Summary
С помощью мышиного ABC транспортером Bcrp1 (ABCG2) в качестве примера, в-силикомарганца протоколы представлены для обнаружения альтернативного использования промотора генов экспрессируются в тканях мышей, а также для оценки функциональных возможностей альтернативных промоторов , идентифицированных с использованием репортерных анализов.
Abstract
экспрессии генов в различных тканях, часто под контролем альтернативных промоторов, которые приводят к синтезу мРНК с уникальным - обычно непереведенных - первые экзоны. Bcrp1 (ABCG2), мышиный ортолог на ABC транспортером груди белка устойчивости рака (BCRP, ABCG2), имеет, по меньшей мере, четыре альтернативных промоторов, которые определены соответствующими четырьмя альтернативными первых экзонов производства: E1u, Е1А, Е1В и Е1С. При этом, в-силикомарганца протоколы представлены для прогнозирования альтернативного использования промотора для Bcrp1. Кроме того, методы репортер анализа описаны для получения репортерные конструкции для альтернативных промоторов и определить функциональные возможности предполагаемыми промоторов вверх по течению от альтернативного первых экзонов, которые обозначены.
Introduction
Более половины генов человека регулируются альтернативными промоторами 1. Каждый альтернативный промотор может содержать регуляторные элементы, которые могут отличаться от тех, в других альтернативных промоторов. Промотор (ы), используемые в одной ткани могут отличаться от тех, которые использовались в других тканях. Например, вполне возможно, что активация данного сигнального пути, может вызвать альтернативный промотор гена, используемого в одной ткани, но не оказывают никакого влияния на или репрессировать отдельный альтернативный промотор для того же самого гена, который используется в другой ткани.
Экспрессия гена Bcrp1 определяется альтернативными промоторами. Bcrp1 является мышиная ортолог гена человеческого груди Сопротивление рака протеина (BCRP). BCRP является АТФ-связывающего кассетного (ABC) транспортеру, официально назначенный ABCG2 2, 3. В качестве верхушечного мембранного белка плазмы, BCRP / функции Bcrp1 в оттоке широкий спектр природных и ксенобиотиков субстратов
В начале работы , чтобы понять регуляции экспрессии BCRP в нормальных и опухолевых клеток, 5 'быстрой амплификации концов кДНК (5'-RACE) анализ мРНК BCRP было проведено с целью определения его запуска сайта точной транскрипции 13. Мало того, были множественные сайты начала транскрипции найдено; Также встречаются три альтернативные формы первого экзона, который в BCRP является непереведенными. Эти альтернативные первые экзоны - назначенные E1a, E1b, E1C - были выражены по-разному в различных тканях человека. Два дополнительных первые варианты экзонов были обнаружены в поисках BLAST человеческой базе данных EST с использованием второго экзона BCRP 13. Четыре матча показали первый экзон> 70 кб вверх по течению от экзона 2, которые были назначены E1u; четыре матча показали мРНК BCRP , что не хватало первого экзона полностью, которые были обозначены E1- 13. Наличие альтернативных экзонов лидера считается проявлением использования альтернативного промотора 14.
У мышей четыре альтернативных первые экзоны Bcrp1 описаны , которые могут соответствовать альтернативным промоторы , которые регулируют BCRP 1 транскрипцию в различных тканях мыши; эти экзоны / промоутеры обозначены E1u, Е1А, Е1В и Е1С, и расположены примерно в 70, 58, 15 и 5 кб вверх по течению от Bcrp1 экзона 2 5, 15. Изоформы Е1А мРНК было обнаружено, что преобладающей в Муринае гемопоэтические стволовые клетки, сердца, легких, селезенке и головном мозге, в то время как было выражено изоформы Е1В в кишечнике мыши, клеток печени плода, а также клетки - предшественники эритроидных в костном мозге 5, 15. Промотор вверх по течению от Е1В было показано, что основной альтернативный промотор, регулирующий Bcrp1 транскрипцию в кишечнике мыши, регулируется по меньшей мере, частично, с помощью фосфо-циклического АМФ элемент ответа связывания с белками (п-CREB) и элемент ответа CREB, уникальную для альтернативы Bcrp1 промотор 16. Изоформы Е1С мРНК преимущественно экспрессируется во взрослом мышиной печени и почек 5. Изоформы E1U не обнаруживается в большинстве тканей , протестированных на мышиных семенников, где она является преобладающей изоформы , выраженной 5 за исключением того . Bcrp1 выражается в яичках крыс обнаруживается в обоих соматическими (эндотелиальные плотные соединения, перитубулярных myoid клеток и клеток Сертоли) и половых клеток (в семенных эндотелием, где он может защитить поздней стадии сперматиды 4). региона вверх по течению от E1u содержит функциональный элемент ответа на стероидогенной фактор-1 (SF-1) 5. Bcrp1 мРНК и белка заметно снижается в яичках клеточных специфических нокаутных мышей Сертоли SF-1, предполагая , что экспрессия Bcrp1 в мышиных клетках Сертоли контролируется SF-1 5.
