Summary
Avec les anticorps monoclonaux transporteur ABC BCRP1 (ABCG2) à titre d'exemple, dans le silico protocoles sont présentés pour détecter l' usage alternatif du promoteur des gènes exprimés dans des tissus de souris, et pour évaluer la fonctionnalité des promoteurs alternatifs identifiés en utilisant des dosages de rapporteur.
Abstract
L'expression des gènes dans différents tissus est souvent contrôlée par des promoteurs alternatifs qui aboutissent à la synthèse d'ARNm avec uniques - - généralement non traduites premiers exons. BCRP1 (ABCG2), l'orthologue murin de l'ABC Breast transporteur Résistance cancer Protein (BCRP, ABCG2), a au moins quatre autres promoteurs qui sont désignés par les quatre premiers exons correspondants alternatifs produits: E1U, E1A, E1B et E1C. Ici, in-silico protocoles sont présentés pour prédire l' utilisation de promoteur alternative pour BCRP1. En outre, les méthodes de dosage de rapporteur sont décrits pour produire des constructions rapporteurs de promoteurs alternatifs et pour déterminer la fonction de promoteurs putatifs en amont des autres premiers exons identifiés.
Introduction
Plus de la moitié des gènes humains sont réglementés par des promoteurs alternatifs 1. Chaque promoteur alternative peut contenir des éléments régulateurs qui peuvent être différentes de celles des autres promoteurs alternatifs. Le promoteur (s) utilisé dans un tissu peut être différent de ceux utilisés dans un autre tissu. Par exemple, il est possible que l'activation d'une voie de signalisation donnée peut déclencher le promoteur d'un gène de remplacement utilisé dans un tissu, mais n'a aucun effet sur ou réprimer un promoteur alternatif distinct pour le même gène qui est utilisé dans un autre tissu.
L'expression du gène BCRP1 est régie par des promoteurs alternatifs. BCRP1 est l'orthologue murin du gène humain du sein Cancer Resistance Protein (BCRP). BCRP est une cassette de liaison à l' ATP (ABC) transporteur, officiellement désigné ABCG2 2, 3. En tant que plasma protéine de la membrane apicale, BCRP Fonctions / BCRP1 à efflux une grande variété de substrats naturels et xénobiotiques
Dans le travail tôt pour comprendre la régulation de l' expression de BCRP dans les cellules normales et néoplasiques, 5 'amplification rapide des extrémités d'ADNc (5'-RACE) analyse de BCRP ARNm a été réalisée afin de déterminer son site de départ de la transcription exacte 13. Non seulement plusieurs sites de début de transcription trouvés; rencontre également, trois variantes du premier exon, qui est non traduite BCRP. Ces alternatives premiers exons - désignés E1a, E1B E1c - ont été exprimés différemment dans une variété de tissus humains. Deux variantes supplémentaires premier exon ont été découverts dans une recherche BLAST de la base de données EST humaine en utilisant le second exon de BCRP 13. Quatre résultats ont révélé un premier exon> 70 kb en amont de l'exon 2 qui ont été désignés E1U; quatre autres matches ont révélé BCRP ARNm qui manquait un premier exon entièrement, qui ont été désignés E1- 13. La présence d'exons alternatifs leader est considéré comme une manifestation de l' utilisation du promoteur alternatif 14.
Chez la souris, quatre autres premiers exons de BCRP1 sont décrits qui peuvent correspondre à des promoteurs alternatifs qui régissent Bcrp 1 transcription dans les tissus de souris différentes; Ces promoteurs / exons sont désignés E1U E1A, E1B et E1C et sont situés à environ 70, 58, 15 et 5 kb en amont de l' exon 2 BCRP1 5, 15. L'isoforme E1A de l'ARNm a été jugée prédominante dans Murine des cellules souches hématopoïétiques, le cœur, le poumon, la rate et le cerveau, tandis que l'isoforme E1B a été exprimé dans l' intestin de souris, des cellules hépatiques foetales et des cellules précurseurs érythroïdes dans la moelle osseuse 5, 15. Le promoteur en amont de E1B a été démontré que le promoteur majeur alternatif régissant BCRP1 la transcription dans l'intestin de la souris, régulée au moins en partie, par phospho-AMP cyclique protéine élément de réponse de liaison (p-CREB) et un élément de réponse à CREB unique à cette variante BCRP1 promoteur 16. L'isoforme E1C ARNm est exprimé de manière prédominante dans le foie et le rein de souris adulte 5. L'isoforme E1U est indétectable dans la plupart des tissus testés à l' exception des testicules de souris, où il est l'isoforme dominante exprimée 5. BCRP1 exprimé dans les testicules de rat se trouve dans les deux (jonctions endothéliales serrées, les cellules myoïdes péritubulaires, et les cellules de Sertoli) somatiques et les cellules germinales (dans l'endothélium séminifère, où il peut protéger spermatides stade avancé 4). Le regd' ions en amont de E1U contient un élément de réponse fonctionnelle pour stéroïdogénique factor-1 (SF-1) 5. BCRP1 ARNm et la protéine sont nettement réduits dans les testicules de SF-1 souris knockout spécifiques des cellules de Sertoli, suggérant que l' expression BCRP1 dans les cellules de Sertoli murines est contrôlé par SF-1 5.
