Con el murino transportador ABC BCRP1 (Abcg2) como un ejemplo, en-silico protocolos se presentan para detectar el uso de promotor alternativo en los genes expresados en tejidos de ratón, y para evaluar la funcionalidad de los promotores alternativos identificados mediante los ensayos de reportero.
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Artículo de método
Métodos para descubrir uso promotor alternativo y la regulación transcripcional de murino BCRP1
En este artículo
Resumen
Resumen
La expresión de genes en diferentes tejidos es a menudo controlado por promotores alternativos que resultan en la síntesis de ARNm con únicas - por lo general no traducidas - primeros exones. BCRP1 (Abcg2), el ortólogo murino de la mama ABC transportador de proteína de resistencia al cáncer (BCRP, ABCG2), tiene por lo menos cuatro promotores alternativos que son designados por los correspondientes cuatro primeros exones alternativos producidos: E1U, E1A, E1B, y E1C. En este documento, en silico protocolos se presentan para predecir el uso promotor alternativo para BCRP1. Además, se describen métodos de ensayo reportero para producir construcciones de reportero de promotores alternativos y para determinar la funcionalidad de los promotores putativos aguas arriba de los primeros exones alternativos que se identifican.
Introducción
Más de la mitad de los genes humanos están regulados por promotores alternativos 1. Cada promotor alternativo puede contener elementos reguladores que pueden ser diferentes de los de otros promotores alternativos. El promotor (s) utilizado en un tejido puede diferir de los utilizados en otro tejido. Por ejemplo, es posible que la activación de una vía de señalización dado puede desencadenar el promotor alternativo para un gen utilizado en un tejido, sin embargo, no tienen efecto sobre o reprimir un promotor alternativo separado para el mismo gen que se utiliza en otro tejido.
La expresión del gen BCRP1 se rige por los promotores alternativos. BCRP1 es el ortólogo murino del gen humano de mama proteína de resistencia al cáncer (BCRP). BCRP es un transportador de casete de unión a ATP (ABC), ABCG2 2, 3 designado formalmente. Como una proteína de la membrana plasmática apical, funciones BCRP / BCRP1 de flujo de salida de una amplia variedad de sustratos naturales y xenobióticos 3, 4. En los seres humanos y los ratones, BCRP / BCRP1 es altamente expresado en órganos farmacológicamente relevantes, tales como el hígado (canalículos biliares), intestino y riñón, así como los órganos con las barreras de los tejidos de la sangre, tales como placenta, cerebro y testículo 2, 5-12. Expresión de BCRP / BCRP1 en hematopoyéticas y otras células madre, incluyendo células madre del cáncer, puede conferir resistencia de estas células a xenobióticos y fármacos quimioterapéuticos contra el cáncer 3.
A principios de trabajo para entender la regulación de la expresión de BCRP en células normales y neoplásicas, se realizó 5 'rápida amplificación de cDNA extremos (5'-RACE) análisis de ARNm de BCRP para determinar su sitio de inicio de la transcripción exacta 13. No sólo eran múltiples sitios de inicio de la transcripción que se encuentran; También se encontraron tres formas alternativas del primer exón, que a su BCRP es sin traducir. Estos primeros exones alternativos - designados E1a, E1b, E1c - se expresaron de manera diferente en una variedad de tejidos humanos. Dos variantes adicionales primer exón fueron descubiertos en una búsqueda BLAST de la base de datos de EST humano utilizando el segundo exón del BCRP 13. Cuatro partidos revelaron una primera exón> 70 kb aguas arriba del exón 2 que fueron designados E1U; otros cuatro partidos reveló ARNm de BCRP que carecía de un primer exón del todo, que fueron designados E1- 13. La presencia de exones líder alternativos se considera que es una manifestación del uso promotor alternativo 14.
