Abstract
La fagocitosis es un proceso fundamental a través del cual las células inmunitarias innatas engullen las bacterias, células apoptóticas u otras partículas extrañas con el fin de matar o neutralizar el material ingerido, o presentarlo como antígenos e iniciar la respuesta inmune adaptativa. El pH de los fagosomas es un parámetro crítico regulación de fisión o fusión con endomembranes y la activación de las enzimas proteolíticas, eventos que permiten la vacuola fagocítica a madurar en un orgánulo degradativa. Además, se requiere la translocación de H + para la producción de altos niveles de especies reactivas de oxígeno (ROS), que son esenciales para la matanza eficiente y señalización a otros tejidos del huésped. Muchos patógenos intracelulares subvierten asesinato fagocitosis mediante la limitación de la acidificación phagosomal, destacando la importancia del pH en la biología fagosoma. Aquí se describe un método radiométrico para la medición de pH phagosomal en los neutrófilos utilizando isotiocianato de fluoresceína (FITC) marcado con zymosan como targ fagocíticaets y imágenes de células vivas. El ensayo se basa en las propiedades de fluorescencia de FITC, que se inactivó mediante pH ácido cuando se excita a 490 nm pero no cuando se excita a 440 nm, lo que permite la cuantificación de una relación dependiente del pH, en vez de la fluorescencia absoluta, de un solo colorante. También se proporciona un protocolo detallado para llevar a cabo en la calibración de tinte situ y la conversión de la relación de a valores de pH real. Métodos radiométricos de un solo tinte se consideran en general superior a la longitud de onda única o protocolos pseudo-radiométrica de doble tinte, ya que son menos sensibles a las perturbaciones tales como blanqueo, se centran cambios, variaciones láser y etiquetado irregular, que distorsionan la señal medida. Este método se puede modificar fácilmente para medir el pH en otros tipos de células fagocíticas, y zymosan puede ser reemplazado por cualquier otra partícula que contiene amina, a partir de perlas inertes a los microorganismos vivos. Por último, este método puede ser adaptado para hacer uso de otras sondas fluorescentes sensibles a diferentes intervalos de pH o de otros phagosomactividades al, por lo que es un protocolo generalizado para la proyección de imagen funcional de fagosomas.
Protocol
Declaración de Ética: Todas las manipulaciones animales se realizaron en estricta conformidad con las directrices del Comité de Investigación Animal de la Universidad de Ginebra.
1. Preparación de Metas fagocíticas
- Añadir 20 mg de zymosan se secó a 10 ml de solución salina tamponada con fosfato estéril (PBS). Vortex y el calor en un baño de agua hirviendo durante 10 minutos. Enfriar y centrifugar a 2000 xg durante 5 min.
- Eliminar el sobrenadante, resuspender en 1 ml de PBS y se somete a ultrasonidos durante 10 minutos en un sonicador de baño de agua. Transferir 500 l a dos tubos de 1,5 ml. Centrifugar a 11.000 xg durante 5 min.
- Repita el lavado con 500 l de PBS. El zymosan hervida puede ser en alícuotas, congelados y almacenados a -20 ° C.
- Lave zimosán dos veces en 500 l recién preparados 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3 que el anterior (paso 1.2).
- Resuspender en 490 l después del lavado final. Añadir 10 l de 10 mg / ml de FITC disuelto en dimetil sulfoxide (DMSO), vórtice, cubrir con papel de aluminio, y se incuba con agitación durante 4 horas a temperatura ambiente.
- Para quitar colorante no fijado, lávese que el anterior (paso 1.2), primero con 0,5 ml de DMSO + 150 l de PBS, y luego 0,5 ml de DMSO + 300 l de PBS, y luego 0,5 ml de DMSO + 450 l de PBS, a continuación PBS solo.
- Cuente zimosán utilizando un hemocitómetro. Añadir 1 l de zymosan a 500 l de PBS, vórtice, a continuación, añadir 10 l hasta el borde de la cámara de hemocitómetro, donde se encuentra con el cubreobjetos se coloca sobre la rejilla central. Montar el hemocitómetro en un microscopio de campo brillante equipado con un objetivo 20X.
- Centrarse en la esquina superior izquierda contiene 16 cuadrados y contar todas las partículas zymosan en esta área utilizando un contador de recuento mano. Repita con la esquina inferior derecha. Calcular la concentración zymosan usando la siguiente ecuación: concentración Zymosan = Cantidad / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml. Zimosán marcado puede ser en alícuotas, congelados y almacenados a -20 ° C.
