널의 배경을 뺍니다. 그런 다음>을 클릭 편집> 선택하여 440 채널에서 동일한 투자 수익 (ROI)을 업로드 선택과 반복을 복원합니다.
- 다음 작업 드롭 다운 메뉴에서 '분할'을 선택, ... 프로세스> 이미지 계산기를 클릭 image1에와 이미지 2 드롭 다운 메뉴에서 해당 이미지를 선택하여 440 채널로 나눈 490 채널의 32 비트 비율의 이미지를 만들 및 32 비트 (플로트) 결과의 체크 박스를 체크.
- > 레인보우 RGB를 이미지> 조회 테이블을 클릭하여 비 호환 색상 코딩 색상 코딩 룩업 테이블을 변경합니다. 임계 값 비율 이미지> 임계 값> 이미지를 클릭하여 0과 무한대 픽셀을 제거 조정하는 .... NaN의 확인란 설정 배경 픽셀이 선택되어 있는지 확인하고, 그 모산은 빨간색으로 표시되도록 스크롤 막대를 조정하고 적용을 클릭합니다.
- 이미지를 클릭하여 멀티 채널 합성으로 시야의 채널이 비 스택 수확기> 컬러> 채널 병합하고 회색 채널 드롭 다운 메뉴의 명 시야 화상과 녹색 채널 드롭 다운 메뉴의 비 화상을 선택하고, 선택체크 상자를 원본 이미지를 유지합니다. 시간 경과 영화 또는 phagosomes 분석 할 수있는 결정하기 위해 스냅 샷을 검색합니다. 밝은 필드 채널이 유용합니다.
- 추가> phagosomes 주위에 타원형 다각형 선택 도구를 사용하여 관심 영역 (ROI)을 그리기 및 분석> 도구> 투자 수익 (ROI) 관리자를 클릭하여 투자 수익 (ROI) 관리자에 추가합니다. 더> 다중 측정 및 슬라이스 체크 상자 당 하나의 행을 선택 해제를 클릭하여 자신의 모산 강도 비를 측정한다.
- 저속 영화, 트랙은 각 시점을 측정하는 M + Ctrl 키를 입력 ROI 드로잉하고 시간의 강도 값을 추적 할 때 필요한 ROI를 이동하여 한 번에 하나씩 phagosomes. 스프레드 시트 소프트웨어에 결과 창에서 측정 값을 복사합니다.
참고 : 독립적 인 실험 15 (실험 × 3 당 5 시간 코스)의 분석은 이상하지만, 더 많거나 적게 관찰 된 변화에 따라 요구 될 수있다. ROI를 저장하는 것은 항상 좋습니다. 일부 소프트웨어 패키지는 허용 영상 정합stration와 로아의 동적 업데이트, 분석의이 부분을 촉진.
- 형광의 pH 값으로 변환
- 4.1 절에 설명 된대로 교정 시간 경과 영화 phagosomes에 대한 440분의 490의 비율을 측정합니다.
- 스프레드 시트에서, 시간의 경과 비율 값을 플롯하고, 각 pH 보정에 대응하는 시간 기간의 중간에서 5 시간 지점에서 (5-20 사이, 보통) 시야 내의 모든 phagosomes에서 평균 비율 값을 계산 해결책. (또한 그림 5A에서 빨간색 상자를 참조하십시오.)
- 실제 측정의 pH에 대한 이들의 평균 440분의 490 비율의 값을 플롯. 하나의 그래프에 적어도 3 개의 독립적 인 교정을 결합합니다. 일반적으로 S 자형 방정식, 비선형 회귀 (최적 곡선)을 할 수있는 통계 나 수치 소프트웨어 패키지를 사용합니다.