En ratones, cuatro exones primera alternativa de BCRP1 se describen que pueden corresponder a otros promotores que regulan la transcripción BCRP 1 en diferentes tejidos de ratón; estos exones / promotores se designan E1U, E1A, E1B y E1C, y se encuentran a unos 70, 58, 15 y 5 kb aguas arriba del exón 2 BCRP1 5, 15. Se encontró que la isoforma E1A ARNm ser predominante en Murine las células madre hematopoyéticas, corazón, pulmón, bazo y cerebro, mientras que la isoforma E1B se expresó en intestino de ratón, células de hígado fetal, y las células precursoras eritroides en la médula ósea 5, 15. El promotor aguas arriba de E1B ha demostrado ser el principal promotor alternativo de gobierno BCRP1 transcripción en intestino de ratón, regulada al menos en parte, por-cíclico-fosfo AMP proteína elemento de respuesta de unión (p-CREB) y un elemento de respuesta CREB única para esa alternativa promotor BCRP1 16. La isoforma E1C mRNA se expresa predominantemente en el hígado murino adulto y riñón 5. La isoforma E1U es indetectable en la mayoría de los tejidos a prueba a excepción de testículo murino, donde es la isoforma predominante expresado 5. BCRP1 expresa en los testículos de ratas se encuentra en ambas uniones endoteliales (células cerradas, myoid peritubulares y células de Sertoli) somáticas y las células germinales (en el endotelio seminíferos, donde se puede proteger espermátidas la última etapa 4). el region aguas arriba de E1U contiene un elemento de respuesta funcional para steroidogenic factor 1 (SF-1) 5. BCRP1 ARNm y proteínas se reducen notablemente en los testículos de SF-1 knockout mice específicos de células de Sertoli, lo que sugiere que la expresión BCRP1 en células de Sertoli murinas se controla mediante SF-1 5.
Los protocolos presentados detalle métodos para detectar exones primera alternativa de BCRP1 en silico, y establecer reportero ensayos basados en la luciferasa para supuestos promotores aguas arriba de los primeros exones alternativos identificados.
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Protocolo
1. predicción in silico de los primeros exones alternativos de BCRP1 Uso del análisis BLAST de la base de datos de EST de ratón
Nota: Este protocolo se describe cómo buscar la etiqueta de secuencia expresada ratón (EST) base de datos de EST con similitud de secuencia con el exón 2 de BCRP1 (que contiene el sitio de iniciación de la traducción) y luego la forma de alinear las secuencias EST que coinciden con las secuencias genómicas para determinar su ubicación en el gen BCRP1 ratón en relación con el extremo 5 'de BCRP1 exón 2.
- Obtener la secuencia de BCRP1 ratón exón 2 mediante la introducción del ARNm secuencia de referencia ID (NM_011920.3) en la ventana de búsqueda de la Ensembl Genome Browser 17, haga clic en "IR". En la siguiente pantalla, seleccione una secuencia de longitud completa (contiene 16 exones):
- En la siguiente pantalla ( "Pantalla basada en la transcripción"), seleccione "16 exones." Esto mostrará una pantalla que contiene la secuencia de todos los exones de BCRP1. Exón 2 de BCRP1 leerá "59; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "Los resultados obtenidos serán similares a los mostrados en la referencia 18..
- Haga clic en la opción "Descargar secuencia". En la siguiente pantalla, seleccione el formato FASTA, y luego haga clic en "Vista previa". En la siguiente pantalla, copiar la secuencia preliminar del exón 2 en el portapapeles.
- Navegue hasta la página 19 BLAST en el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI) sitio web 20.
- Seleccionar genoma "ratón". Pegue la secuencia del exón 2 del portapapeles en el cuadro de consulta.
- Seleccione "EST" en el menú desplegable de base de datos, optimizar para "secuencias muy similares," y luego elija "BLAST". El tiempo de ejecución se llevará unos minutos. Cuando la carrera BLAST se haya completado, aparecerá la página "Resultados".