Протоколы , представленные методы подробно , чтобы обнаружить альтернативные первые экзонов Bcrp1 в-силикомарганца и установить люциферазы на основе репортерных анализов для предполагаемых промоутеров вверх по течению от альтернативных экзонов первых выявленных.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. В Silico Прогнозирование альтернативный первый экзонов Bcrp1 Использование BLAST Анализ мыши EST Database
Примечание: Этот протокол описывает, как поиск мыши выражается последовательность тегов (EST) базы данных для ЭБТ с последовательностью сходства с экзона 2 Bcrp1 (который содержит трансляционный начало сайта), а затем, как выравнивать соответствия EST последовательностей геномных последовательностей с целью выяснения их расположение в мыши Bcrp1 гена относительно конца 5 'Bcrp1 экзона 2.
- Получить последовательность для мыши Bcrp1 экзона 2 путем ввода мРНК эталонной последовательности ID (NM_011920.3) в поисковом окне Ensembl Genome Browser 17, нажмите на кнопку "GO" . На следующем экране выберите последовательность полной длины (содержит 16 экзонов):
- На следующем экране ( "транскрипт на основе Display"), выберите "16 экзонов." Это отобразит экран, содержащий последовательность всех экзонов Bcrp1. Экзон 2 Bcrp1 будет читать "59; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "Полученные результаты будут аналогичны тем , которые показаны в ссылке 18..
- Нажмите на кнопку "Скачать" последовательности. В следующем окне выберите формат FASTA, а затем нажмите на кнопку "Preview". В следующем окне, скопируйте последовательность Предварительный просмотр экзоне 2 в буфер обмена.
- Перейдите на домашнюю страницу BLAST 19 на Национальный центр биотехнологической информации (NCBI) веб - сайт 20.
- Выберите "мышь" генома. Вставить последовательность экзона 2 из буфера обмена в поле запроса.
- Выберите "ЭБТ" из выпадающего списка баз данных, оптимизировать "очень сходных последовательностей", а затем выберите "BLAST". Время выполнения операции займет несколько минут. Когда BLAST запуска завершена, появится страница "Результаты".
- Под "Описание" подзаголовком страницы "Результаты", выберите "ALL", затем "Скачать", затем "FASTA (полнаяпоследовательность) "в выпадающем списке, а затем выберите" Продолжить ".txt файл появится;. открытым и скопировать весь файл в буфер обмена .txt файл содержит последовательности всех ЭБТ с высоким сходством последовательности с помощью мыши Bcrp1 exon2. но не их положение по отношению к экзоном 2 в гене Bcrp1.
Примечание: Анализ , проведенный 15 апреля 2015 года выявлено 14 мышиных ЭБТ , что в соответствие с Bcrp1 экзона 2. Они перечислены в таблице 1.
- Определить местоположение последовательности EST, которая составляет от 5 'к экзоне 2 в гене Bcrp1. Ген мыши Bcrp1 находится в хромосоме 6 Contig NC_000072.6 (GI: 372099104).
- На BLAST домашнюю страницу под "Специализированный Blast" подзаголовка, выберите "Выровнять два (или более) последовательностей с использованием BLAST (bl2seq)."