참고 : 예를 들어,도 5b에 사용되는 방정식은 볼츠만 S 자형이었다 [Y = 아래 + ((상위 - 하위)/ (1 + EXP ((V50-X) / 기울기)) Y 값 440분의 490 비율이다], X는 pH 값과 상단, 하단은, V50 및 경사 매개 변수가 소프트웨어에 의해 계산되는가이다. - pH로 비율 값을 변환 얻어진 방정식을 사용합니다.
참고 : 예를 들어,도 5b에 아 지드 화 나트륨의 존재하에 검량선 얻은 식이다 440분의 490 비 = 1.103 + [(2.89에서 1.103 사이) / (1 + EXP ((6.993-산도) /0.9291)] . 산도에 대한 해결하면 다음과 같은 식을 제공합니다 : 산도 = 6.993-0.9291 * [LN ((1.178 / (비 - 1.103)) - 1))].
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Representative Results
다음 실험에 대한 대표적인 결과 어디에 야생형 또는 골수에서 분리 한 기본 마우스 호중구의 phagosomal 산도 Hvcn1 - / - 마우스를 비교 하였다. 성공적인 실험을 위해, 그것은 나중에 이미지 분석 동안 세그먼트에 더 어려울 것이다 너무 많은 phagosomes을 회피하면서, 저속 동영상의 전체 지속 기간 동안 시야 내에 충분히 phagosomes를 획득하는 것이 중요하다. 1은 도표 좋고 나쁜 confluencies의 예. 시간에 따른 스냅 샷 분석을 위해, 외부 모산 입자는 phagosomes 구별 및 분석에서 제외해야합니다. 2 명 시야 이미지 phagosomes에서 외부 모산 입자를 구별 할 수 있도록하는 것이 유용 할 수있는 방법을 보여줍니다. 그림 3은 전형적인 phagosome의 예를 보여줍니다 Hvcn1에 비해 야생형에서 산도 시간 코스 - / - 중요하다.도 4는 산성화 반전 V-ATPase의 억제제 콘카, 첨가하여 산성화 신속한 결과 NADPH 산화 효소 억제제 DPI를, 첨가 효과를 나타낸다. 이러한 실험은 pH 민감성 프로브들이 정상적으로 phagosomes 내에서 작업하는 것을 증명하는 것이 중요 할 수있다. 전형적인 교정 시간 코스는 검량선을 구성하는 데 사용 비율 값의 범위를 나타내는 직사각형으로,도 5에 표시된다. 부가 적 사실을 강조 FITC의 intraphagosomal 산도 응답에 영향을 미칠 수 MPO 활성 통해 염소화 염색 방법을 보여준다도 5 프로브는 phagoso 내 예상보다 다르게 반응 할 수 있음 말 환경과 현장 교정의 중요성.
그림 1. 적절한 컨 플루 및 대상 : 셀 비율 왼쪽 패널은 세포 생장이 너무 희박한 및 대상 예를 보여준다. 세포 비가 식세포 이벤트가 시야에서 발생할 확률을 감소 너무 낮다. 중간 패널은 세포 생장이 지나치게 높고, 셀 혼잡 예를 나타낸다. 이러한 조건에서 세포가 이동하고 자신의 목표를 찾거나 더 어려운 나중에 서로 결정 분석을 통해 크롤링 할 수있는 충분한 공간이되지 않을 수 있습니다. 많은 세포와 대상이 보였다 수 있으며, 아직은 명확하게 각각 서로 구별 할 수 세포 비율 : 오른쪽 패널은 이상적인 세포 생장 초기 목표를 보여줍니다. FITC-모산은 녹색으로 표시되고, 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