- Bajo el subtítulo "Descripción" de la página "Resultados", seleccione "TODO", después en "Descargar" y luego "FASTA (completasecuencia) "en el menú desplegable, y luego elegir la opción" Continuar "aparecerá un archivo .txt;. abierta y copiar todo el archivo en el portapapeles El archivo .txt contiene las secuencias de todas las tecnologías ecológicamente racionales con alta similitud de secuencia con el exon2 BCRP1 ratón. pero no su posición en relación con el exón 2 del gen BCRP1.
Nota: Un análisis realizado el 15 de abril el año 2015 identificó 14 EST murinos que alineado con BCRP1 exón 2. Estos se enumeran en la Tabla 1.
- Identificar la localización de la secuencia de EST que es 5 'para el exón 2 en el gen BCRP1. El gen de ratón BCRP1 se encuentra en el cromosoma 6 NC_000072.6 contig (GI: 372099104).
- En la página de inicio BLAST bajo el subtítulo "explosiva Especializada", seleccione "Alinear dos (o más) secuencias utilizando BLAST (bl2seq)."
- Pegar el archivo de texto del portapapeles en el cuadro de búsqueda y escriba en el cuadro 372099104 secuencia sujeto. Optimizar para "secuencias muy similares" del programaselección, y la explosión de correr.
- Una vez que aparezca la ventana de resultados, ver las alineaciones gráficamente haciendo clic en "Gráficos" en la ventana "alineaciones". Usa las flechas derecha e izquierda y hacer zoom para centrarse en BCRP1 / Abcg2 y los alineamientos de secuencias.
- Guarde los alineamientos de secuencias: seleccionar "ALL" en el cuadro "Descripción", a continuación, en el menú desplegable "descarga" seleccionar "Hit mesa (CSV)," y haga clic en "continuar". Este archivo contiene la secuencia de alineación de BCRP1 exón 2 y la alineación de todas las secuencias EST con similitud de secuencia a BCRP1 exon2 relativos a la numeración de los nucleótidos en el cromosoma de ratón contig 6. Cada secuencia completa EST puede generar múltiples alineaciones que abarcan las regiones 5 'y 3' con el exón 2, incluyendo las secuencias solapantes con BCRP1 exón 2.
- A medida que la posición del extremo 5 'del exón 2 corresponderá al nucleótido 58.655.638 en el contig cromosoma 6, designar esto como1, y luego calcular la posición de las secuencias parciales de cada EST 5 'a 58.655.638. Los resultados para los 14 ESTs se dan en la Tabla 1.
Nota: Tenga cuidado para analizar secuencias EST que son 5 'a 1 (es decir, tienen un valor de nucleótidos negativo) como posibles primeros exones. Por ejemplo, en dos de los ESTs que alineados con BCRP1 exón 2 se muestra en la Tabla 1 (AI647825 y AI664571) la secuencia restante era 3 'al exón 2.
Función 2. Evaluación de BCRP1 Alternativa Promotor
- Diseño del reportero construye para BCRP1 E1U, E1A, E1B y promotores E1C
- Utilizando la secuencia de E1U obtenido a partir de la búsqueda de la base de datos de EST, designar a la primera 5 'de nucleótidos de E1U como 1.
- Obtener un cromosoma artificial bacteriano (BAC) en los clones de ratón cromosoma 6 que contiene la secuencia del gen BCRP1 / Abcg2 y la secuencia de al menos 100 kb aguas arriba de laBCRP1 / gen Abcg2 (véase la lista de materiales y equipos).
- Identificar un vector indicador adecuado, tal como la luciferasa plásmido reportero pGL3-Basic.
- Determinar los múltiples sitios de clonación en el vector reportero. KpnI, SacI, Mlu1, NheI, SmaI, XhoI, BglII y HindIII son los sitios de endonucleasas de restricción en el sitio de clonación múltiple del vector pGL3-Basic, en el 5 'a 3'.