- Вставить текстовый файл из буфера обмена в поле запроса и введите 372099104 в поле при условии последовательности. Оптимизация для "очень сходных последовательностей» в рамках программывыбор, и запустить BLAST.
- После того, как появится окно результатов, просматривать выравнивания графически, нажав на "Графика" в окне "Трассы". Используйте стрелки вправо и влево и масштабирование, чтобы сосредоточиться на Bcrp1 / ABCG2 и выравниваний.
- Сохранение выравнивания последовательности: выберите "ALL" в поле "Описание", то под "загрузить" в раскрывающемся списке выберите "Хит таблицу (CSV)", а затем нажмите на кнопку "продолжить". Этот файл содержит выравнивание последовательности Bcrp1 экзона 2 и выравнивание всех последовательностей EST с последовательностью сходства с Bcrp1 Exon2 относительно нумерации нуклеотидов в контига мыши хромосоме 6. Каждая полная последовательность EST может генерировать несколько выравниваний охватывающих областей 5 'и 3' до экзона 2 в том числе последовательностей, перекрывающих друг друга с Bcrp1 экзоне 2.
- По мере того как положение 5 'конца экзона 2 будет соответствовать нуклеотида 58,655,638 в контига хромосоме 6, обозначают это как+1, А затем вычислить положение частичных последовательностей каждого EST 5 'к 58,655,638. Результаты 14 ЭЧТ приведены в таблице 1.
Примечание: Будьте осторожны , чтобы проанализировать EST последовательности, 5 'до +1 (т.е. имеют отрицательное значение нуклеотид) в качестве потенциальных первых экзонов. Например, в двух из ЭЧТ , которые выровнены с Bcrp1 экзона 2 , показанной в таблице 1 (AI647825 и AI664571) оставшаяся последовательность была 3 'до экзона 2.
2. Оценка Bcrp1 Альтернативные Promoter Функция
- Проектирование репортерных конструкций для Bcrp1 E1u, Е1А, Е1В и Е1С промоутеров
- Используя последовательность E1u, полученную из поиска в базе данных EST, обозначают первые 5 'нуклеотид E1u как +1.
- Получить бактериальную искусственную хромосому (BAC) клон мышиной хромосомы 6, который содержит последовательность гена Bcrp1 / ABCG2 и последовательность по меньшей мере, 100 кб выше по потоку отBcrp1 / ген ABCG2 (см перечень материалов и оборудования).
- Определить подходящий вектор-репортер, таких как люциферазы репортер плазмиды pGL3-Basic.
- Определить сайты множественного клонирования в векторе репортер. KpnI, SacI, Mlu1, NheI, SmaI, XhoI, BglII и HindIII являются эндонуклеазы рестрикции сайтов в сайт множественного клонирования pGL3-Basic вектора, в 5 '3' ориентации.
Примечание: Последовательность варочных сайтов доступен из каталогов продуктов компаний, которые производят ферменты рестрикции. - Определить все сайты Пищеварение в экзоне E1u и область 2 кб 5 'E1U с помощью программ, таких как DNA5. Определить по крайней мере, два пищеварением сайтов в сайт множественного клонирования pGL3-Basic, которые не встречаются в E1u или вверх по течению области 2 кб.
Примечание: Убедитесь, что выбрали множественный сайт рестрикции сайт клонирования для прямого праймера, который находится ближе по потоку от одной выбранной для обратного праймера, чтобы гарантировать, что вставка Вильл быть в правильной ориентации.
- Подготовка прямого и обратного праймеров для ПЦР, которые содержат последовательности для выбранных PGL3 основного сайтов рестрикции множественного клонирования сайт эндонуклеазы с использованием коммерческих услуг генного синтеза / грунтовки или праймера программное обеспечение выбора (см Перечень материалов и оборудования). Выберите прямой праймер, расположенный ~ 2 т.п.н. вверх по течению от последовательности E1u и обратного праймера в пределах последовательности E1u. Праймеры, используемые в авторов предыдущей работы включены сайт SacI в прямого праймера, и сайт NheI в обратного праймера, и усиливается геномную область приблизительно от -1906 до +64 с первым 5 'нуклеотида E1u указанного в + 1 (см шаг 2.1.1 выше), и представлены в справочнике 16.
