Abstract
A fagocitose é um processo fundamental através do qual as células imunes inatas engolir bactérias, células apoptóticas ou de outras partículas estranhas, a fim de matar ou neutralizar o material ingerido, ou apresentá-lo como antigénios e iniciar respostas imunes adaptativas. O pH de fagossomas é um parâmetro crítico de fissão regulação ou fusão com endomembranas e activação de enzimas proteolíticas, eventos que permitem que o vacúolo fagocítica de amadurecer em um organelo degradativa. Além disso, a translocação de H + é necessária para a produção de níveis elevados de espécies reactivas de oxigénio (ROS), as quais são essenciais para a morte eficiente e de sinalização a outros tecidos do hospedeiro. Muitos patógenos intracelulares subverter assassinato phagocytic limitando phagosomal acidificação, destacando a importância do pH em biologia phagosome. Descrevemos aqui um método para a medição raciométrica phagosomal pH em neutrófilos usando isotiocianato de fluoresceína (ITCF) marcado com zimosano como fagocítica targets e geração de imagens de células vivas. O ensaio baseia-se nas propriedades de fluorescência do FITC, que é extinta por pH acídico, quando excitado a 490 nm, mas não quando excitado a 440 nm, permitindo a quantificação de uma relação dependente do pH, em vez de fluorescência absoluta, de um único corante. Um protocolo detalhado para a realização do corante calibração in situ e a conversão de relação a valores de pH verdadeiro também é fornecido. -Dye único raciométrica métodos são geralmente considerado superior ao comprimento de onda único ou protocolos pseudo-ratiometric dual-dye, como eles são menos sensíveis a perturbações tais como o branqueamento, o foco alterações, variações laser e rotulagem irregular, que distorcem o sinal medido. Este método pode ser facilmente modificado para medir o pH em outros tipos de células fagocíticas, e zymosan pode ser substituído por qualquer outra partícula contendo amina, a partir de drageias inertes para os microorganismos vivos. Finalmente, este método pode ser adaptada para fazer uso de outras sondas fluorescentes sensíveis a diferentes gamas de pH ou outro phagosomatividades de al, tornando-se um protocolo generalizado para a imagiologia funcional de phagosomes.
Protocol
Declaração de Ética: Todas as manipulações em animais foram realizados em estrita conformidade com as diretrizes do Comitê da Universidade de Genebra Research Animal.
1. Preparação de Metas fagocíticas
- Adicionar 20 mg de zimosan secou-se para 10 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Agitar em vórtice e aquecimento num banho de água a ferver durante 10 min. Arrefecer e centrifugar a 2000 xg durante 5 min.
- Remover o sobrenadante, ressuspender em 1 ml de PBS e sonicado durante 10 minutos num banho de água sonicador. Transferir 500 uL de dois tubos de 1,5 ml. Centrifugar a 11.000 xg durante 5 min.
- Repita a lavagem com 500 mL PBS. O zimosan fervida pode ser dividido em alíquotas, congelada e armazenada a -20 ° C.
- Lavar duas vezes zimosan em 500 ul preparadas de fresco 0,1 M Na 2 CO 3, pH 9,3 como anteriormente (passo 1.2).
- Ressuspender em 490 mL após a lavagem final. Adicionar 10 ul de 10 mg / ml de FITC dissolvido em dimetil sulfoxidE (DMSO), vortex, cobrir com folha, e incuba-se com agitação durante 4 h à TA.
- Para remover o corante não ligado, lavar como indicado acima (passo 1.2), em primeiro lugar com 0,5 mL de DMSO + 150 ul de PBS, em seguida, 0,5 ml de DMSO + 300 ul de PBS, em seguida, 0,5 ml de DMSO + 450 ul de PBS, em seguida, apenas PBS.
- Contagem de zimosan utilizando um hemocitómetro. Adicionar 1 ml de zymosan a 500 ul de PBS, vórtice, em seguida, adicionar 10 ul para a extremidade da câmara de hemocitómetro, onde se encontra com a lamela colocada sobre a grelha central. Montar o hemocitómetro em um microscópio de campo brilhante equipado com uma objectiva 20X.