Nota: La secuencia de los sitios de digestión está disponible de catálogos de productos de empresas que producen las enzimas de restricción. - Identificar todos los sitios de digestión en el exón E1U y la región 2 kb 5 'de E1U el uso de programas de software como DNA5. Identificar al menos dos sitios de digestión en el sitio de clonación múltiple pGL3-Basic que no se encuentran en E1U o la región aguas arriba 2 kb.
Nota: Asegúrese de elegir un sitio de restricción sitio de clonación múltiple para el cebador directo que se encuentra aguas arriba de la elegida para el cebador inverso para garantizar que la inserción Will estar en la orientación apropiada.
- Preparar adelante y cebadores para PCR que contienen las secuencias de los sitios de restricción múltiples sitios de clonación de endonucleasa de pGL3-basic seleccionados utilizando servicios de síntesis de genes / cebadores comerciales o software de selección de imprimación (véase la lista de materiales y equipos) revertir. Seleccionar un cebador directo localizado ~ 2 kb aguas arriba de la secuencia de E1U y un cebador inverso dentro de la secuencia E1U. Los cebadores utilizados en los autores anteriores trabajos incorporan un sitio SacI en el cebador directo y un sitio NheI en el cebador inverso, y se amplificaron la región genómica de aproximadamente -1906 a 64 con el primer nucleótido 5 'de E1U especificado como + 1 (véase el paso 2.1.1 anterior), y se proporcionan en la referencia 16.
- Amplificar por PCR la región genómica E1U usando estos cebadores, 0,01 a 1 g de la CAV, y PCR Master Mix contiene polimerasas Taq de alta fidelidad (véase la lista de materiales y equipos) con desnaturalización a95 ° C durante 30 segundos, luego 35 a 40 ciclos de PCR, con extensión a 72 ° C (2 min), y el recocido y las temperaturas de fusión en base a las características de fusión de los cebadores utilizados.
Nota: El uso de polimerasas Taq de alta fidelidad es esencial para la secuenciación de regiones promotoras que tienen un alto contenido de GC. Cuando el uso de grandes fragmentos de ADN genómico como un BAC como la plantilla, la estructura secundaria del ADN genómico puede hacer que sea difícil para los cebadores de PCR para unen. Si surge este problema, mejores resultados de la PCR se pueden obtener si la plantilla de ADN genómico largo se corta suavemente mediante sonicación antes de la reacción PCR. - Verificar la longitud del producto de PCR amplificado mediante la comparación contra una escalera de ADN de 1 kb mediante electroforesis en gel de agarosa al 0,8% TAE.
- Amplificar por PCR la región genómica E1U usando estos cebadores, 0,01 a 1 g de la CAV, y PCR Master Mix contiene polimerasas Taq de alta fidelidad (véase la lista de materiales y equipos) con desnaturalización a95 ° C durante 30 segundos, luego 35 a 40 ciclos de PCR, con extensión a 72 ° C (2 min), y el recocido y las temperaturas de fusión en base a las características de fusión de los cebadores utilizados.
- Se digiere el producto de PCR obtenido y el vector pGL3-Basic, utilizando las endonucleasas de restricción específicas para los sitios de digestión de restricción introducidos en el avance y retroceso cebadores según instrucciones suministradas con las enzimas de digestión de restricción.
- Purificar las reacciones de digestión usando gel SV comercial y kit de PCR Clean-Up Sistemas (véase la lista de materiales y equipos), siguiendo el protocolo del kit 21.
- Verificar la digestión y linealización del vector mediante la comparación contra el vector sin cortar utilizando electroforesis en gel de agarosa, luego se corta y se purifica la banda de ADN vector digerido. Medir la concentración del producto de PCR purificado y el vector se purificó usando espectrometría UV (véase la lista de materiales y equipos).
- Purificar las reacciones de digestión usando gel SV comercial y kit de PCR Clean-Up Sistemas (véase la lista de materiales y equipos), siguiendo el protocolo del kit 21.