- ПЦР - амплификации геномной области E1u с использованием этих праймеров, от 0,01 до 1 мкг BAC, и ПЦР мастер - смесь , содержащая высокой точности воспроизведения Taq - полимераз (см перечень материалов и оборудования) с денатурации при95 ° С в течение 30 сек, затем 35 40 циклов ПЦР, с расширением при 72 ° C (2 мин) и отжига и температуры плавления на основе характеристик плавления праймеров, используемых.
Примечание: Использование высокоточных Taq - полимераз имеет важное значение для секвенирования промоторных областей , которые имеют высокое содержание GC. При использовании больших геномных фрагментов ДНК, таких как BAC в качестве матрицы, вторичная структура геномной ДНК может затруднить для ПЦР-праймеров для связывания. Если эта проблема возникает, лучшие результаты ПЦР могут быть получены, если длинный шаблон геномную ДНК разрезается осторожно с помощью обработки ультразвуком перед ПЦР-реакции. - Проверьте длину амплифицированного продукта ПЦР путем сравнения с трапа ДНК длиной 1 т.п.о. с использованием 0,8% TAE электрофореза в агарозном геле.
- ПЦР - амплификации геномной области E1u с использованием этих праймеров, от 0,01 до 1 мкг BAC, и ПЦР мастер - смесь , содержащая высокой точности воспроизведения Taq - полимераз (см перечень материалов и оборудования) с денатурации при95 ° С в течение 30 сек, затем 35 40 циклов ПЦР, с расширением при 72 ° C (2 мин) и отжига и температуры плавления на основе характеристик плавления праймеров, используемых.
- Дайджест ПЦР-продукта, полученного и PGL3-Базового вектора, с использованием рестрикционных эндонуклеаз специфические для переваривания сайтами рестрикции, вводимых в прямого и обратного праймеров согласно иновtructions поставляется с ограничением пищеварения ферментов.
- Очисти реакции с пищеварением с использованием коммерческих SV гель и ПЦР систем очистки набор (список материалов и оборудования), в соответствии с протоколом набора 21.
- Проверьте вываривание и линеаризация вектора путем сравнения его с режиссерский вектор с использованием электрофореза в агарозном геле, а затем вырезать и очистить Гидролизованный полосу ДНК-вектор. Измерьте концентрацию очищенного продукта ПЦР и очищенный вектор с помощью УФ-спектрометрии (см Перечень материалов и оборудования).
- Очисти реакции с пищеварением с использованием коммерческих SV гель и ПЦР систем очистки набор (список материалов и оборудования), в соответствии с протоколом набора 21.
- Подготовьте репортер конструкцию E1u лигированием очищенный, фермента рестрикции расщепляют продукт ПЦР и pGL3-Basic люциферазы светлячка репортер вектор (содержащийся в наборе для анализа репортера, см Перечень материалов и оборудования) на вставки: векторных соотношений 11, 21 и 31, с помощью "Т4 ДНК - лигазы быстрой перевязки набор" в соответствии с инструкциями 22 комплекта, таким образом , создавая E1u гeporter конструкция, названная pGL3-E1U.
- Используйте плазмиды pGL3-E1u для трансформации бактерий клонированных расширить pGL3-E1u следующие инструкции в наборе для клонирования TA (см Перечень материалов и оборудования).
- Подтвердите ориентацию и точность вставки с помощью анализа последовательности.
- Подготовить репортер конструкции для Е1А, Е1В и Е1С с применением подобной методики, как для E1u. Подтверждение верности вставок с помощью секвенирования, как в разделе 2.1.5.2.
Примечание: Промоторные вставки для Е1А, Е1В и E1C должна быть приблизительно -1875 / + 10, -1847 / + 60, и -1904 / + 83 по отношению к первому 5 'нуклеотида (обозначен +1) Е1А, Е1В, или Е1С, соответственно.