- Concentre-se no canto superior esquerdo contendo 16 quadrados e contam todas as partículas de zimosan nesta área, utilizando um contador de contagem mão. Repita com o canto inferior direito. Calcular a concentração de zimosan com a seguinte equação: concentração Zymosan = Contagem / 2 x 500 x 10 4 zimosan / ml. Zimosan marcado pode ser dividido em alíquotas, congelada e armazenada a -20 ° C.
- Opsonizar o wi zymosan rotuladath um anticorpo de coelho anti-zimosan na diluição 1: 100. Vortex e incubar durante 1 hora em um banho de água a 37 ° C. Lava-se com 500 ul de PBS como acima (passo 1.2).
Nota: A sonicação é altamente recomendada, particularmente depois de opsonização, como zimosan tende a formar grumos que podem tornar mais difícil a análise mais tarde. A opsonização com 65% v / v de soro de rato ou humano podem ser utilizados como uma alternativa. - Contagem de zimosan utilizando um hemocitómetro como descrito nos passos de 1,7-1,8, e diluir para 100 x 10 6 de partículas / ml. A opsonização com outros estimuladores fagocíticas, tais como o complemento ou nenhuma opsonização, pode ser alternativamente realizada.
2. Live Video Microscopia
- Isolar neutrófilos primários de ratinho, tal como descrito em detalhe noutro local 38.
- Como alternativa, use qualquer tipo de célula fagocitária. Manter em gelo neutrófilos no Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640 suplementado com 5% de soro de vitelo fetal (v / v), 200 U de penicilina / streptomycin, a uma concentração de 10 x 10 6 células / ml até estar pronto para utilização. Outros tipos de células podem ser semeadas 1-4 dias antes.
- Adicionar 2 x 10 5 (20 ul) de neutrófilos para o centro de um prato de 35 mm com fundo de vidro, gota a espalhar pela adição de 50 uL de meio e incubar a 37 ° C durante 5 min para permitir que as células a aderirem.
- Adicionar 1 ml de solução salina equilibrada de Hank (HBSS) aquecido a 37 ° C contendo o inibidor de MPO específico hidrazida 4-aminobenzóico (4-ABH, 10 uM). Os inibidores não-específicos de MPO, tais como azida de sódio (5 mM), também podem ser usados, mas têm sido sugeridos recentemente para exercer efeitos não-específicos adicionais de pH 39.
- Montar o prato num microscópio de campo amplo de fluorescência equipado com um sistema de aquecimento de 37 ° C e uma objectiva de óleo de 40X. Incubar as células sem imagem durante 10 min para permitir que as células e material para equilibrar.
- Ajuste as configurações de microscópio para adquirir uma imagem de transmissão de campo brilhante [phase ou contraste de interferência diferencial (DIC) se disponível] com 440 nm ou 490 nm de excitação e 535 nm de emissão a cada 30 seg.
- Ajuste o tempo de exposição e freqüência de aquisição de acordo com o sistema de microscópio para evitar o excesso de fotodegradação e fototoxicidade e, dependendo das questões experimentais sejam colocadas. Comece a aquisição de imagem.
- Após 2 minutos, adicionam-se 10 x 10 6 (50 ul) pelo zimosan opsonizado com FITC para o centro do prato. Ajuste alvo: rácios de células, dependendo do tipo de fagócitos e alvo utilizado.
- Continuar imagiologia durante 30 min. Após 30 min parar a aquisição de lapso de tempo e iniciar um temporizador. Mova o palco e capturar 10 ou mais instantâneos em diferentes campos de visão a imagem outros phagosomes, tudo dentro de 5 min.
3. Calibração e Controle de Experimentos
- Prepare as soluções de calibração pH (receitas estão descritos na Tabela 1) antes do dia de experimento e congelar em alíquotas de 10 ml.Descongelar as soluções de calibração e aquecer até 37 ° C num banho de água. Verificar o pH com um medidor de pH e registrar o pH real de soluções.
- Montar uma bomba peristáltica na parte inferior prato de vidro antes da aquisição da imagem e realizar microscopia de vídeo ao vivo como descrito acima (seção 2).
- No final do período de aquisição 30 min ligar a bomba para remover a solução dentro do prato, adicionar 1 ml da primeira solução de calibração e parar a bomba.
- Aguarde até que o sinal estabilize, geralmente 5 min. Repita com cada solução de calibração.