오른쪽 패널 혼자 밝은 필드 이미지를 보여줍니다 반면에 그림 2. 구별 phagosomes 및 uningested 모산은. 왼쪽 패널은 병합 명 시야 이미지와 440분의 490 FITC-모산 비율을 보여줍니다. Phagosomes (작은 녹색 화살표)가 하나가 특성 누구의 형광 어두운 센터 (긴 빨간 화살표)와 일치하지 않는 밝은 링으로 둘러싸인 세포 (짧은 빨간 화살표) 또는,로 - 현지화 공동하지 않는 것이, 외부 입자로부터 구별 할 수 밝은 필드 이미지 (녹색 화살표)에서 phagosomes의. 스케일 바는 10 μm의를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 시간 코스, 야생형과 Hvcn1의 평균 pH와 비율 히스토그램 - / -. 호중구 phagosomes (A) phagosomal 산도의 전형적인 시간 코스는 보여줍니다 야생 형 호중구 (파란색)의 pH는 중성 (점선 반면 ) 또는, Hvcn1의 phagosomes 섭취 다음과 같은 초기 시간 포인트 중 (실선) 약 알칼리성 - / - 호중구 (빨간색) 중 하나 alkalinize (실선) 나) (점선을 산성화 할 수 있습니다. (B) 스냅 샷을 컴파일은 대상 또한 평균 인구 phagosomal의 pH를 phagosomes (야생형 많은 수의 계산 할 수 있습니다 후 30 ~ 35 분을 촬영 : N = 1천8백98분의 5 / 383 Hvcn1 - / - : N = 6 / 451분의 1,433 실험 / phagosomes / 셀, 막대는 평균 ± SEM)은 중요하지 NS 있습니다. FITC-zymosa의 (C) 히스토그램- / - 호중구 N 비율은 야생형 및 Hvcn1 phagosomal 간의 산도 차이를 보여준다. (이 그림은 허가, [19]에서 수정되었습니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 phagosomal 산도에 NADPH 산화 효소 억제제 DPI와 V-ATPase의 억제제 콘카 4. 효과. 10 μm의 DPI에서 사전 배양은 100 nm의 콘카 (화살표)을 첨가하여 역전되었다 곧 섭취 후 phagosomes의 급속한 산성화, 결과. (이 그림은 허가, [19]에서 수정되었습니다.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
도 5 pH 보정 시간 코스 FITC-모산의 교정에 MPO 억제 효과. (A) intraphagosomal FITC-모산의 전형적인 pH 보정 곡선. 빨간색 박스는 교정 곡선을 생성하는 데 사용 비율 값의 범위를 나타낸다. 사용 솔루션 및 솔루션이 변경되는 시간의 실제 pH 값은 화살표로 표시된다. 곡선은보기의 단일 필드 내에서 10 phagosomes의 평균을 나타냅니다. 비특이적 억제제 나트륨 아 지드 (5 mm의 MPO INH)와 MPO의 (B) 억제 intraphagosomal FITC-모산의 pH 의존적 반응의 동적 범위를 증가시킨다. 포인트는 평균 ± SEM (이 그림은 허가, [19]에서 수정되었습니다.)입니다 라를 보려면 여기를 클릭하십시오이 그림의 rger 버전.