- Методы анализа Reporter
Примечание: Общая стратегия репортер анализов: предполагаемый промотор (5 'вверх по течению область) гена вставляется в сайт множественного клонирования пустой "репортер" вектор, который содержит "reporteR ген "(например, люциферазы светлячка) вниз по течению от сайта множественного клонирования. Затем вектор трансфицируют в эукариотические клетки , которые экспрессируют представляющий интерес ген. транскавказском действующие факторы , которые способствуют экспрессии представляющего интерес гена в этих клетках должны активировать промоутер в трансфицированных вектором репортера, в результате чего экспрессию люциферазы светлячка, который может быть легко количественно с помощью анализа люминесценции.- Выберите соответствующую клеточную линию, чтобы использовать для анализа репортера.
Примечание: Для оценки активности альтернативного промотора репортерного конструкта E1u, необходимо трансфекцию, что строить в клетки, которые экспрессируют Bcrp1 под контролем промотора E1u. Мышиный Сертоли клеточная линия TM4 (см Перечень материалов и оборудования) выражает Bcrp1 белок и Bcrp1 мРНК , содержащие E1u, а также Е1А, Е1В и Е1С 5. В качестве отрицательного контроля, рекомендуется использовать клеточную линию, которая не экспрессируют белок Bcrp1 или мРНК. - Культура TM4 в.п.LLS в 24-луночные планшеты при исходной плотности 200000 клеток / лунку в смеси 1: 1 из среды F12 Хэма и модифицированной среде Дульбекко Игла с 1,2 г / л бикарбоната натрия, 15 мМ HEPES, с добавлением 5% лошадиной сыворотки, 2,5% фетальной бычьей сыворотки, пенициллином (100 МЕ / мл), и стрептомицином (100 мкг / мл), при 37 ° С в атмосфере 5% СО 2, как было описано выше 5.
- Через шесть часов после размещения клеток в культуре, трансфекции клеток с 0,2 мкг пустого pGL3 основного вектора или с 0,2 мкг pGL3 вектора, содержащего -1906 / + 64 E1u или -1,875 / + 10 Е1А или -1,847 / + 60 Е1В или -1904 / + 83 Е1С BCRP 1 делеция построить вместе с 4 нг ПРЛ-TK (а Renilla люциферазы-экспрессирующих вектора) в качестве внутреннего контроля, с использованием коммерческого набора ДНК трансфекция и протоколом производителя 23 (см Перечень материалов и оборудования) ,
- 30 ч после трансфекции, удалите носитель роста от КУЛЬТУРАред трансфецированных клеток. Вымойте клетки один раз 200 мкл PBS, а затем удалить промывочного раствора.
- Мера светлячка и активность люциферазы Renilla с использованием коммерческого набора в соответствии с протоколами изготовителя 24.
- Экспресс активность каждой трубки как отношение светлячка активности люциферазы , деленной на внутренней (люциферазы Renilla) контроль; общие результаты, как правило, выражается как активность каждого репортера построить по отношению к количеству клеток, трансфицированных пустым pGL3 основной вектор, который дается значение 1.
- Выберите соответствующую клеточную линию, чтобы использовать для анализа репортера.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Идентификация BCRP 1 альтернативного использования промотора в семенниках мыши с помощью анализа лидера экзонов
Когда база данных EST в базе данных NCBI зондировался (апрель 2015 г. ) с использованием шагов , описанных в Протоколе 1 эстов обнаружили , что были смежными с 5' - концом экзона 2 в BCRP 1 мРНК, показаны в таблице 1, а также с их положением в геномных ДНК по сравнению с началом экзона 2. Один EST получена из C57BL / 6J семенниках мыши , которая прилегает к экзоном 2 в BCRP 1 мРНК имеет последовательности в геномной ДНК 70 т.п.н. вверх от экзона 2, что соответствует E1u (таблица 1). Подобным же образом были обнаружены ЭБТ, соответствующие Е1А, Е1В и E1C. Следует отметить, что два ЭБТ, соответствующие E1C также содержал Е1В сращены с 5'-конца от E1C. Расположение этих предсказанных первых экзонов вотношение к Bcrp1 экзоне 2 на мышиной хромосоме 6 показана на рисунке 1.