- Executar, pelo menos, uma calibração por dia experimental, calibrar e começando com o mais elevado pH e trabalhando sequencialmente para o mais baixo, bem como a partir do pH mais baixo e trabalhar sequencialmente para o mais alto.
- Como um controlo, adicionar 100 uL de 100 uM de inibidor de NADPH-oxidase iodeto difenil propionium (DPI), diluída em HBSS para as células em 900 ul de HBSS no prato de vidro de fundo, eincube durante 10 min.
- Comece aquisição e adicionar zymosan como acima (passo 2.7). Após 15 min de fagocitose, adicionar 10 ul de 10 mM de inibidor V-ATPase concanamycin A (ConcA) diluídos em HBSS e continuar imagiologia durante mais 15 minutos adicionais.
4. Análise
- Análise de filmes de lapso de tempo e instantâneos fagosoma.
Nota: As instruções a seguir são específicos para ImageJ. Passo-a-passo as instruções podem variar muito, dependendo do software utilizado, mas as funções descritas nesta seção estão disponíveis na maioria dos softwares de análise de imagem profissional.- Abra as imagens com software de análise de imagem profissional. Subtrair o fundo no canal 490 por desenhar um pequeno quadrado ROI com a ferramenta de seleção polígono quadrado em uma área onde não há células e clicando em Plugins> BG Subtração de ROI. Em seguida, fazer o upload do mesmo ROI no canal 440, clicando em Editar> Seleção> Restaurar seleção e repita.
- Faça uma imagem de relação de 32-bit do 490 canal dividido pelo canal 440, clicando em Processo> Calculadora da imagem ..., selecionando as imagens apropriadas nos menus drop-down Image1 e Image2, em seguida, selecionando 'Divide' no menu drop-down Operação e verificando resultado caixa de seleção de 32 bits (float).
- Alterar tabela de consulta a codificação de cores para uma codificação de cores proporção compatível clicando Image> Tabelas de Pesquisa> Rainbow RGB. Limite a relação da imagem para eliminar a 0 e infinito pixels clicando Image> Adjust> Threshold .... Ajuste as barras de rolagem para que zymosan aparece em vermelho e clique em Aplicar, certificando-se os Set pixels de fundo caixa de seleção para NaN é selecionado.
- Combine isso pilha relação com o canal de campo brilhante em um composto multi-canal clicando em Imagem> Cor> Mesclar Canais, e seleccionando a imagem de campo brilhante no menu canal suspenso cinza ea imagem relação no menu dropdown canal verde, e seleccionando oMantenha imagens de origem check-box. Digitalizar os filmes de lapso de tempo ou instantâneos para determinar quais phagosomes estão a ser analisadas. O canal de campo brilhante é útil para este.
- Desenhe regiões de interesse (ROI) usando a ferramenta de seleção polígono oval em torno phagosomes, e adicioná-los para o gerente ROI clicando Analisar> Ferramentas> ROI Manager> Adicionar. Meça o seu rácio de intensidade zymosan clicando em Mais> Multi-Measure e de-selecionar o Uma linha fatia check-caixa por.
- Para filmes de lapso de tempo, trilha fagossomos um de cada vez, desenhando um ROI, digitando Ctrl + M para medir cada ponto de tempo, e movendo o ROI quando necessário para rastrear valores de intensidade ao longo do tempo. Copie as medidas da janela de resultados em um software de planilha.
Nota: Análise de 15 (5 cursos de tempo por experimentação x 3) experiências independentes é ideal, mas mais ou menos pode ser necessária, dependendo da variabilidade observada. Guardar as ROIs é sempre recomendável. Alguns pacotes de software permitem que regi imagemstration e atualização dinâmica de ROIs, facilitando dessa parte da análise.
- A conversão de fluorescência a valores de pH
- Medir a razão 490/440 para phagosomes na calibração filmes de lapso de tempo como descrito na seção 4.1.
- Em uma planilha, traçar os valores da relação com o tempo, e calcular os valores médios da relação de todos os phagosomes dentro do campo de visão (geralmente, entre 5-20) a partir de 5 pontos temporais no meio do período de tempo correspondente a cada calibração de pH solução. (Veja também as caixas vermelhas na Figura 5A.)
