Abstract
Fagocytose er en grunnleggende prosess der medfødte immunceller uskadeliggjøre bakterier, apoptotiske celler eller andre fremmede partikler for å drepe eller nøytralisere inntatt materiale, eller for å presentere det som antigener og initiere adaptive immunresponser. PH i phagosomes er en kritisk parameter regulerer fisjon eller fusjon med endomembranes og aktivering av proteolytiske enzymer, hendelser som gjør at fagocyttisk vakuole å modnes til en nedbrytende organeller. I tillegg er translokasjon av H + som kreves for produksjon av høye nivåer av reaktive oksygenarter (ROS), som er avgjørende for en effektiv drepende og signalering til andre vertsvev. Mange intracellulære patogener grave fagocyttisk drapet ved å begrense phagosomal forsuring, fremhever betydningen av pH i phagosome biologi. Her beskriver vi en ratiometrisk metode for å måle phagosomal pH i nøytrofile bruker fluoresceinisotiocyanat (FITC) -merket zymosan som fagocyttisk Targets, og live-cell imaging. Analysen er basert på fluorescens-egenskaper av FITC, som blir undertrykket ved sur pH-verdi når eksitert ved 490 nm, men ikke når eksitert ved 440 nm, slik at kvantifisering av en pH-avhengig forhold, heller enn absolutte fluorescens, av en enkelt farge. En detaljert protokoll for å utføre in situ kalibrering fargestoff og konvertering av forholdet til det virkelige pH-verdier, er også tilveiebrakt. Single-dye ratiometrisk metoder blir generelt betraktet som overlegne i forhold til enkelt bølgelengde eller dual-dye pseudo-ratiometrisk protokoller, da de er mindre følsomme overfor perturbasjoner slik som bleking, fokuserer laser endringer, variasjoner og ujevn merking, som forvrenger det målte signal. Denne fremgangsmåten kan lett modifiseres til å måle pH-verdien i andre fagocyttiske celletyper, og zymosan kan erstattes av en hvilken som helst annen aminholdig partikkel, fra inerte perler til levende mikroorganismer. Endelig kan denne fremgangsmåte tilpasses for å gjøre bruk av andre fluorescerende prober som er følsomme for forskjellige pH-områder eller andre phagosomal aktiviteter, noe som gjør det en generalisert protokoll for funksjonell avbildning av phagosomes.
Protocol
Etikk Uttalelse: Alle dyre manipulasjoner ble utført i henhold til retningslinjene fra Forsøksdyrutvalget ved Universitetet i Genève.
1. Utarbeidelse av Fagocyttiske Targets
- Tilsett 20 mg tørket zymosan til 10 ml steril fosfatbuffer-saltvann (PBS). Vortex og varme i et kokende vannbad i 10 min. Avkjøl og sentrifuger ved 2000 xg i 5 min.
- Fjern supernatanten, resuspender i 1 ml PBS og sonikere i 10 minutter i et vannbad sonikator. Overfør 500 ul til to 1,5 ml rør. Sentrifuger ved 11000 x g i 5 min.
- Gjenta vask med 500 mL PBS. Det kokte zymosan kan være delt i porsjoner, frosset og lagret ved -20 ° C.
- Vask zymosan to ganger i 500 mL nylagde 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3 som ovenfor (trinn 1.2).
- Resuspender i 490 ul etter siste vask. Tilsett 10 ul 10 mg / ml FITC ble oppløst i dimetyl sulfoxide (DMSO), vortex, dekk med folie, og inkuber med agitering i 4 timer ved RT.
- Å fjerne ubundet fargestoff, vask som ovenfor (trinn 1.2), først med 0,5 ml DMSO + 150 mL PBS, deretter 0,5 ml DMSO + 300 mL PBS, deretter 0,5 ml DMSO + 450 mL PBS, deretter PBS alene.
- Telle zymosan bruke en hemocytometer. Legg 1 mL av zymosan i 500 ul PBS, vortex, og deretter legge 10 pl til kanten av hemocytometer kammeret, hvor den møter dekkglass plasseres over sentralnettet. Monter hemocytometer på en lys-feltet mikroskop utstyrt med en 20X objektiv.
- Fokus på øvre venstre hjørne inneholder 16 ruter og telle alle zymosan partikler i dette området med en hånd tally teller. Gjenta med nedre høyre hjørne. Beregn zymosan-konsentrasjonen ved hjelp av følgende ligning: Zymosan konsentrasjon = Antall / 2 x 500 x 10 4 zymosan / ml. Merket zymosan kan bli delt i porsjoner, frosset og lagret ved -20 ° C.