- Opsonizar el wi zimosán etiquetadoth un conejo anticuerpo anti-zymosan en 1: 100 dilución. Vortex e incubar durante 1 hora en un 37 ° C baño de agua. Lavar con 500 l de PBS que el anterior (paso 1.2).
Nota: La sonicación es muy recomendable, sobre todo después de la opsonización, como zimosán tiende a formar montones que pueden hacer análisis más difíciles más adelante. Opsonización con 65% v / v de rata o de suero humano se puede utilizar como una alternativa. - Contar zymosan usando un hemocitómetro como se describe en los pasos 1,7-1,8, y se diluye hasta 100 x 10 6 partículas / ml. Opsonización con otros estimuladores fagocíticas, como complemento o no la opsonización, se puede realizar alternativamente.
2. Live Video Microscopía
- Aislar neutrófilos primarios de ratón como se describe en detalle en otra parte 38.
- También puede utilizar cualquier tipo de célula fagocítica. Mantener los neutrófilos en hielo en Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado con 5% de suero bovino fetal (v / v), 200 U de penicilina / streptomycin, a una concentración de 10 x 10 6 células / ml hasta que esté listo para su uso. Otros tipos de células se pueden sembrar 1-4 días antes.
- Añadir 2 x 10 5 (20 l) de los neutrófilos hacia el centro de un plato de fondo de vidrio 35 mm, se extendió la caída mediante la adición de 50 l de medio y se incuba a 37 ° C durante 5 min para permitir que las células se adhieran.
- Añadir 1 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBSS) se calentaron a 37 ° C que contiene la específica MPO hidrazida inhibidor 4-aminobenzoico (4-ABH, 10 M). Los inhibidores no específicos de la MPO, como azida de sodio (5 mM), también se pueden utilizar, pero se han sugerido recientemente para ejercer efectos no específicos adicionales en pH 39.
- Montar el plato en un microscopio de fluorescencia de campo amplio equipado con un sistema de calefacción C 37 ° y un objetivo de aceite de 40X. Se incuban las células sin formación de imágenes durante 10 min para permitir que las células y los equipos se equilibren.
- Ajuste la configuración de microscopio para adquirir una imagen de transmisión de campo brillante [phase o contraste de interferencia diferencial (DIC), si está disponible] con 440 nm o 490 nm de excitación y 535 nm de emisión cada 30 segundos.
- Ajuste el tiempo de exposición y la frecuencia de adquisición de acuerdo con el sistema de microscopio para evitar el exceso de fotoblanqueo y fototoxicidad y en función de las preguntas experimentales se preguntó. Comience la adquisición de imágenes.
- Después de 2 min, añadir 10 x 10 6 (50 l) opsonizado-FITC zymosan al centro del plato. Ajuste de destino: proporciones de células dependiendo del tipo de fagocito y de destino utilizado.
- Continuar de imágenes para 30 min. Después de 30 minutos detener la adquisición de lapso de tiempo y comenzar un temporizador. Mueva el escenario y capturar 10 o más instantáneas en diferentes campos de visión de imagen otros fagosomas, todo dentro de 5 min.
3. Los experimentos de calibración y control
- Preparar las soluciones de calibración pH (recetas se describen en la Tabla 1) antes del día del experimento y congelar en alícuotas de 10 ml.Descongele las soluciones de calibración y caliente a 37 ° C en un baño de agua. Comprobar el pH con un medidor de pH y registrar el pH real de las soluciones.
- Montar una bomba peristáltica en la parte inferior plato de cristal antes de la adquisición de la imagen y realizar microscopía de vídeo en directo como se describe anteriormente (sección 2).
- Al final del período de adquisición de 30 min encienda la bomba para eliminar la solución dentro del plato, añadir 1 ml de la primera solución de calibración y detener la bomba.
- Espere hasta que la señal se estabiliza, por lo general 5 min. Repita el procedimiento con cada solución de calibración.
- Realizar al menos una calibración por día experimental, y calibrar comenzando con el más alto pH y secuencial de trabajo a la más baja, así como a partir de la pH más bajo y trabajando de forma secuencial hacia el más alto.
- Como control, añadir 100 l de 100 mM de yoduro de propionium difenil inhibidor de la NADPH oxidasa (DPI) diluido en HBSS a las células en 900 l de HBSS en el plato de fondo de vidrio, yincubar durante 10 min.