- Traçar estas médias de 490/440 valores da razão contra o pH de medição atual. Combinar pelo menos 3 calibrações independentes num único gráfico. Use um pacote de software estatístico ou numérica para executar uma regressão não linear (curva de melhor ajuste), geralmente a uma equação sigmoidal.
Nota: Por exemplo, na Figura 5B a equação utilizada foi uma sigmoidal de Boltzmann [Y = Fundo + ((Top-Bottom)/ (1 + EXP ((V50-X) / Slope))], onde valores Y são as relações 490/440, X são os valores de pH e parte superior, inferior, parâmetros V50 e inclinação são calculados pelo software. - Use a equação obtida para transformar valores da relação de pH.
Nota: Por exemplo, na Figura 5B da equação obtida para a curva de calibração na presença de azida de sódio é Rácio 490/440 = 1,103 + [(2,89-1,103) / (1 + EXP ((6,993-pH) /0.9291)] . Resolvendo para pH dá a seguinte equação: pH = 6,993-0,9291 * [LN ((1.178 / (Ratio-1.103)) - 1))].
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Representative Results
A seguir, são resultados representativos para um experimento onde o pH phagosomal de neutrófilos primários de rato isolados da medula óssea de tipo selvagem ou Hvcn1 - / - ratinhos foram comparados. Para uma experiência bem sucedida, é importante para obter phagosomes suficientes dentro do campo de visão durante toda a duração do filme de lapso de tempo, evitando muitas phagosomes, que mais tarde serão mais difíceis de segmento durante a análise de imagem. A Figura 1 mostra exemplos de boas e más confluencies. Para o tempo-dependente e instantâneo análises, as partículas de zimosan externos deve ser diferenciado de phagosomes e excluídos da análise. A figura 2 ilustra a forma como a imagem de campo brilhante pode ser útil para ajudar a distinguir partículas de zimosan externos de phagosomes. A Figura 3 mostra exemplos de phagosome típico pH tempos cursos de tipo selvagem, em comparação com Hvcn1 - / - A Figura 4 ilustra o efeito da adição do inibidor de NADPH-oxidase DPI, o que resulta numa acidificação rápida, seguido por adição de V-ATPase inibidor ConcA, que inverte a acidificação. Tais experiências podem ser fundamentais para comprovar que as sondas sensíveis ao pH estão trabalhando dentro phagosomes como deveriam. Um curso de tempo de calibração típica é representada na Figura 5, com rectângulos que indicam a gama de valores da relação utilizados para construir a curva de calibração. A Figura 5 mostra adicionalmente como corante cloração por meio de actividade de MPO pode influenciar o intraphagosomal pH-resposta do FITC, destacando o fato que as sondas podem responder de forma diferente do que o esperado no phagoso ambiente mal ea importância de calibração em situ.
Figura 1. Adequada confluência e alvo: razão de células O painel esquerdo mostra um exemplo onde uma confluência celular é muito escasso e o alvo:. Relação célula é demasiado baixo, diminuindo a probabilidade de que um evento fagocítica irá ocorrer no campo de visão. O painel do meio mostra um exemplo onde uma confluência celular é demasiado elevada e células são aglomeradas. Sob estas condições, as células podem não ter espaço suficiente para mover-se e encontrar os seus objectivos, ou pode engatinhar sobre a outra tomada de análise mais difícil mais tarde. O painel da direita mostra uma confluência celular ideal e meta inicial: índice de célula, onde muitas células e metas pode ser visto e ainda assim ser claramente distinguidos uns dos outros. FITC-zymosan é mostrada em verde e a barra de escala representa 10 um. "target =" _ blank /ftp_upload/53402/53402fig1large.jpg "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2. phagosomes distinguir e zymosan uningested. O painel esquerdo mostra uma imagem de campo brilhante resultante da fusão e um rácio 490/440 FITC-zymosan, enquanto o painel direito mostra a imagem de campo brilhante sozinho. Fagossomos (pequenas setas verdes) podem ser distinguidas das partículas externas, que ou não co-localizar com células (seta vermelha curta) ou cuja fluorescência não corresponder-se com um centro escuro (long seta vermelha) cercado por um anel de brilhante, característicos de phagosomes a imagem de campo brilhante (setas verdes) em. As barras de escala representa 10 um. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3. cursos Tempo, pH e relação histogramas médios de tipo selvagem e Hvcn1 - / -. Phagosomes neutrófilos (A) Cursos típicos de tempo de phagosomal pH mostra que, enquanto no tipo selvagem neutrófilos (azul), o pH é neutro (linha pontilhada ) ou ligeiramente alcalino (linha contínua) durante o tempo de pontos iniciais após a ingestão, os phagosomes de Hvcn1 - / - neutrófilos (vermelho) pode alkalinize (linha sólida) ou acidificar (linha pontilhada). (B) Compilação instantâneos tomada 30-35 minutos após a adição de alvos permite que o pH médio phagosomal população a ser calculada a partir de um grande número de fagossomas de tipo selvagem (n = 5/1898/383 e Hvcn1 - / -: n = 6 / 1433/451 / experimentos phagosomes / células, barras são médias ± SEM, NS não significativo). (C) Os histogramas de FITC-zymosan revelam diferenças nas proporções phagosomal pH entre o tipo selvagem e Hvcn1 - / - neutrófilos. (Esta figura foi modificada a partir de [19], com permissão.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4. Efeito do inibidor de NADPH-oxidase DPI e V-ATPase inibidor ConcA phagosomal no pH. A pré-incubação em 10 ^ M DPI resultou numa rápida acidificação de fagossomas logo após a ingestão, a qual foi revertida por adição de 100 nM ConcA (seta). (Esta figura foi modificada a partir de [19], com permissão.) Por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5. tempo-curso pH de calibração e os efeitos de inibição da MPO na calibração de FITC-zimosan. (A) Uma curva de calibração típica de pH intraphagosomal FITC-zimosan. Caixas vermelhas indicam o intervalo de valores de razão utilizados para construir a curva de calibração. Os valores de pH das soluções usadas e os tempos em que as soluções são alterados são indicados por setas. A curva representa a média de 10 fagossomos dentro de um único campo de visão. (B) Inibição da MPO com a azida inibidor não-específico de sódio (5 mM, MPO INH) aumenta a gama dinâmica das respostas dependentes do pH com FITC zymosan intraphagosomal. Pontos são médias ± SEM (Esta figura foi modificada a partir de [19], com permissão.) Por favor, clique aqui para ver a laversão rger desta figura.
| 1.1 | (2x) Base de Dados | |||||
| Buffers | estoque | Final (1x) | Para 500 ml) (2x | |||
| KCl | 1 H | 140 mM | 140 ml | |||
| MgCl2 | 1 H | 1 mM | 1 mL | |||
| EGTA | 1 H | 0,2 mM | 0,2 ml | |||
| NaCl | 1 H | 20 mM | 20 ml | |||
| 1.2 | Buffers | estoque | Final(1x) | Propósito | ||
| MES | 1 H | 20 mM | para pH 5,5-6,5 | |||
| HEPES | 1 H | 20 mM | para pH 7,0-7,5 | |||
| Tris | 1 H | 20 mM | para pH 5,5-6,7 | |||
| NMDG | 1 H | 20 mM | para pH 5,5-6,8 | |||
| 1.3 | Ionóforos | Da (100% de EtOH) | Final (1x) | |||
| Nigericina | 5 mg / ml | 5 ug / ml | ||||
| Monensina | 50 mM | 5 uM | ||||
| 1.4 | Por 50 ml | |||||
| pH | 2x Base de Dados | Tipo de tampão | Tampão Vol. | Nigericina | Monensina | |
| 5 | 25 ml | MES | 1 mL | 50 ul | 5 ul | |
| 5.5 | 25 ml | MES | 1 mL | 50 ul | 5 ul | |
| 6 | 25 ml | MES | 1 mL | 50 ul | 5 ul | |
| 6.5 | MES | 1 mL | 50 ul | 5 ul | ||
| 7 | 25 ml | HEPES | 1 mL | 50 ul | 5 ul | |
| 7,5 | 25 ml | HEPES | 1 mL | 50 ul | 5 ul | |
| 8 | 25 ml | Tris | 1 mL | 50 ul | 5 ul | |
| 8,5 | 25 ml | Tris | 1 mL | 50 ul | 5 ul | |
| 9 | 25 ml | Tris | 1 mL | 50 ul | 5 ul | |
| 9.5 | 25 ml | NMDG | 1 mL | 50 ul | 5 ul | |
| Ajustar o pH comKOH ou HCl | ||||||
Tabela 1. Receita para preparar soluções de calibração. 1.1) Receita para preparar 500 ml de uma solução base de 2x. 1.2) Receita para preparar os diferentes tampões utilizados de acordo com o pH da solução de calibração. 1.3) Receita para preparar os ionóforos usados nas soluções de calibração. 1.4) Receita para preparar 50 ml de cada solução de calibração utilizando as bases, tampões e ionóforos descritos em 1.1-1.3.