- Opsonisere den merkede zymosan with et kanin anti-zymosan antistoff ved 1: 100 fortynning. Vortex og inkuberes i 1 time i et 37 ° C vannbad. Vask med 500 mL PBS som ovenfor (trinn 1.2).
Merk: Sonikering er sterkt anbefalt, spesielt etter opsonization, som zymosan tendens til å danne klumper som kan gjøre analysen vanskeligere senere. Opsonisering med 65% volum / volum rotte eller humant serum kan brukes som et alternativ. - Telle zymosan ved hjelp av et hemocytometer som beskrevet i trinn 1,7-1,8, og fortynn til 100 x 10 partikler / ml 6. Opsonisering med andre fagocyttiske stimulatorer slik som komplement, eller ingen opsonisering, kan alternativt utføres.
2. Live Video Mikros
- Isolere primære muse nøytrofile som beskrevet i detalj andre steder 38.
- Alternativt kan du bruke en hvilken som helst fagocytisk celletype. Hold neutrofiler på is i Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640-medium supplert med 5% føtalt kalveserum (v / v), 200 U penicillin / streptomycin, ved en konsentrasjon på 10 x 10 6 celler / ml til det skal brukes. Andre celletyper kan bli sådd 1-4 dager før.
- Tilsett 2 x 10 5 (20 ul) av nøytrofiler til sentrum av et 35 mm glassbunn fatet, spre fallet ved å tilsette 50 ul medium og inkuber ved 37 ° C i 5 minutter for å la cellene få feste seg.
- Tilsett 1 ml av Hanks balanserte saltløsning (HBSS) oppvarmet til 37 ° C inneholdende det spesifikke MPO inhibitor 4-aminobenzosyre-hydrazid (4-ABH, 10 uM). Ikke-spesifikke MPO-inhibitorer, slik som natriumazid (5 mM), kan også brukes, men har nylig blitt foreslått for å utøve ytterligere ikke-spesifikke effekter på pH 39.
- Montere antenne på en widefield fluorescens mikroskop utstyrt med en 37 ° C varmesystem og en 40X olje objektiv. Inkuber celler uten bildebehandling i 10 min for å tillate celler og utstyr for å stabilisere seg.
- Juster mikroskop innstillingene for å få en lyse-feltet overføring bilde [phase eller kontrast differensial forstyrrelser (DIC) hvis tilgjengelig] med 440 nm eller 490 nm eksitasjon og 535 nm utslipp hvert 30 sek.
- Juster eksponeringstiden og oppkjøp frekvens i henhold til mikroskop system for å unngå for mye fotobleking og fototoksisitet og avhengig av de eksperimentelle spørsmålene som stilles. Begynn image oppkjøpet.
- Etter 2 min, tilsett 10 x 10 6 (50 pl) opsonisert FITC- zymosan til midten av fatet. Juster target: celle-forhold, avhengig av typen av fagocyttsystemet og target brukt.
- Fortsett avbildning i 30 minutter. Etter 30 min stoppe time-lapse erverv og starter en tidtaker. Flytt scenen og ta 10 eller flere snapshots i forskjellige synsfelt til bilde andre phagosomes, alt innen 5 min.
3. Kalibrering og kontrollforsøk
- Fremstille oppløsninger pH kalibrerings (oppskrifter er beskrevet i tabell 1) før dagen for forsøket og fryses i 10 ml porsjoner.Tine kalibreringsløsninger og varm til 37 ° C i et vannbad. Kontroller pH-verdien med pH-meter og registrere den faktiske pH av løsninger.
- Monter en peristaltisk pumpe på glassbunn fatet før image oppkjøpet og opptre live videomikroskopi som beskrevet ovenfor (pkt 2).
- Ved slutten av den 30 min periode anskaffelses slå på pumpen for å fjerne løsning i løpet av fatet, tilsett 1 ml av den første kalibreringsløsningen og stoppe pumpen.
- Vent til signalet stabiliseres, vanligvis 5 min. Gjenta med hver kalibreringsløsning.
- Utføre minst en kalibrerings per eksperimentell dag og kalibrere starter med den høyeste pH-verdi, og som arbeider sekvensielt til det laveste, så vel som fra den laveste pH-verdi og arbeider sekvensielt mot den høyeste.