- Comience adquisición y añadir zimosán que el anterior (paso 2.7). Después de 15 min de la fagocitosis, añadir 10 l de 10 mM inhibidor de la V-ATPasa concanamycin A (ConcA) diluido en HBSS y continuar de imágenes para un adicional de 15 min.
4. Análisis
- Análisis de películas a intervalos y las instantáneas fagosoma.
Nota: Las siguientes instrucciones son específicas para ImageJ. Paso a paso las instrucciones pueden variar ampliamente dependiendo del software utilizado, pero las funciones descritas en esta sección están disponibles en la mayoría de software de análisis de imagen profesional.- Abra las imágenes con software de análisis de imagen profesional. Reste el fondo en el canal 490 dibujando una pequeña ROI cuadrado con la herramienta de selección poligonal cuadrados en una zona donde no hay células, y haciendo clic en Plugins> BG Sustracción de retorno de la inversión. Luego cargue el mismo ROI en el canal 440 haciendo clic en Editar> Cambios> Restaurar selección y repetir.
- Hacer una imagen de relación de 32 bits del canal de 490 dividido por el canal 440 haciendo clic en Proceso> Calculadora Imagen ..., la selección de las imágenes apropiadas en los menús desplegables Image1 y Image2, luego seleccionando "brecha" en el menú desplegable de la Operación y comprobar el resultado casilla 32-bit (float).
- Cambie la tabla de consulta de códigos de colores para un código de colores compatibles con relación haciendo clic en Imagen> tablas de búsqueda> Rainbow RGB. Umbral de la imagen relación de eliminar 0 e infinito píxeles haciendo clic en Imagen> Ajustar> Umbral .... Ajuste las barras de desplazamiento para que zimosán aparece en rojo y haga clic en Aplicar, asegurándose de que los valores de ajuste píxeles de fondo casilla NaN a se selecciona.
- Combine esta relación pila con el canal de campo brillante en un compuesto de varios canales haciendo clic en Imagen> Color> Combinar Canales, y la selección de la imagen de campo brillante en el menú desplegable canal gris y la imagen de relación en el menú desplegable canal verde, y la selección de laMantenga imágenes fuente casilla de verificación. Analiza las películas a intervalos o instantáneas para determinar qué fagosomas se van a analizar. El canal de campo brillante es útil para esto.
- Dibuje las regiones de interés (ROI) mediante la herramienta de selección poligonal óvalo alrededor fagosomas, y añadirlos a la gerente ROI haciendo clic en Análisis> Herramientas> Administrador ROI> Agregar. Mida su relación de intensidad zimosán haciendo clic en Más> Multi-Medida y de-seleccionar la una fila por cada rebanada de casilla.
- Para las películas de lapso de tiempo, los fagosomas pista uno a la vez mediante la elaboración de un retorno de la inversión, tecleando Ctrl + M para medir cada punto de tiempo, y moviendo el retorno de la inversión cuando sea necesario para realizar un seguimiento de los valores de intensidad con el tiempo. Copie las mediciones de la ventana Resultados en una hoja de cálculo.
Nota: El análisis de los 15 (5 cursos de tiempo por experimento x 3) experimentos independientes es ideal, pero más o menos puede ser necesaria en función de la variabilidad observada. Salvando las regiones de interés es siempre recomendable. Algunos paquetes de software permiten regi imagentración y actualización dinámica de rendimiento de la inversión, facilitando de esta parte del análisis.
- La conversión de fluorescencia para valores de pH
- Medir la relación 490/440 para fagosomas en las películas a intervalos de calibración como se describe en la sección 4.1.
- En una hoja de cálculo, trazar los valores de la relación con el tiempo, y calcular los valores medios de relación de todos los fagosomas dentro del campo de visión (por lo general, entre 5-20) a partir de 5 puntos de tiempo dentro de la mitad del período de tiempo correspondiente a cada calibración pH solución. (Véanse también las cajas de color rojo en la figura 5A.)
- Trazar estos medios 490/440 valores de la relación contra el pH medido real. Combine por lo menos 3 calibraciones independientes en un solo gráfico. Use un paquete de software estadístico o numérica para realizar una regresión no lineal (curva de mejor ajuste), por lo general a una ecuación sigmoidal.
Nota: Por ejemplo, en la Figura 5B la ecuación utilizada fue una sigmoidal Boltzmann [Y = Bottom + ((Top-Bottom)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], donde los valores de Y son los 490/440 ratios, X son los valores de pH y la parte superior, inferior parámetros V50 y pendiente son calculados por el software. - Utilice la ecuación obtenida para transformar valores de la relación de pH.