| 1.1 | (배) 자료 | |||||
| 버퍼 | 스톡 | 최종 (1X) | 500 ㎖ (2 배)의 경우 | |||
| KCl을 | 1 M | 140 밀리미터 | 140 ml의 | |||
| 의 MgCl 2 | 1 M | 1 밀리미터 | 1 ml의 | |||
| EGTA | 1 M | 0.2 밀리미터 | 0.2 ml의 | |||
| 염화나트륨 | 1 M | 20 mM의 | 20 ㎖ | |||
| 1.2 | 버퍼 | 스톡 | 결정적인(1X) | 목적 | ||
| MES | 1 M | 20 mM의 | pH가 5.5-6.5에 대한 | |||
| HEPES | 1 M | 20 mM의 | pH가 7.0-7.5에 대한 | |||
| 트리스 | 1 M | 20 mM의 | pH가 5.5-6.7에 대한 | |||
| NMDG | 1 M | 20 mM의 | pH가 5.5-6.8에 대한 | |||
| 1.3 | 이오 노 포어 | 주식 (100 % EtOH로) | 최종 (1X) | |||
| Nigericin | 5 ㎎ / ㎖ | 5 μg의 / ㎖ | ||||
| 모 넨신 | 50 mM의 | 5 μm의 | ||||
| 1.4 | 50 ㎖의 경우 | |||||
| pH가 | 배 자료 | 버퍼 유형 | 버퍼 집. | Nigericin | 모 넨신 | |
| 5.0 | 25 ml의 | MES | 1 ml의 | 50 μL | 5 μL | |
| 5.5 | 25 ml의 | MES | 1 ml의 | 50 μL | 5 μL | |
| 6.0 | 25 ml의 | MES | 1 ml의 | 50 μL | 5 μL | |
| 6.5 | MES | 1 ml의 | 50 μL | 5 μL | ||
| 7.0 | 25 ml의 | HEPES | 1 ml의 | 50 μL | 5 μL | |
| 7.5 | 25 ml의 | HEPES | 1 ml의 | 50 μL | 5 μL | |
| 8.0 | 25 ml의 | 트리스 | 1 ml의 | 50 μL | 5 μL | |
| 8.5 | 25 ml의 | 트리스 | 1 ml의 | 50 μL | 5 μL | |
| 9.0 | 25 ml의 | 트리스 | 1 ml의 | 50 μL | 5 μL | |
| 9.5 | 25 ml의 | NMDG | 1 ml의 | 50 μL | 5 μL | |
| 로 pH를 조정KOH 또는 염산 | ||||||
보정 용액의 제조 표 1 레시피. 보정 용액에 사용 이오 노 포어의 제조 배 염기 용액 500㎖의 제조 1.1) 레시피. 1.2) 보정 용액의 pH에 따라 사용 된 다른 완충액의 제조 레시피. 1.3) 레시피. 1.4) 50의 제조 레시피 1.1-1.3에 기재된 염기, 완충제 및 이오 노 포어를 사용하여 각 캘리브레이션 ml의 용액.
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Discussion
더 많은 시간이 목표물에 커플 링하여 pH 민감성 염료의 사용과 유사한 방법을 적용하지만 phagosomes의 모집단의 평균 pH는 예컨대 분광 측정과 같은 다른 방법 FACS,보다 많이 소요되었지만, 현미경은 몇 가지 장점을 제공한다. 우선 내부와 외부가 내면화 구속,하지만 것입니다, 입자는 쉽게 각각 소멸 또는 외부 입자에 라벨을, 같은 트리 판 블루 또는 항체와 같은 다른 화학 물질을 추가 할 필요없이 구별 할 수 있습니다. 둘째 실시간으로 세포를 수행하면 연구자가 동시가 인구 기반 방법으로 간과 될 수있는 반면 너무 마이그레이션, 감지 및 결합 입자에 미치는 영향은 쉽게, 여기에 식별 할 수있는 식세포 과정의 여러 측면을 관찰 할 수 있다는 것입니다. 또한, 식균 작용의 개시의 동기화, 자주, 더 인해 차가운 충격 40, 41로 다른 인신 매매 이벤트를 교란 할 수 4 ° C에서 배치 세포에 의해 수행되지시간 제로 필요한 t을 직접 식별 할 수 있습니다. 라이브 현미경을 수행 할 때 실제로,이 4 ° C 동기화 기법과 대물 침지 오일과 혼합 수의 온도 변화 동안 접시의 바닥 상에 형성되는 축합 식세포 작용의 개시에 가까운 시간주기를 포착하면 권장되지 온난화 요리와 현미경 구성 요소 사이의 온도 차이는 초점 변화를 일으킬 수 있습니다. 세 번째 장점은 phagosomes 같이, 등 여러 파라미터에 본질적으로 균질하지만 pH를 42로 한정되지 및 phagosome 산도에 특정 효과 phagosomal 산도보다는 평균 인구 분포 변화, 더 미묘한 될 수도 있다는 사실에 기인 그림 3에 나타내었다. 이러한 관찰은 phagosomal 산도의 조절에 깊은 기계적인 통찰력을 제공 할 수 있습니다.