- Som en kontroll, tilsett 100 mL av 100 mikrometer NADPH oksidase inhibitor difenyl propionium iodide (DPI) fortynnet i HBSS til celler i 900 mL HBSS i glassbunn fatet, ogInkuber i 10 min.
- Starte oppkjøp og legge zymosan som ovenfor (trinn 2.7). Etter 15 min av fagocytose, tilsett 10 pl av 10 pM V-ATPase-inhibitor concanamycin A (conca) fortynnet i HBSS og videre avbildning i ytterligere 15 min.
4. Analyse
- Analyse av time-lapse filmer og phagosome snapshots.
Merk: Følgende instruksjoner er spesifikke for ImageJ. Trinn-for-trinn-instruksjoner kan variere mye, avhengig av programvaren som brukes, men funksjoner som er beskrevet i denne delen er tilgjengelig i de fleste profesjonelle bildeanalyse programvare.- Åpne bilder med profesjonell bildeanalyse programvare. Trekk fra bakgrunnen i 490 kanal ved å tegne en liten firkant ROI med kvadratet polygon markeringsverktøy i et område der det ikke er noen celler, og klikke Plugins> BG subtraksjon fra ROI. Deretter laste det samme ROI på 440 kanal ved å klikke på Rediger> Valg> Gjenopprett Utvalg og gjenta.
- Lag en 32-bit forholdet bilde av den 490 kanalen dividert med 440 kanal ved å klikke Process> Bilde kalkulator ..., velge de riktige bildene i Image1 og image2 drop-down menyer, og deretter velge "Divide" i Operasjon rullegardinmenyen og sjekke 32-bit (float) resultat check-box.
- Endre fargekoding look-up table til en ratio-kompatibel fargekoding ved å klikke på Bilde> Oppslag tabeller> Rainbow RGB. Terskel forholdet bildet for å eliminere 0 og uendelig piksler ved å klikke på Bilde> Adjust> Threshold .... Juster rullefeltene slik at zymosan vises i rødt og klikk Bruk, noe som gjør at Set bakgrunns piksler til NaN er merket.
- Kombiner dette forholdet stabel med lyse-feltet kanal til et flerkanals kompositt ved å klikke på bilde> Farge> Merge-TV, og velge lyse-feltet bilde i grå kanal nedtrekksmenyen og forholdet bildet i den grønne kanalen nedtrekksmenyen, og velgeHold kildebildene sjekke-box. Skanne time-lapse filmer eller stillbilder for å bestemme hvilke phagosomes skal analyseres. Den lyse-feltet kanal er nyttig for dette.
- Tegn regioner av interesse (ROI) ved hjelp av den ovale polygon utvalget verktøyet rundt phagosomes, og legge dem til i ROI leder ved å klikke Analyze> Verktøy> ROI Behandling> Legg til. Måle sin zymosan intensitet forholdet ved å klikke på Mer> Multi-Mål og de-velge én rad per skive check-box.
- For time-lapse filmer, phagosomes spor en om gangen ved å tegne en ROI, skrive Ctrl + M for å måle hvert tidspunkt, og flytting av ROI når det er nødvendig for å spore intensitetsverdier over tid. Kopier målingene fra resultatene vindu inn i et regneark programvare.
Merk: Analyse av 15 (5 tids kurs per eksperiment x 3) uavhengige eksperimenter er ideelt, men mer eller mindre kan være nødvendig avhengig av variasjonen. Lagre Rois er alltid anbefalt. Noen programvarepakker tillate bilde registration og dynamisk oppdatering av ROIs, tilrettelegge for denne delen av analysen.
- Konvertering fra fluorescens til pH-verdier
- Mål 490/440 ratio for phagosomes i kalibrerings time-lapse filmer som beskrevet i kapittel 4.1.
- I et regneark, plotte ratio verdier over tid, og beregne den gjennomsnittlige forholdsverdier fra alle phagosomes innenfor synsfeltet (vanligvis mellom 5-20) fra 5 tidspunkter innen midten av tidsperioden som tilsvarer hver pH kalibrering løsning. (Se også de røde boksene i figur 5A.)
- Plotte disse gjennomsnitts 490/440 ratio verdier mot den faktiske målte pH. Kombiner minst 3 uavhengige kalibreringer i en enkelt graf. Bruke en statistisk eller numerisk programvarepakke for å utføre en ikke-lineær regresjon (best fit kurve), vanligvis til en sigmoidal ligning.