Nota: Por ejemplo, en la Figura 5B la ecuación obtenida para la curva de calibración en presencia de azida de sodio es 490/440 = 1,103 + Ratio [(2,89 a 1,103) / (1 + EXP ((6.993-pH) /0.9291)] . Resolviendo para pH da la siguiente ecuación: pH = 6.993 - 0,9291 * [ln ((1,178 / (Ratio-1.103)) - 1))].
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Representative Results
Los siguientes son resultados representativos de un experimento en el que el pH phagosomal de los neutrófilos primarios de ratón aislado de la médula ósea de tipo salvaje o Hvcn1 - / - los ratones fueron comparados. Para un experimento exitoso, es importante obtener suficientes fagosomas dentro del campo de visión durante toda la duración de la película de lapso de tiempo, evitando al mismo tiempo demasiados fagosomas, que más tarde serán más difíciles de segmento durante el análisis de imágenes. Figura 1 muestra ejemplos de confluencies buenos y malos. Para los análisis en función del tiempo y de instantáneas, partículas zymosan externos deben distinguirse de los fagosomas y excluidos del análisis. La figura 2 ilustra cómo la imagen de campo brillante puede ser útil para ayudar a distinguir partículas zymosan externos de fagosomas. Figura 3 muestra ejemplos de fagosoma típica pH de tiempo cursos de tipo salvaje en comparación con Hvcn1 - / - La Figura 4 ilustra el efecto de añadir el inhibidor de NADPH oxidasa DPI, lo que resulta en una acidificación rápida, seguido por la adición del inhibidor de la ATPasa V-ConcA, que invierte la acidificación. Tales experimentos pueden ser críticos para demostrar que las sondas sensibles al pH están trabajando dentro de fagosomas como deberían. Un tiempo de curso de calibración típica se representa en la Figura 5, con rectángulos que indican el rango de valores de la relación utilizados para construir la curva de calibración. Figura 5, además, muestra cómo teñir cloración través de la actividad MPO puede influir en la intraphagosomal pH-respuesta de FITC, destacando el hecho de que las sondas pueden responder de manera diferente de lo esperado dentro de la phagoso entorno mal y la importancia de la calibración in situ.
Figura 1. apropiada confluencia y de destino: proporción de células El panel de la izquierda muestra un ejemplo donde la confluencia celular es demasiado escasa y el objetivo:. Proporción de células es demasiado bajo, disminuyendo la probabilidad de que un evento fagocítica se producirá en el campo de visión. El panel central muestra un ejemplo en la confluencia celular es demasiado alto y las células se llena de gente. En estas condiciones, las células no pueden tener suficiente espacio para moverse y encontrar sus objetivos, o puede arrastrarse unos sobre otros análisis de decisiones más difíciles más adelante. El panel derecho muestra una confluencia celular ideal y objetivo inicial: proporción de células, donde muchas células y metas pueden sido visto y aún así se distinguen claramente unos de otros. FITC zymosan se muestra en verde y la barra de escala representa 10 micras. /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "target =" _ blank "> Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2. fagosomas distintivas y zimosán uningested. El panel izquierdo muestra una imagen de campo brillante fusionada y una relación 490/440 FITC zimosán, mientras que el panel de la derecha muestra la imagen de campo brillante solo. Fagosomas (pequeñas flechas verdes) se pueden distinguir de las partículas externas, que, o bien no lo hacen co-localizar con las células (a corto flecha roja) o cuya fluorescencia no coincide con un centro oscuro (larga flecha roja), rodeada por un anillo más brillante, típico de fagosomas en la imagen de campo brillante (flechas verdes). Las barras de escala representan 10 micras. Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3. Tiempo de cursos, promedio de pH y la relación de los histogramas de tipo salvaje y Hvcn1 - / -. Fagosomas neutrófilos (A) cursos de tiempo típicos de pH phagosomal muestra que mientras que en la de tipo salvaje neutrófilos (azul) el pH es neutro (línea punteada ) o ligeramente alcalino (línea continua) en los puntos de tiempo tempranos después de la ingestión, los fagosomas de Hvcn1 - / - neutrófilos (rojo) pueden ya sea alkalinize (línea continua) o acidificar (línea punteada). (B) La compilación de instantáneas tomada 30-35 minutos después de la adición de objetivos permite a la media del pH phagosomal población que se calcula a partir de un gran número de fagosomas (de tipo salvaje: n = 5/1898/383 y Hvcn1 - / -: n = 6 / 1433/451 / experimentos fagosomas / células, barras son medias ± SEM, ns no significativo). (C) Histogramas de FITC-zymosan relaciones revelan diferencias en el pH phagosomal entre la naturaleza y tipo Hvcn1 - / - neutrófilos. (Esta cifra se ha modificado a partir de [19], con permiso.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4. Efectos de inhibidor de la NADPH oxidasa DPI y V-ATPasa inhibidor ConcA sobre el pH phagosomal. Pre-incubación en 10 mM DPI resultó en una rápida acidificación de los fagosomas poco después de la ingestión, que se invirtió mediante la adición de 100 nM ConcA (flecha). (Esta cifra se ha modificado a partir de [19], con permiso.) Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5. pH tiempo de curso de calibración y efectos de la inhibición MPO en la calibración de FITC-zymosan. (A) una curva de calibración pH típico de intraphagosomal FITC-zymosan. Rectángulos rojos indican la gama de valores de relación utilizados para construir la curva de calibración. Los valores reales de pH de las soluciones utilizadas y los tiempos en los cuales se cambian las soluciones se indican mediante flechas. La curva representa la media de 10 fagosomas dentro de un mismo campo de visión. (B) Inhibición de la MPO con la azida no específico inhibidor de sodio (5 mM, MPO Inh) aumenta el rango dinámico de las respuestas dependientes del pH FITC-zymosan intraphagosomal. Los puntos son medias ± SEM (Esta cifra se ha modificado a partir de [19], con permiso.) Haga clic aquí para ver a laVersión rger de esta figura.
| 1.1 | (2x) Base | |||||
| Los tampones | Valores | Final (1x) | Por 500 ml (2x) | |||
| KCl | 1 M | 140 mM | 140 ml | |||
| MgCl2 | 1 M | 1 mM | 1 ml | |||
| EGTA | 1 M | 0,2 mM | 0,2 ml | |||
| NaCl | 1 M | 20 mM | 20 ml | |||
| 1.2 | Los tampones | Valores | Final(1x) | Propósito | ||
| MES | 1 M | 20 mM | para pH 5.5 a 6.5 | |||
| HEPES | 1 M | 20 mM | para pH 7.0-7.5 | |||
| Tris | 1 M | 20 mM | para pH 5.5 a 6.7 | |||
| NMDG | 1 M | 20 mM | para pH 5.5 hasta 6.8 | |||
| 1.3 | Ionóforos | Stock (100% EtOH) | Final (1x) | |||
| Nigericina | 5 mg / ml | 5 mg / ml | ||||
| Monensina | 50 mM | 5 micras | ||||
| 1.4 | Durante 50 ml | |||||
| pH | 2x Base | Tipo Buffer | Buffer Vol. | Nigericina | Monensina | |
| 5.0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 l | 5 l | |
| 5.5 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 l | 5 l | |
| 6.0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 l | 5 l | |
| sesenta y cinco | MES | 1 ml | 50 l | 5 l | ||
| 7.0 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 l | 5 l | |
| 7.5 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 l | 5 l | |
| 8.0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 l | 5 l | |
| 8.5 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 l | 5 l | |
| 9.0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 l | 5 l | |
| 9.5 | 25 ml | NMDG | 1 ml | 50 l | 5 l | |
| Ajustar el pH conKOH o HCl | ||||||
Tabla 1. Receta para preparar soluciones de calibración. 1.1) Receta para preparar 500 ml de una solución de base de 2x. 1.2) Receta para la preparación de los diferentes tampones usados de acuerdo con el pH de la solución de calibración. 1.3) Receta para la preparación de los ionóforos utilizados en las soluciones de calibración. 1.4) Receta para la preparación de 50 ml de cada solución de calibración usando las bases, tampones y ionóforos descritos en 1.1 hasta 1.3.