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Discussion
Apesar de ser mais demorada do que os métodos alternativos, tais como a espectroscopia e FACS, que empregam uma estratégia semelhante de um corante utilizando sensível ao pH acoplado a alvos mas medir o pH médio de uma população de fagossomas, microscopia oferece várias vantagens. Primeiro é que interno e externo ligado, mas não internalizadas, as partículas podem facilmente ser distinguidos sem ter que adicionar outros produtos químicos, tais como azul de tripano ou anticorpos, para extinguir ou rotular partículas externas, respectivamente. O segundo é que, após as células em tempo real permite aos pesquisadores observar vários aspectos do processo de phagocytic simultânea e assim efeitos sobre a migração, detecção e partículas de ligação pode ser facilmente percebida aqui, enquanto ele pode ser esquecido com métodos baseados populacionais. Além disso, a sincronização do início do fagocitose, muitas vezes realizada por células colocando a 4 ° C, o que pode perturbar outros eventos de tráfico devido ao choque frio 40,41, não ét necessário como tempo zero pode ser discernido directamente. Com efeito, ao realizar a microscopia vivo, este 4 ° técnica de sincronização C não é recomendado se a captura de períodos de tempo perto do início de fagocitose, como a condensação que se forma no fundo do prato durante a mudança de temperatura pode misturar com o óleo objectiva de imersão e diferenças de temperatura entre os componentes do prato e microscópio aquecimento pode causar foco muda. Uma terceira vantagem deriva do facto de que fagossomos são intrinsecamente heterogénea em vários parâmetros incluindo, mas não se limitando a, pH 42, e certos efeitos sobre fagossoma pH pode ser mais subtis, mudando a distribuição de o pH phagosomal em vez do que a população média, conforme foi mostrado na Figura 3. Tais observações podem dar uma percepção mais profunda mecanicistas para a regulação do pH phagosomal.
No presente estudo, FITC foi escolhido como o corante sensível ao pH de escolha porque ébarato, amplamente disponível, e mais importante, tem um pKa de 6,5, com uma gama dinâmica englobando pH 3 a 9, na sua forma livre 37, o que correspondeu a gama de pH inicialmente previsto de neutro a ligeiramente alcalino, de acordo com estudos anteriores 29,30. Mais recentemente, um estudo que utiliza uma sonda de pH diferente, chamada SNARF, o qual tem um pKa mais básico de 7,5, os valores de pH que variam de forma inesperada estimados 1-2 unidades de pH mais alcalino tanto para o tipo selvagem e Hvcn1 - / - fagossomos neutrófilos 39. Assim, a escolha do sensor de pH é um parâmetro importante a considerar, dependendo da aplicação. Em princípio, o método aqui apresentado pode ser facilmente adaptado para utilizar outros corantes sensíveis ao pH, tais como SNARF e 2 ', 7'-bis- (2-carboxietil) -5- (e-6) -carboxyfluorescein (BCECF), cujos derivados de succinimidil-éster são facilmente acoplado a amina contendo partículas, tais como zimosan. De facto, os sensores não necessitam de ser limitados a corantes fluorescentes, como ratiometproteínas sensíveis ao pH ric, tal Sypher 43, poderia ser transduzidas e expressas pelos microrganismos. Várias alternativas não raciométrica também existem, nomeadamente a versão vermelha do corante pHrodo, que pode ser usado em conjunto com a proteína verde fluorescente (GFP) tagged proteínas ou a proteína sensível ao pH pHluorin. No entanto, por causa dos efeitos potencialmente grandes que o meio intraphagosomal dura pode ter sobre os corantes e as proteínas aí específicas, estas sondas devem ser no mínimo combinado com sondas de pH insensíveis a ser empregue na derivação de uma pseudo-razão. Como exemplificado na Figura 5, a calibração de experiências pode expor os efeitos dos danos corante como uma gama dinâmica reduzida ou distorcida. Em uma nota prática, experimentos de calibração nem sempre são perfeitos e pode ser inviável para executar após cada experimento. Consequentemente, os valores das razões pode eventualmente cair fora do intervalo de calibração e a produzir os valores impossíveis após a conversão para pH. Pode ser aproprIate, quer expressar esses valores fora da escala como "maior / menor do que ou igual a" varia valores mínimos de calibração de pH máximo e, ou para expressar todos os valores como rácios e estimativa de pH que os rácios médios representam.