Merk: For eksempel i figur 5B ligningen som ble brukt var en Boltzmann sigmoidal [Y = Bottom + ((Top-Bottom)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], hvor Y-verdiene er de 490/440 forholdstall, X er pH-verdier og øverst, nederst, er V50 og helling parametere beregnet av programvaren. - Bruk innhentet ligningen til å transformere forholdet verdier til pH.
Merk: For eksempel, i figur 5B ligningen oppnådd for kalibreringskurven i nærvær av natriumazid er 490/440-forhold = 1,103 + [(2,89 til 1,103) / (1 + exp ((6,993-pH) /0.9291)] . Løse for pH gir følgende ligning: pH = 6,993 til 0,9291 * [ln ((1,178 / (Ratio-1,103)) - 1))].
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Følgende er representative resultater for et eksperiment der phagosomal pH av primære muse nøytrofile isolert fra benmarg fra villtype eller Hvcn1 - / - mus ble sammenlignet. For et vellykket eksperiment, er det viktig å få nok phagosomes innenfor synsfeltet under hele varigheten av time-lapse film, og samtidig unngå for mange phagosomes, som senere vil være vanskeligere å segment under bildeanalyse. Figur 1 viser eksempler på gode og dårlige confluencies. For tidsavhengig og snapshot analyser, må eksterne zymosan partiklene skilles fra phagosomes og ekskludert fra analysen. Figur 2 viser hvordan den lyse-feltet image kan være nyttig for å hjelpe skille eksterne zymosan partikler fra phagosomes. Figur 3 viser eksempler på typiske phagosome pH tids kurs i villtype i forhold til Hvcn1 - / - Figur 4 illustrerer effekten av tilsetning av NADPH oksidase inhibitor DPI, noe som resulterer i en rask surgjøring, etterfulgt av tilsetning av V-ATPase-inhibitor conca, som reverserer surgjøring. Slike eksperimenter kan være avgjørende for å bevise at de pH-sensitive prober arbeider innenfor phagosomes som de skal. En typisk kalibrering tidsforløpet er representert på figur 5, med rektangler angir omfanget av forholdsverdiene brukes til å konstruere kalibreringskurven. Figur 5 viser i tillegg hvordan fargestoff klorering gjennom MPO aktivitet kan innvirke på intraphagosomal pH-responsen av FITC, fremhever det faktum at prober kan reagere annerledes enn forventet innenfor phagoso mal miljø og viktigheten av in situ kalibrering.
Figur 1. Riktig confluency og mål: cell ratio Den venstre panel viser et eksempel hvor celle confluency er for tynt og målet. Celle forholdet er for lav, minsker sannsynligheten for at en fagocyttisk hendelsen vil skje i synsfeltet. Den midterste panelet viser et eksempel hvor celle confluency er for høy, og cellene blir overfylt. Under disse forhold, kan celler ikke har nok plass til å bevege seg og finne sine mål, eller den kan gjennomgå over hverandre gjør analysen vanskelig senere. Høyre panel viser en ideell celle confluency og første mål: cell ratio, hvor mange celler og mål kan blitt sett og likevel være tydelig skilles fra hverandre en annen. FITC- zymosan er vist i grønt og målestokken representerer 10 mikrometer. /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "target =" _ blank "> Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2. Kjennetegn phagosomes og uningested zymosan. Det venstre panelet viser en sammenslått lyse-feltet image og en 490/440 FITC- zymosan forholdet, mens den høyre panel viser lyse-feltet bildet alene. Phagosomes (små grønne piler) kan skilles fra eksterne partikler, som enten ikke co-lokalisere med celler (kort rød pil) eller hvis fluorescens ikke samsvarer med en mørk senter (lang rød pil) omgitt av en lysere ring, karakteristiske av phagosomes i lyse-feltet image (grønne piler). De skala barer representerer 10 mikrometer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3. Tid kurs, gjennomsnittlig pH og forholdet histogrammer av villtype og Hvcn1 - / -. Nøytrofile phagosomes (A) Typiske gang kurs av phagosomal pH viser at mens det i villtype nøytrofile (blå) pH er nøytral (stiplet linje ) eller svakt alkalisk (heltrukket linje) under tidlige tidspunkter etter inntak, de phagosomes av Hvcn1 - / - nøytrofile (rød) kan enten alkalinize (heltrukket linje) eller forsurer (stiplet linje). (B) Kompilering snapshots tatt 30-35 min etter tilsetning av målene gjør at gjennomsnittsbefolkningen phagosomal pH skal beregnes fra et stort antall phagosomes (villtype: n = 5/1898/383 og Hvcn1 - / -: n = 6 / 1433/451 eksperimenter / phagosomes / celler, barer er gjennomsnitt ± SEM, NS ikke signifikant). (C) Histograms av FITC- zymosan forholdstall avdekke forskjeller i phagosomal pH mellom villtype og Hvcn1 - / - nøytrofile. (Dette tallet har blitt forandret fra [19], med tillatelse.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4. Effekt av NADPH oksidase inhibitor DPI og V-ATPase-inhibitor conca på phagosomal pH. Pre-inkubering i 10 uM DPI resulterte i en rask surgjøring av phagosomes kort tid etter inntak, som ble reversert ved tilsetning av 100 nM conca (pil). (Dette tallet har blitt forandret fra [19], med tillatelse.) Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5. pH kalibrering tidsforløpet og virkninger av MPO inhibering på kalibreringen av FITC-zymosan. (A) En typisk pH-kalibreringskurve intraphagosomal FITC-zymosan. Røde boksene angir området av forholdsverdiene brukes til å konstruere kalibreringskurven. De faktiske pH-verdiene til løsningene som brukes og tiden ved hvilken oppløsningene er endret, er angitt med piler. Kurven representerer gjennomsnittet av 10 phagosomes innenfor et enkelt synsfelt. (B) Inhibering av MPO med den ikke-spesifikke inhibitoren natriumazid (5 mM, Inh MPO) øker det dynamiske område for intraphagosomal FITC-zymosan pH-avhengige responser. Poeng er gjennomsnitt ± SEM (Dette tallet har blitt forandret fra [19], med tillatelse.) Klikk her for å se en larger versjon av denne figuren.
| 1.1 | (2x) Base | |||||
| Buffere | Lager | Slutt (1x) | For 500 ml (2x) | |||
| KCl | 1 M | 140 mm | 140 ml | |||
| MgCl2 | 1 M | 1 mm | 1 ml | |||
| EGTA | 1 M | 0,2 mm | 0,2 ml | |||
| NaCl | 1 M | 20 mm | 20 ml | |||
| 1.2 | Buffere | Lager | Endelige(1x) | Formålet | ||
| MES | 1 M | 20 mm | for pH 5.5 til 6.5 | |||
| HEPES | 1 M | 20 mm | for pH 7,0-7,5 | |||
| Tris | 1 M | 20 mm | for pH 5.5 til 6.7 | |||
| NMDG | 1 M | 20 mm | for pH 5.5 til 6.8 | |||
| 1. 3 | Ionoforer | Stock (100% EtOH) | Slutt (1x) | |||
| Nigericin | 5 mg / ml | 5 ug / ml | ||||
| Monensin | 50 mm | 5 mikrometer | ||||
| 1.4 | For 50 ml | |||||
| pH | 2x Base | Buffer Type | Buffer Vol. | Nigericin | Monensin | |
| 5.0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 pl | 5 pl | |
| 5.5 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 pl | 5 pl | |
| 6.0 | 25 ml | MES | 1 ml | 50 pl | 5 pl | |
| 6.5 | MES | 1 ml | 50 pl | 5 pl | ||
| 7.0 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 pl | 5 pl | |
| 7.5 | 25 ml | HEPES | 1 ml | 50 pl | 5 pl | |
| 8,0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 pl | 5 pl | |
| 8.5 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 pl | 5 pl | |
| 9.0 | 25 ml | Tris | 1 ml | 50 pl | 5 pl | |
| 9.5 | 25 ml | NMDG | 1 ml | 50 pl | 5 pl | |
| Justere pH medKOH eller HCl | ||||||
Tabell 1. Oppskrift for å forberede kalibreringsløsninger. 1.1) Resept for fremstilling av 500 ml av en 2 x baseløsning. 1,2) Resept for fremstilling av de forskjellige buffere som brukes i henhold til pH i kalibreringsløsningen. 1,3) Resept for fremstilling av de ionoforer som brukes i kalibreringsløsningene. 1,4) Resept for å fremstille 50 ml av hver kalibreringsløsning ved hjelp av base, buffere og ionoforer som er beskrevet i 1.1 til 1.3.