Les protocoles présentés détail les méthodes pour détecter d' autres premiers exons de BCRP1 in silico, et d'établir des dosages de rapporteur à base de luciférase pour les promoteurs putatifs en amont des autres premiers exons identifiés.
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Protocol
1. In Silico Prediction of Alternative premiers exons de BCRP1 Utilisation de l' analyse BLAST de la base de données de souris EST
Remarque: Ce protocole décrit comment rechercher l'étiquette de séquence exprimée de la souris (HNE) base de données pour écotechnologies avec similarité de séquence exon 2 de BCRP1 (qui contient le site d'initiation de traduction), puis comment aligner les correspondants séquences EST à des séquences génomiques pour vérifier leur BCRP1 emplacement dans le gène de la souris par rapport à l'extrémité 5 'de l'exon 2 BCRP1.
- Obtenir la séquence pour BCRP1 de la souris exon 2 en entrant la séquence de référence ID ARNm (NM_011920.3) dans la fenêtre de recherche du navigateur Ensembl Genome 17, cliquez sur "GO". Dans l'écran suivant, sélectionnez une séquence pleine longueur (contient 16 exons):
- Dans l'écran suivant ( "Affichage à base Transcription-"), sélectionnez "16 exons." Cela permet d'afficher un écran contenant la séquence de tous les exons de BCRP1. Exon 2 de BCRP1 va lire "59; ... -AAAGGC TATCAA-3 ' "Les résultats obtenus seront similaires à celles montrées dans la référence 18..
- Cliquez sur l'option "Téléchargement de séquence". Dans l'écran suivant, sélectionnez le format FASTA, puis cliquez sur "Aperçu". Dans l'écran suivant, copier la séquence Aperçu de l'exon 2 dans le presse-papiers.
- Accédez à la page d' accueil de BLAST 19 sur le National Center for Biotechnology Information (NCBI) site web 20.
- Sélectionnez génome "Souris". Coller la séquence du presse-papiers dans la boîte de requête exon 2.
- Sélectionnez "écotechnologies" dans le menu déroulant de base de données, optimiser pour "séquences très similaires", puis choisissez "BLAST". Durée prendra quelques minutes. Lorsque la course BLAST est terminée, la page "Résultats" apparaît.
- Sous la rubrique "Description" de la page "Résultats", sélectionnez "ALL", puis "Télécharger", puis "FASTA (completséquence) "dans le menu déroulant, puis choisissez" Continuer "Un fichier .txt apparaît;. ouverte et copiez l'intégralité du fichier dans le presse-papiers Le fichier .txt contient les séquences de tous les écotechnologies avec similarité de séquence élevée avec le exon2 de BCRP1 de la souris. mais pas leur position par rapport à l'exon 2 du gène BCRP1.
Note: Une analyse effectuée le 15 Avril, ici 2015 et 14 écotechnologies murines qui aligné avec BCRP1 exon 2. Ceux - ci sont énumérés dans le tableau 1.
- Identifier l'emplacement de la séquence EST qui est en 5 'de l'exon 2 du gène BCRP1. Le gène de souris BCRP1 est situé dans le contig NC_000072.6 chromosome 6 (GI: 372099104).
- Sur la page d'accueil de BLAST sous le "souffle spécialisés" sous-position, sélectionnez "Aligner deux (ou plus) des séquences en utilisant BLAST (bl2seq)."
- Collez le fichier texte à partir du presse-papiers dans la boîte de requête et entrez 372099104 dans la boîte de séquence sujet. Optimiser pour "séquences hautement similaires" sous programmesélection, et BLAST exécuter.
- Une fois la fenêtre de résultats apparaît, voir les alignements graphiquement en cliquant sur "Graphics" dans la fenêtre "Alignements". Utilisez les flèches droite et gauche et de zoom pour se concentrer sur BCRP1 / ABCG2 et les alignements de séquences.
- Enregistrer les alignements de séquences: sélectionnez "ALL" dans la boîte "Descriptions", puis sous la rubrique "téléchargement" déroulant, sélectionnez "Hit table (CSV)," puis cliquez sur "continuer". Ce fichier contient l'alignement des séquences de l'exon 2 BCRP1 et l'alignement de toutes les séquences d'EST avec une similarité de séquence BCRP1 exon2 par rapport à la numérotation des nucléotides dans le chromosome de la souris 6 contig. Chaque séquence complète EST peut générer de multiples alignements des régions 5 'et 3' étendant à l'exon 2, incluant les séquences qui se chevauchent avec BCRP1 exon 2.