- Prepare la construcción de reporte E1U ligando el purificada, la enzima de restricción digiere el producto PCR y la luciérnaga vector indicador de luciferasa pGL3-Basic (contenida en el kit de ensayo de indicador; véase la lista de materiales y equipo) a insertar: relaciones vectoriales de 11, 21 y 31, utilizando el "T4 ADN ligasa kit de ligación rápida" según las instrucciones del kit 22, produciendo de este modo la E1U rconstructo eporter, llamado pGL3-E1U.
- Utilice el plásmido pGL3-E1U para transformar bacterias para ampliar clonal pGL3-E1U siguientes instrucciones en el kit de clonación TA (véase la lista de materiales y equipos).
- Confirmar la orientación y la fidelidad del inserto mediante análisis de secuencia.
- Preparar reportero construye para E1A, E1B y E1C utilizando metodología similar a la de E1U. Confirmar la fidelidad de los insertos mediante secuenciación descrito en el apartado 2.1.5.2.
Nota: Los insertos de promotor para E1A, E1B y E1C deben ser aproximadamente -1875 / + 10, -1847 / + 60, y -1904 / + 83 con relación a la primera 5 'de nucleótidos (designada como 1) de E1A, E1B, o E1C, respectivamente.
- Métodos de ensayo de indicador
Nota: Estrategia general de los ensayos de reportero: el promotor putativo (región 5 'aguas arriba) de un gen se inserta en el sitio de clonación múltiple de un vector vacío "reportero" que contiene un "Reporter gen "(por ejemplo, luciferasa de luciérnaga) aguas abajo del sitio de clonación múltiple. El vector se transfecta luego en células eucariotas que expresan el gen de interés. Los factores que actúan en trans que promueven la expresión del gen de interés en estas células debe activar el promotor en el vector reportero transfectadas, causar la expresión de la luciferasa de luciérnaga, que puede ser fácilmente cuantificó con un ensayo de luminiscencia.- Seleccione la línea celular apropiada a utilizar para el ensayo de indicador.
Nota: Para evaluar la actividad del constructo reportero de promotor alternativo E1U, es necesario transfectar que constructo en células que expresan BCRP1 bajo el control del promotor E1U. La línea de células de Sertoli murino TM4 (véase la lista de materiales y equipo) y expresa la proteína BCRP1 BCRP1 ARNm contiene E1U, así como E1A, E1B, y E1C 5. Como control negativo, considerar el uso de una línea celular que no expresa la proteína BCRP1 o ARNm. - Cultura del ce TM4LLS en placas de 24 pocillos a una densidad inicial de 200.000 células / pocillo en una mezcla 1: 1 de medio F12 de Ham y medio de Eagle modificado de Dulbecco con bicarbonato de sodio 1,2 g / L, HEPES 15 mM suplementado con suero de caballo al 5%, 2,5% suero fetal bovino, penicilina (100 UI / ml) y estreptomicina (100 mg / ml), a 37 ° C, 5% de CO 2, como se describe anteriormente 5.
- Seis horas después de colocar las células en cultivo, transfectar las células con 0,2 g de vacío vector pGL3-basic o con 0,2 g de vector pGL3 que contiene el E1U -1906 / + 64 o -1875 / + 10 E1A o -1847 / + 60 E1B o -1904 / + 83 E1C BCRP 1 deleción construir junto con 4 ng de pRL-TK (una luciferasa que expresan vector de Renilla) como control interno, utilizando un kit de transfección de ADN comercial y el protocolo del fabricante 23 (véase la lista de materiales y equipos) .
- 30 horas después de la transfección, retire el medio de crecimiento de la cultured células transfectadas. Se lavan las células una vez con 200 l de PBS, a continuación, eliminar la solución de lavado.
- Medida de la luciérnaga y la actividad de luciferasa de Renilla utilizando un kit comercial de acuerdo con los protocolos del fabricante 24.