Оценка BCRP 1 альтернативной функции промотора
Типичные результаты анализа люциферазы соответствующие E1u, Е1А, Е1В и Е1С промотор-люциферазы репортер конструкции трансфицировали в клетки мышиной TM4 Сертоли (смотри раздел 2.2), показаны на рисунке 2А.
В предыдущей работе, элемент ответа SF-1 было предсказано , чтобы быть в промоторе E1u 5. Если этот мнимый элемент ответа SF-1 участвует в регуляции Bcrp1 транскрипции в семенниках мыши, а затем мутации (как это описано в предыдущей работе 5) этого ответа элемента в промоторе репортерной конструкции E1u уменьшит активность люциферазы , обеспечиваемая этой конструкции когда трансфецировали вTM4 клетки. Результаты типичного эксперимента показаны на фигуре 2В. Мутантный конструкция показывает более низкую активность люциферазы по сравнению с не-мутировали конструкции, с активностью , сравнимой с пустого pGL3 основного вектора, даже в клетках с усиленной экспрессии SF-1 (описанного в предыдущей работе 5). Принудительная экспрессия SF-1 повышает активность оон-мутировали конструкции, но не то, что мутантного один.
Рисунок 1. Схема геномного выравнивания ЭБТ с идентичностью последовательности Bcrp1 экзона 2 с мышиной хромосоме 6. Эти выравнивания были идентифицированы в dbEST поиска BLAST проведенного в апреле 2015. Четыре различных выравнивания были найдены, соответствующие Bcrp1 альтернативные первые экзонов E1u, Е1А, Е1В и Е1С. Эта цифра воспроизводится из предыдущей публикации 5. 
Рисунок 2. (A) Репортер анализа для Bcrp1 промоутеров E1U, Е1А, Е1В и Е1С в BALB / C клеток Сертоли клеток , полученных TM4. Данные выражены в виде люминесценции люциферазы светлячка , нормированной к тому , что из Renilla люциферазы, используя методы , описанные в разделе 2. Данные , показанные являются среднее значение и стандартное отклонение трех различных экспериментов, заключенную в разные дни. Звездочка указывает на существенное отличие от пустого контроля pGL3 вектора с помощью Т -TEST (P <0,01). Эта цифра воспроизводится из предыдущей публикации 5. (В) Влияние мутации элемента отклика SF-1 в повторном Bcrp1 E1uпортер построить на активность люциферазы. Bcrp1 репортер строит с предположительным SF-1 связывающей области (мутировали или не-мутантный) трансфицировали в клетки TM4 с (SF-1, трансфицированные) и без него (вектора), трансфицированных усиленной экспрессии данных SF-1.The Указаны средние из 3-х различных экспериментов, сделано в разные дни; Столбики ошибок обозначают стандартные отклонения. Для каждого эксперимента отдельные анализы проводили в двух повторностях. На рисунке (A) обозначает значительное отличие от контроля пустого вектора pGL3 (P <0,05) с использованием т -тесту, (B) означает статистически значимое различие по сравнению с промоторной конструкцией E1u с использованием т -TEST (P < 0,05). Эта цифра воспроизводится из предыдущей публикации 5. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Таблица 1. Поиск Взрыв мыши EST базы данных по отношению к последовательности второго экзона Bcrp1 25 -28. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой таблицы.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Большинство методов и репрезентативных результатов , представленных описаны в предыдущей работе , озаглавленной "B CRP1 транскрипции в семенниках мыши контролируется промотором перед новым первого экзона (E1u) регулируется стероидогенной фактор-1" , который был опубликован в 2013 году 5 . В дополнение к репрезентативных результатов, изображенных здесь, предыдущий документ представили оценки альтернативного использования первого экзона с использованием 5'-RACE PCR и RT-PCR методику. Кроме того, в-силикомарганца была выполнена идентификация мнимого элемента SF-1 в ответ промотора вверх по течению от E1u и иммунопреципитация хроматина (ЧИП) анализы показали , что SF-1 связан с предположительным элемента ответа SF-1. Функциональные исследования показали , что в мышиных клетках Сертоли, BCRP 1 транскрипции управляется SF-1 с помощью элемента SF-1 в ответ промотора E1u. Эти функциональные исследования включали повышающую регуляцию SF-1 в клетках TM4 по траnsfection или путем применения ингибитора гистондезацетилазы (вориностат), что привело к повышенной экспрессии мРНК BCRP 1 E1u, и увеличение BCRP 1 белка, а также активности BCRP 1 E1u промотора в анализе репортера. Наконец, эти исследования предоставили доказательства , что в яичках из взрослых клеток Сертоли-клеточных специфических SF-1 нокаутных мышей, выражения BCRP 1 мРНК E1u, общая BCRP 1 мРНК и белка Bcrp1 были заметно поубавилось 5. В той же работе также сообщил паттерны экспрессии мРНК Bcrp1 изоформ в различных мышиных тканей, в том числе почек, печени, семенниках, мозге, сердце, легких, мышцах и селезенке 5.