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Selv om mer tidkrevende enn alternative metoder, som for eksempel spektroskopi og FACS, som benytter en lignende strategi med å bruke et pH-følsomt fargestoff koplet til mål, men måle den gjennomsnittlige pH-verdien av en populasjon av phagosomes, har mikroskopi flere fordeler. Først er den indre og ytre grense, men ikke internalisert kan partikler lett skilles uten å tilsette andre kjemikalier, for eksempel trypan blå eller antistoffer, for å slukke eller merke ytre partiklene, respektivt. Andre er at følgende cellene i sanntid tillater forskere å observere flere aspekter ved phagocytic prosessen samtidig og så effekt på migrasjon, sensing og bindende partikler kan være lett skjelnes her, mens det kan bli oversett med befolkningsbaserte metoder. I tillegg synkronisering av initiering av fagocytose, ofte utført ved å plassere cellene ved 4 ° C, noe som kan forstyrre andre smugler hendelser på grunn av kuldesjokk 40,41, er ingent nødvendig ettersom tiden null kan skjelnes direkte. Faktisk, når opptre live mikroskopi, er dette 4 ° C synkronisering teknikk anbefales ikke å fange tidsperioder nær initieringen av fagocytose som kondens som dannes på bunnen av fatet under temperaturforandringen kan blande seg med det formål nedsenking olje og temperaturforskjeller mellom oppvarmingen oppvask og mikroskop komponenter kan forårsake fokus skifter. En tredje fordel stammer fra det faktum at phagosomes er egentlig heterogene på flere parametere, inkludert, men ikke begrenset til, pH 42, og visse effekter på phagosome pH kan være mer subtil, endre fordelingen av phagosomal pH i stedet for gjennomsnittet av befolkningen, som ble vist i figur 3. Slike observasjoner kan gi dypere mekanistiske innsikt i reguleringen av phagosomal pH.
I den foreliggende undersøkelse, ble FITC valgt som den pH-følsomme fargestoff av valg fordi den erbillig, lett tilgjengelig, og ikke minst har en pKa-verdi på 6,5 med et dynamisk område omfatter pH 3 til 9 i sin frie form 37, som samsvarer med den tidligere antatt pH-området av nøytralt til svakt alkalisk, i henhold til tidligere studier 29,30. Mer nylig en studie som anvender en annen pH-probe kalt snarf, som har en mer grunnleggende pKa på 7,5, uventet estimerte pH-verdier i området 1-2 pH-enheter mer basisk for både villtype og Hvcn1 - / - nøytrofile phagosomes 39. Således er valget av pH-sensoren en viktig parameter for å vurdere avhengig av anvendelsen. I prinsipp kan fremgangsmåten som presenteres her lett tilpasses for å anvende andre pH-følsomme fargestoffer, slik som snarf og 2 ', 7'-bis (2-karboksyetyl) -5- (og-6) -carboxyfluorescein (BCECF), hvis succinimidyl-ester-derivatene er lett koplet til aminholdige partikler, for eksempel zymosan. Faktisk behøver sensorene ikke være begrenset til fluorescerende fargestoffer, som ratiometric pH-følsomme proteiner, slik Sypher 43, kan transduserte og uttrykt av mikroorganismer. Flere ikke-ratiometrisk alternativer eksisterer også, særlig den røde versjonen av fargestoffet pHrodo, som kan anvendes i forbindelse med grønt fluorescerende protein (GFP) -tagged proteiner eller den pH-følsomt protein pHluorin. Men på grunn av de potensielt store effekter som den harde intraphagosomal miljø kan ha på fargestoffer og proteiner målrettede deri, bør disse probene være i det minste i kombinasjon med pH-ufølsomme prober kan benyttes ved utledning av en pseudo-forhold. Som eksemplifisert i figur 5, kan kalibreringer eksperimenter utsette virkningene av fargestoff skade som en redusert eller forvrengt dynamisk område. På en praktisk notat, eksperimenter kalibrerings er ikke alltid perfekt, og kan være unfeasible å utføre etter hvert eksperiment. Følgelig kan forholdsverdiene av og til falle ut av rekkevidde for kalibrering og ga umulige verdier ved konvertering til pH. Det kan approprIate til enten å uttrykke disse off-skala verdier som "større / mindre enn eller lik" maksimums- og minimumskalibrerings pH-verdier, eller for å uttrykke alle verdier som forholdstall og anslag pH varierer at gjennomsnittlig forholdstall representerer.