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Discussion
Aunque más lento que los métodos alternativos, como la espectroscopia y FACS, que emplean una estrategia similar de uso de un colorante sensible al pH, junto a los objetivos, pero miden el pH promedio de una población de fagosomas, microscopía ofrece varias ventajas. En primer lugar es que interna y externa obligado, pero no interiorizada, las partículas pueden ser fácilmente distinguido sin tener que añadir otros productos químicos, tales como tripán azul o anticuerpos, para calmar o etiquetar partículas externas, respectivamente. El segundo es que, después de las células en tiempo real permite a los investigadores observar varios aspectos del proceso de fagocitosis simultánea y así los efectos sobre la migración, la detección y las partículas de unión pueden ser fácilmente discernir aquí, mientras que podría ser pasado por alto con los métodos basados en la población. Además, la sincronización de la iniciación de la fagocitosis, a menudo se realiza por las células poniendo a 4 ° C, lo que podría perturbar otros eventos de tráfico debido al choque frío 40,41, no est necesaria como tiempo cero se puede discernir directamente. En efecto, cuando se realiza la microscopía en vivo, este 4 ° técnica de sincronización C no se recomienda si la captura de periodos de tiempo cerca de la iniciación de la fagocitosis como la condensación que se forma en la parte inferior del plato durante el cambio de temperatura puede mezclar con el aceite de inmersión objetivo y diferencias de temperatura entre los componentes del plato y del microscopio de calentamiento pueden causar cambios de enfoque. Una tercera ventaja se deriva del hecho de que los fagosomas son intrínsecamente heterogénea de varios parámetros incluyendo, pero no limitados a, pH 42, y ciertos efectos sobre el pH fagosoma podrían ser más sutil, cambiando la distribución del pH phagosomal en lugar de la población media, como se se muestra en la Figura 3. Estas observaciones pueden dar ideas más profundo mecanicistas en la regulación de pH phagosomal.
En el presente estudio, FITC fue elegido como el pH colorante sensible de elección porque esde bajo costo, ampliamente disponible, y lo más importante tiene un pKa de 6,5 con un rango dinámico que abarca pH 3-9 en su forma libre 37, que coincide con el rango de pH anticipado originalmente de neutro a ligeramente alcalino, de acuerdo con estudios previos 29,30. Más recientemente, un estudio empleando una sonda de pH diferente llamado SNARF, que tiene un pKa más básicas de 7,5, valores estimados de forma inesperada de pH que varían de 1-2 unidades de pH más alcalino para ambos de tipo salvaje y Hvcn1 - / - fagosomas de neutrófilos 39. Por lo tanto, la elección del sensor de pH es un parámetro importante a considerar dependiendo de la aplicación. En principio, el método que aquí se presenta se puede adaptar fácilmente para emplear otros tintes sensibles al pH, como SNARF y 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) 5 (y 6) -carboxifluoresceína (BCECF), cuyos derivados succinimidil-éster se acoplan fácilmente a la amina que contiene partículas, tales como zymosan. De hecho, los sensores no necesitan ser limitados a colorantes fluorescentes, como ratiometproteínas sensibles al pH, ric, podría ser transducidas y expresadas por los microorganismos tal Sypher 43. También existen varias alternativas no radiométricos, en particular la versión roja del colorante pHrodo, que puede ser utilizado en conjunción con la proteína verde fluorescente (GFP)-etiquetados proteínas o la proteína sensible al pH pHluorin. Sin embargo, debido a los efectos potencialmente grandes que el medio intraphagosomal dura puede tener en tintes y proteínas específicas en el mismo, estas sondas deben ser, como mínimo, combinado con sondas de pH insensibles a ser empleado en la obtención de una relación de pseudo. Como se ejemplifica en la Figura 5, calibraciones experimentos pueden exponer a los efectos del daño colorante como un rango dinámico reducido o distorsionada. En una nota práctica, los experimentos de calibración no siempre son perfectos y pueden ser inviable para llevar a cabo después de cada experimento. En consecuencia, valores de la relación pueden ocasionalmente caer fuera de la gama de la calibración y dar valores imposibles tras la conversión al pH. Puede ser apropIATE a cualquiera expresar estos valores fuera de escala como "mayor / menor-que o igual a" rangos de valores de pH de calibración máximo y mínimo, o para expresar todos los valores como proporciones y estimación de pH que proporciones promedio representan.
Como puso de relieve por el DIP y controla ConcA, la producción de ROS y la actividad V-ATPasa son factores importantes que determinan el pH phagosomal. De hecho, en muchas situaciones, los cambios en los niveles de producción de ROS pueden ser la base de las diferencias en el pH phagosomal, sobre todo en los neutrófilos, y la medición de phagosomal producción de ROS y el pH a menudo van de la mano. Una palabra de advertencia es que ambos fármacos se prestan penetración en la actividad de las enzimas que inhiben pero no a su ubicación dentro de la célula. Ambas enzimas son complejos de múltiples subunidades cuyos componentes individuales deben fagosomas tráfico a 4, y su falta de actividad en fagosomas puede ser consecuencia de la trata o de montaje defectos en lugar de efectos directos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
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- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
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