Описанные здесь протоколы - с использованием регулирования Тканеспецифическая BCRP 1 в качестве модели - обеспечить легкое экспериментальную основу , чтобы распутать транскрипционный сложность любого гена , чтобы определить его дифференциалвыражение в различных тканях или клеточных подтипов. Следует подчеркнуть , что результаты , полученные из шагов протокола , описанных для оценок в-силикомарганца может зависеть от времени , так как различные веб - сайты , что дом программное обеспечение и базы данных , используемые могут быть внесены изменения. Методология в-силикомарганца , представленные здесь утилизирует поиска в базе данных EST (dbEST) , как сообщалось ранее 29, который по оценкам, около 18% всех человеческих генов в наборе данных EST используют альтернативные промоторы. Поискав в dbEST может недооценивать альтернативные первые экзоны, потому что другие исследователи - с помощью метода "олиго-покрытия" для получения 1,8 млн 5'-концевые последовательности кДНК из многих человеческих тканей - смогли идентифицировать предполагаемых начала транскрипции сайтов для генов человека и оценки что 52% генов человека RefSeq исследуемых были , возможно , регулируются альтернативными промоторами 1. Интересно отметить, что последнее исследование показало, чтоткани, которые использовали предположительные альтернативные промоторы большинство из них были семенников и мозг; Кроме того, они обнаружили , что гены , кодирующие белки , имеющие отношение к передаче сигнала пути, чаще используют тканевые специфичные промоторы , альтернативные 1. Несмотря на недостатки, упомянутые, dbEST анализ обеспечивают общий обзор 5 'UTR использования для конкретного гена во многих тканях с минимальными усилиями.
Хотя dbEST анализ обеспечивает легкое представление на альтернативном первом использовании экзона, мы настоятельно рекомендуем выполнять 5 'быстрой амплификации концов кДНК (5'-RACE) анализа для проверки использования первого экзона в линии ткани или клеток исследуемого. Коммерческие наборы доступны для 5'-RACE, с подробными и прямолинейный процедурами, предусмотренными изготовителем (см Перечень материалов и оборудования). Хотя несколько отнимает много времени, 5'-RACE исследования дают реальные оценки присутствия, а также последовательность альтернативного первого эксдополнения в мРНК интересов; Кроме того, наличие множественных стартовых сайтов транскрипционных также могут быть обнаружены 13. Для того, чтобы гарантировать достаточное представление, последовательность, по крайней мере от 15 до 25 клонов требуется. Перед тем как секвенирование, необходимо удалить примесные векторных последовательностей из RACE продуктов 5 '. Если это не будет сделано, анализ BLAST может не полностью обнаружить выравнивание последовательности с геном мыши. После первого использования экзон установлено, выводы 5'-RACE могут быть использованы для проверки последующих количественных анализов RT-PCR для альтернативных первых экзонов. В целом, предыдущие работы авторов обнаружили , что существует хорошая корреляция между процентом первого экзона мРНК клонов восстанавливаемых 5'RACE и процент ПЦР - продукта извлеченного для данного альтернативного первого экзона из той же ткани или клеточной линии 5. Кроме того, хорошая корреляция была обнаружена между активностью люциферазы промотора конструкций альтернативных Bcrp1 промоутерове выражение соответствующего альтернативного первого экзона в определенной клеточной линии 5.