Som fremhevet av DPI og Conca styrer, ROS produksjon og V-ATPase aktivitet er viktige faktorer som bestemmer phagosomal pH. Faktisk, i mange situasjoner, kan endringer i nivåene av ROS produksjon til grunn forskjeller i phagosomal pH, spesielt i nøytrofile, og måling av phagosomal ROS produksjon og pH ofte går hånd i hånd. Ett ord av forsiktighet er at både narkotika låne innblikk i aktiviteten av enzymer de hemmer, men ikke til deres plassering i cellen. Begge enzymer er multi-subenheten komplekser som individuelle komponenter må trafikken til phagosomes 4, og deres mangel på aktivitet på phagosomes kan skyldes menneskehandel eller monteringsfeil heller enn direkte effekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
- Yeung, T., Grinstein, S. Lipid signaling and the modulation of surface charge during phagocytosis. Immunol Rev. 219, 17-36 (2007).
- Flannagan, R. S., Jaumouille, V., Grinstein, S.
- Fairn, G. D., Grinstein, S. How nascent phagosomes mature to become phagolysosomes. Trends Immunol. 33 (8), 397-405 (2012).
- Nunes, P., Demaurex, N., Dinauer, M. C. Regulation of the NADPH oxidase and associated ion fluxes during phagocytosis. Traffic. 14 (11), 1118-1131 (2013).
- Binder, B., Holzhutter, H. G. A hypothetical model of cargo-selective rab recruitment during organelle maturation. Cell Biochem Biophys. 63 (1), 59-71 (2012).
- Hurtado-Lorenzo, A., et al. V-ATPase interacts with ARNO and Arf6 in early endosomes and regulates the protein degradative pathway. Nat Cell Biol. 8 (2), 124-136 (2006).
- Weisz, O. A.
- Huynh, K. K., Grinstein, S. Regulation of vacuolar pH and its modulation by some microbial species. Microbiol Mol Biol Rev. 71 (3), 452-462 (2007).
- De Vito, P. The sodium/hydrogen exchanger: a possible mediator of immunity. Cell Immunol. 240 (2), 69-85 (2006).
- Moreland, J. G., Davis, A. P., Bailey, G., Nauseef, W. M., Lamb, F. S. Anion channels, including ClC-3, are required for normal neutrophil oxidative function, phagocytosis, and transendothelial migration. J Biol Chem. 281 (18), 12277-12288 (2006).
- Winterbourn, C. C., Kettle, A. J. Redox reactions and microbial killing in the neutrophil phagosome. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 642-660 (2013).
- Seredenina, T., Demaurex, N., Krause, K. H. Voltage-Gated Proton Channels as Novel Drug Targets: From NADPH Oxidase Regulation to Sperm Biology. Antioxid Redox Signal. , (2014).
- Kotsias, F., Hoffmann, E., Amigorena, S., Savina, A. Reactive oxygen species production in the phagosome: impact on antigen presentation in dendritic cells. Antioxid Redox Signal. 18 (6), 714-729 (2013).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and macrophage-targeted NADPH oxidase mediates antifungal host defense and regulation of acute inflammation in mice. J Immunol. 190 (8), 4175-4184 (2013).
- West, A. P., et al. TLR signalling augments macrophage bactericidal activity through mitochondrial ROS. Nature. 472 (7344), 476-480 (2011).
- Bloomfield, G., Pears, C. Superoxide signalling required for multicellular development of Dictyostelium. J Cell Sci.. 116 (Pt 16), 3387-3397 (2003).
- Ramsey, I. S., Moran, M. M., Chong, J. A., Clapham, D. E. A voltage-gated proton-selective channel lacking the pore domain. Nature. 440 (7088), 1213-1216 (2006).
- El Chemaly, A., Demaurex, N. Do Hv1 proton channels regulate the ionic and redox homeostasis of phagosomes? Mol Cell Endocrinol. 353 (1-2), 82-87 (2012).
- El Chemaly, A., Nunes, P., Jimaja, W., Castelbou, C., Demaurex, N. Hv1 proton channels differentially regulate the pH of neutrophil and macrophage phagosomes by sustaining the production of phagosomal ROS that inhibit the delivery of vacuolar ATPases. J Leukoc Biol. , (2014).
- Decoursey, T. E.
- Ramsey, I. S., Ruchti, E., Kaczmarek, J. S., Clapham, D. E. Hv1 proton channels are required for high-level NADPH oxidase-dependent superoxide production during the phagocyte respiratory burst. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (18), 7642-7647 (2009).
- Sturgill-Koszycki, S., et al. Lack of acidification in Mycobacterium phagosomes produced by exclusion of the vesicular proton-ATPase. Science. 263 (5147), 678-681 (1994).