이 때문에 본 연구에서, FITC는 선택의 pH 민감성 염료로 선정 하였다저렴하고 널리 사용하고, 중요한 동적 범위는 이전의 연구 (29, 30)에 따르면, 약 알칼리성을 중성의 원래 예상 pH 범위를 일치 자유 양식 (37), 9로 pH를 3 포괄와 6.5의 pKa를 갖는다. 보다 최근에는 7.5 이상의 기본 pKa가 모두 야생형과 Hvcn1 1-2의 pH 단위 알칼리성 의외로 예상 범위의 pH 값을 갖는다 SNARF 불리는 다른 산도 프로브 이용하는 연구 - / - 호중구 phagosomes 39. 따라서, pH 감지기의 선택은 응용 분야에 따라 고려해야하는 중요한 매개 변수이다. 원칙적으로, 여기에서 제시된 방법은 쉽게 7'- 비스 SNARF 및 2 ', 다른 pH 민감성 염료를 사용하는 것이 적합 할 수있다 (2- 카복시 에틸) -5- (및 -6) -carboxyfluorescein (BCECF) 그 숙신 이미 딜 에스테르 유도체는 쉽게 모산 등의 입자를 함유하는 아민 결합된다. 실제로, 센서 ratiomet 같이, 형광 염료에 한정 될 필요는 없다RIC의 pH 민감성 단백질 등 SypHer 43, 형질 도입 및 미생물에 의해 표현 될 수있다. 몇몇 비 비율 적 대안 또한, 녹색 형광 단백질 (GFP)과 함께 사용될 수있다 pHrodo 염료, 특히 적색의 버전이 존재하는 단백질 또는 pH 민감성 단백질을 pHluorin -tagged. 그러나, 가혹한 intraphagosomal 환경 내부 목표 염료 및 단백질에 미칠 수있는 잠재적으로 큰 영향이 프로브는 의사 비율을 유도에 사용되는 pH를 구분하지 프로브와 함께 최소한이어야한다. 도 5에 예시 된 바와 같이, 교정 실험은 감소되거나 왜곡 된 다이나믹 레인지와 같은 색소 손상의 효과를 노출 할 수있다. 실용적인 메모에서, 교정 실험은 항상 완벽하지 모든 실험 후 수행 할 실행할 수 없게 될 수있다. 결과적으로, 비율 값은 가끔씩 보정 범위 밖으로 떨어질 pH로 변환시 불가능한 값을 산출 할 수있다. 그것은 appropr 할 수있다하나에 늦었 최대 및 최소 교정 pH 값, 또는 비율과 추정의 pH 등의 모든 값을 표현하는 범위를 "에 또는 동등 이상 / 미만 -"평균 비율가 나타내는 이러한 오프 스케일 값을 표현한다.
DPI에 의해 강조하고 콘카가 컨트롤로, 활성 산소의 생산 및 V-ATPase의 활동 phagosomal 산도를 결정하는 주요 요인이다. 실제로 많은 상황에서, ROS 생산의 수준의 변화, 특히 호중구에, phagosomal 산도의 차이를 기초 수 있으며, phagosomal ROS 생산의 측정 및 pH는 자주 손에 손을 이동합니다. 주의의 한 마디는 모두 약물들이 있지만 세포 내에서의 위치를 억제하는 효소의 활동에 대한 통찰력을 빌려 것입니다. 두 효소는 누구의 개별 구성 요소 phagosomes 4, phagosomes에 활동의 부족에 트래픽이 매매 또는 어셈블리 결함보다는 직접적인 영향으로 인해 발생할 수 있어야합니다 멀티 서브 유닛 복합체이다.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
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