В поисках тканесецифического использования альтернативного промотора, если используются целые органы, следует иметь в виду , что альтернативные промоторы / первые экзоны найдены будут отражать гетерогенность ткани органа , такие как железистых элементов, кровеносных сосудов, стромы и т.д. Для Например, семенник представляет собой смесь соматической (Лейдига, Сертоли, myoid и эндотелиальной) клеток и зародышевых (гаплоидных) клеток, а также сосудистую систему. Чтобы исследовать экспрессию первого экзона тканесецифического, будет необходимо выделить специфические ткани из органов.
Другие методы были зарегистрированы для идентификации альтернативного использования промотора и регулирования; Тем не менее, они требуют следующего поколения последовательности и биоинформатики вычисления способна анализировать большое количество данных, полученных. Эти методы включают в себя весь transcriptosome секвенирование (Секвенирование РНК), и ЧИП-последующими статьямигистоны , такие как H3K4me3, который связывается преимущественно с промоторов 30. Хотя эти методы могут быть дорогими для выполнения де Нову, когда фокус находится на экспрессию нескольких специфических генов и тканей, добыча существующих данных может быть более практичным подходом.
Анализы для оценки активности промотора представленные здесь используют PGL3-основной вектор, который содержит многозонных клонированию вверх по течению от гена люциферазы светлячка. Promoter активность измеряется производством люциферазы светлячка, который легко поддаются количественной оценке, после добавления кофакторов и люминесцентного субстрата, путем измерения люминесценции в коммерческом люминометра (список материалов и оборудования). Соответствующий вектор PGL4 может быть сделано , чтобы содержать селективные маркеры (например, неомицин, гигромицину, пуромицин), которые позволили получать стабильно трансфицированных клеток. Протоколы, приведенные в данной работе используют временной трансфекции. Как правило, репортер анализы для PROMOTэр активность выполнены с использованием Котрансфекция с вектором , который конститутивно экспрессирует Renilla (Sea Пэнси) люциферазы (PRL-TK), для контроля за вариаций количества клеток , а также эффективность трансфекции. Важным шагом в создании анализа промотора для данного гена должен быть уверен, что интерес ген экспрессируется в клеточной линии, которая трансфицированных репортерной конструкцией. Во-вторых, когда альтернативное использование промотора присутствует, важно использовать промотор конструкцию, соответствующую альтернативному первого экзона, выраженной в клеточную линию. Например, не следует ожидать, чтобы увидеть свечение для промотора конструкции E1u, который трансфицируют в клетки, которые выражают Bcrp1 исключительно под контролем промотора Е1В. В качестве альтернативы, в качестве отрицательного контроля, трансфекция репортера конструкции в линии клеток, которые не экспрессируют ген или мРНК изоформы интерес должен привести к отсутствию производства люциферазы светлячка.
сonsequences альтернативного использования промотора включают в себя производство того же белка, синтез белков с различными N-концами, или производство различных белков 29. В случае Bcrp1 / BCRP, множественный (тип специфических ткане или клеток) промоторы контролировать производство того же самого белка. Аналогичная картина существует для гена CYP19 (ароматазы) 29, 31. Протоколы, представленные здесь, обеспечивают основные шаги можно использовать, чтобы расшифровать в линии ткани или клеток сложные механизмы контроля транскрипции интересующего белка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Дуглас Д. Росс и Университета штата Мэриленд, Балтимор держать патентные права человека BCRP.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Merit Review Awards Дуглас Д. Росс и Ариф Хуссейн из Департамента по делам ветеранов.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 | |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Ensembl Genome Browser. , http://Ensembl.org (2015).
- Transcript-based Display from Ensembl. , http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822 (2015).
- Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome (2015).
- National Center for Biotechnology Information (NCBI). , http://www.ncbi.nlm.nih.gov (2015).
- Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. , (2014).
- Roche. XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