Conforme destacado pelo DPI e ConcA controla, a produção de ROS e atividade V-ATPase são os principais fatores que determinam phagosomal pH. Na verdade, em muitas situações, as mudanças nos níveis de produção de ROS podem estar subjacentes a diferenças na phagosomal pH, particularmente nos neutrófilos, e medição de phagosomal produção de ROS e pH muitas vezes andam de mãos dadas. Uma palavra de cautela é que ambas as drogas emprestar visão sobre a atividade das enzimas que inibem, mas não à sua localização dentro da célula. Ambas as enzimas são complexos multi-subunidade cujos componentes indivíduo deve tráfego para phagosomes 4, e sua falta de atividade em phagosomes pode resultar de tráfico de montagem ou defeitos ao invés de efeitos directos.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zymosan A powder | Sigma-Aldrich | Z4250 | Various providers exist |
| Fluorescein isothiocyanate | Sigma-Aldrich | F7250 | Various providers exist |
| Anti-zymosan antibody (Zymosan A Bioparticles opsonizing reagent) | Life Technologies | Z2850 | Sigma-Aldrich O6637 is an equivalent product. Alternatively 25% serum can be used as an opsonizing reagent. |
| 4-Aminobenzoic hydrazide (4-ABH) | Santa Cruz | sc-204107 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Diphenyleneiodonium chloride (DPI) | Sigma-Aldrich | D2926 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Concanamycin A (ConcA) | Sigma-Aldrich | 27689 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Nigericin | Sigma-Aldrich | N7143 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Monensin | Enzo | ALX-380-026-G001 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Life Technologies | 14200-075 | Toxic, use gloves, various providers exist |
| Hank's balance salt solution | Life Technologies | 14025092 | Ringer's balanced salt solution or other clear physiological buffers may be substituted. |
| Sodium carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S7795 | Various providers exist |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid (MES) | Sigma-Aldrich | M3671 | Various providers exist |
| 4-(2-Hydroxyethyl)piperazine-1-ethanesulfonic acid (HEPES) | Sigma-Aldrich | H3375 | Various providers exist |
| N-Methyl-D-glucamine (NMDG) | Sigma-Aldrich | M2004 | Various providers exist |
| Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-N,N,N′,N′-tetraacetic acid (EGTA) | Sigma-Aldrich | 3777 | Various providers exist |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Sigma-Aldrich | T1503 | Various providers exist |
| Potassium chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9333 | Various providers exist |
| Sodium chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Various providers exist |
| Magnesium chloride (MgCl2) | Sigma-Aldrich | M8266 | Various providers exist |
| Absolute Ethanol (EtOH) | Sigma-Aldrich | 2860 | Various providers exist |
| Glass-bottom 35 mm petri dishes (Fluorodish) | World Precision Instruments | FD35-100 | Ibidi µ-clear dishes or coverslips with appropriate imaging chambers may be sustituted |
| Sonicating water bath | O. Kleiner AG | A sonicator may be used instead, various instrument providers exist | |
| Heamocytometer | Marienfeld GmbH | Various instrument providers exist | |
| Widefield live imaging microscope | Carl Zeiss AG | Various instrument providers exist, but the microscope must be able to image 440/535 and 490/535 excitation/emission respective. Spinning disk confocal set-ups with brightfield capabilities may substituted, but zymosan tend to go out of focus more often. | |
| Peristaltic pump (Dynamax RP-1) | Rainin | Various instrument providers exist | |
| pH meter | Schott Gerate GmbH | Various instrument providers exist | |
| Manual Counter | Milian SA | Various instrument providers exist |
References
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