- Expresar la actividad para cada tubo como la relación de la actividad luciferasa de luciérnaga dividido por el control interno (Renilla luciferasa); resultados globales se expresan generalmente como la actividad de cada construcción informadora con relación a la de las células transfectadas con el vector básico pGL3 vacío, que se da un valor de 1.
- Seleccione la línea celular apropiada a utilizar para el ensayo de indicador.
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Resultados
1 Identificación de BCRP alternativa la utilización del promotor en los testículos del ratón mediante el análisis de los exones líder
Cuando se sondeó la base de datos de EST en NCBI (abril de 2015) siguiendo los pasos descritos en el Protocolo 1, la EST encontraron que eran contiguo con el extremo 5 'del exón 2 en BCRP 1 mRNA se muestran en la Ta...
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Discusión
La mayoría de los métodos y resultados representativos presentados se describen en el trabajo anterior titulado "B CRP1 la transcripción en los testículos del ratón es controlado por un promotor aguas arriba de un nuevo primer exón (E1U) regulada por el factor 1 de esteroides, a la" que fue publicado en 2013 5 . Además de los resultados representativos representados aquí, en el documento anterior proporciona estimaciones de primera utilización exón alternativo utilizando 5'-RACE PCR y R...
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Divulgaciones
Douglas D. Ross y la Universidad de Maryland, Baltimore tienen derechos de patente a BCRP humana.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas por mérito de revisión a Douglas D. Ross y a Arif Hussain, del Departamento de Asuntos de Veteranos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| COMMERCIAL BIOLOGICAL MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE | kit Ambion Inc., Austin, TX, actualmente disponible a través de Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit de |
| clonación TOPO TA | Life Technologies K450001 | Este kit contiene las bacterias TOP10 químicamente competentes E. coli. | |
| Kit de ligadura rápida de ADN ligasa T4 | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart de alta fidelidad Taq- ADN polimerasa | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contiene una mezcla de enzimas polimerasa Taq de alta fidelidad |
| Reactivo de transfección de ADN XtremeGENE HP | Roche | 6366236001 | |
| Kit de ensayo reportero de luciferasa dual | Promega | E1910 | Incluye el vector reportero vacío básico pGL3 (luciferasa de luciérnaga de luciérnaga), el vector de expresión de luciferasa rRILLA rRLTK y otros vectores de control. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | Para miniprep de plásmidos: aislamiento y purificación de ADN plasmídico de colonias bacterianas |
| vector pCR2.1 | parte del kit | ||
| Vector que contiene luciferasa básica pGL3 | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Vector expresor de luciferasa Renilla | Promega | E2241 | |
| Cromosoma artificial bacteriano | Centro de Recursos de BACPAC, Niños s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 y RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REACTIVOS/PRODUCTOS QUÍMICOS/MEDIOS/SUMINISTROS | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® Sistema de limpieza de gel y PCR SV | Promega | A9281 | Útil para purificar productos de PCR después de la digestión con endonucleasas de restricción |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Proyecto Ensembl | http://Ensembl.org | El proyecto Ensembl produce bases de datos genómicas de vertebrados y otras especies eucariotas, y pone esta información a disposición gratuita en línea. |
| Software de voladura | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web& PAGE_TYPE=Software BlastHome | |
| Primer 3 | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Útil para diseñar cebadores para PCR de 5' RACE |
| Base de datos de nucleótidos | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 células de Sertoli murinas | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminómetro | Turner Biosystems | TD-20/20 | Este es un luminómetro relativamente barato, operado manualmente. Los sistemas automatizados también están disponibles del mismo fabricante que utilizan placas de 96 pocillos. |
| Espectrofotómetros NanoDrop | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | puede utilizar cantidades muy pequeñas de muestra, |
| espectrofotómetro UV/VIS DU 800 y software de análisis de ácidos nucleicos II | , BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