- Clemens, D. L., Lee, B. Y., Horwitz, M. A. Virulent and avirulent strains of Francisella tularensis prevent acidification and maturation of their phagosomes and escape into the cytoplasm in human macrophages. Infect Immun. 72 (6), 3204-3217 (2004).
- Alpuche-Aranda, C. M., Swanson, J. A., Loomis, W. P., Miller, S. I. Salmonella typhimurium activates virulence gene transcription within acidified macrophage phagosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. 89 (21), 10079-10083 (1992).
- Lukacs, G. L., Rotstein, O. D., Grinstein, S. Determinants of the phagosomal pH in macrophages. In situ assessment of vacuolar H(+)-ATPase activity, counterion conductance, and H+ 'leak'. J Biol Chem. 266 (36), 24540-24548 (1991).
- Watanabe, K., Kagaya, K., Yamada, T., Fukazawa, Y. Mechanism for candidacidal activity in macrophages activated by recombinant gamma interferon. Infect Immun. 59 (2), 521-528 (1991).
- Ip, W. K., et al. Phagocytosis and phagosome acidification are required for pathogen processing and MyD88-dependent responses to Staphylococcus aureus. J Immunol. 184 (12), 7071-7081 (2010).
- Clarke, M., Maddera, L. Phagocyte meets prey: uptake, internalization, and killing of bacteria by Dictyostelium amoebae. Eur J Cell Biol. 85 (9-10), 1001-1010 (2006).
- Jankowski, A., Scott, C. C., Grinstein, S.
- Segal, A. W., Geisow, M., Garcia, R., Harper, A., Miller, R. The respiratory burst of phagocytic cells is associated with a rise in vacuolar pH. Nature. 290 (5805), 406-409 (1981).
- Savina, A., et al. NOX2 controls phagosomal pH to regulate antigen processing during crosspresentation by dendritic cells. Cell. 126 (1), 205-218 (2006).
- Rybicka, J. M., Balce, D. R., Chaudhuri, S., Allan, E. R., Yates, R. M. Phagosomal proteolysis in dendritic cells is modulated by NADPH oxidase in a pH-independent manner. EMBO J. 31 (4), 932-944 (2012).
- Mantegazza, A. R., et al. NADPH oxidase controls phagosomal pH and antigen cross-presentation in human dendritic cells. Blood. 112 (12), 4712-4722 (2008).
- Balce, D. R., Allan, E. R., McKenna, N., Yates, R. M. gamma-Interferon-inducible lysosomal thiol reductase (GILT) maintains phagosomal proteolysis in alternatively activated macrophages. J Biol Chem. 289 (46), 31891-31904 (2014).
- Sanjurjo, L., et al. The scavenger protein apoptosis inhibitor of macrophages (AIM) potentiates the antimicrobial response against Mycobacterium tuberculosis by enhancing autophagy. PLoS One. 8 (11), e79670 (2013).
- Yuan, Z., Zhi, L., Li-Juan, Z., Hong-Tao, X. The Utility of Chloroquine in Cancer Therapy. Curr Med Res Opin. , 1-12 (2015).
- Ohkuma, S., Poole, B. Fluorescence probe measurement of the intralysosomal pH in living cells and the perturbation of pH by various agents. Proc Natl Acad Sci U S A. 75 (7), 3327-3331 (1978).
- El Chemaly, A., et al. VSOP/Hv1 proton channels sustain calcium entry, neutrophil migration, and superoxide production by limiting cell depolarization and acidification. J Exp Med. 207 (1), 129-139 (2010).
- Levine, A. P., Duchen, M. R., Segal, A. W. The HVCN1 channel conducts protons into the phagocytic vacuole of neutrophils to produce a physiologically alkaline pH. bioRxiv. , (2014).
- Al-Fageeh, M. B., Smales, C. M. Control and regulation of the cellular responses to cold shock: the responses in yeast and mammalian systems. Biochem J. 397 (2), 247-259 (2006).
- Yui, N., et al. Basolateral targeting and microtubule-dependent transcytosis of the aquaporin-2 water channel. Am J Physiol Cell Physiol. 304 (1), C38-C48 (2013).
- Griffiths, G. On phagosome individuality and membrane signalling networks. Trends Cell Biol. 14 (7), 343-351 (2004).
- Poburko, D., Santo-Domingo, J., Demaurex, N. Dynamic regulation of the mitochondrial proton gradient during cytosolic calcium elevations. J Biol Chem. 286 (13), 11672-11684 (2011).