- Que la position de l'extrémité 5 'de l'exon 2 correspond au nucleotide 58655638 dans le chromosome contig 6, désigner ce que+1, Puis calculer la position des séquences partielles de chaque EST 5 'à 58.655.638. Les résultats pour les 14 ESTs sont donnés dans le tableau 1.
Remarque: Veillez à analyser les séquences EST qui sont 5 'à +1 (ie, une valeur de nucléotides négatifs) potentiels premiers exons. Par exemple, dans deux des ESTs qui alignées avec BCRP1 exon 2 montré dans le tableau 1 (AI647825 et AI664571) la séquence restante était de 3 'à l' exon 2.
2. Évaluation de BCRP1 Alternative Promoteur Fonction
- Conception de produits de construction rapporteurs pour BCRP1 E1U, E1A, E1B et promoteurs de E1C
- En utilisant la séquence de E1U obtenue à partir de la recherche de la base de données EST, désigner le premier 5 'nucléotides de E1U comme +1.
- Obtenir un chromosome bactérien artificiel (BAC), le clone du chromosome 6 de la souris qui contient la séquence du gène BCRP1 / ABCG2 et la séquence d'au moins 100 kb en amont duBCRP1 / gène ABCG2 (voir la liste des matériaux et équipements).
- Identifier un vecteur rapporteur approprié tel que le plasmide rapporteur luciférase pGL3-Basic.
- Déterminer les sites de clonage multiple dans le vecteur rapporteur. Kpnl, Sacl, Mlu1, Nhel, Smal, Xhol, BglII et HindlII sont les sites d'endonucléase de restriction dans le site de clonage multiple du vecteur pGL3-Basic, dans le sens 5 'à 3'.
Remarque: La séquence des sites de digestion est disponible à partir de catalogues de produits des entreprises qui produisent les enzymes de restriction. - Identifier tous les sites de digestion dans l'exon E1U et la région 2 kb 5 'de E1U utilisant des logiciels tels que DNA5. Identifier au moins deux sites de digestion dans le site de clonage multiple pGL3-Basic qui ne se trouvent pas dans E1U ou 2 kb région en amont.
Remarque: Assurez-vous de choisir un site de clonage site de restriction multiple pour l'amorce sens qui est en amont de celle choisie pour l'amorce inverse pour assurer que le wil d'insertionl être dans le bon sens.
- Préparer avant et arrière amorces pour la PCR qui contiennent des séquences pour les sites multiples de restriction du site de clonage endonucléase pGL3-base sélectionnés à l'aide des services commerciaux de synthèse génique / amorce ou logiciel de sélection primaire (voir la liste des matériaux et équipements). Sélectionner une amorce sens située ~ 2 kb en amont de la séquence E1U et une amorce antisens dans la séquence E1U. Les amorces utilisées dans les auteurs de travaux antérieurs incorporé un site Sacl dans l'amorce sens et un site Nhel dans l'amorce inverse et amplifié la région génomique d'environ -1906 à 64 de la première 5 nucleotide de E1U spécifiée + 1 (voir étape 2.1.1 ci - dessus), et sont fournis en référence 16.
- Amplifier par PCR la région génomique E1U en utilisant ces amorces, 0,01 à 1 pg du BAC et PCR master mix contenant polymérases Taq haute fidélité (voir la liste des matériaux et équipements) avec dénaturant à95 ° C pendant 30 secondes, puis 35 à 40 cycles de PCR avec extension à 72 ° C (2 min) et de recuit et des températures de fusion en fonction des caractéristiques de fusion des amorces utilisées.
Note: L'utilisation de haute fidélité polymérases Taq est essentiel pour les régions du promoteur de séquençage qui ont une teneur élevée en GC. Lors de l'utilisation de grands fragments d'ADN génomique, tels que le taux d'alcoolémie en tant que matrice, la structure secondaire de l'ADN génomique peut être difficile pour des amorces de PCR pour lier. Si ce problème se pose, les résultats de la PCR meilleurs peuvent être obtenus si la longue matrice d'ADN génomique est cisaillé par sonication doucement avant la réaction PCR. - Vérifier la longueur du produit amplifié par PCR en le comparant à une échelle d'ADN de 1 kb en utilisant 0,8% de TAE électrophorèse sur gel d'agarose.
- Amplifier par PCR la région génomique E1U en utilisant ces amorces, 0,01 à 1 pg du BAC et PCR master mix contenant polymérases Taq haute fidélité (voir la liste des matériaux et équipements) avec dénaturant à95 ° C pendant 30 secondes, puis 35 à 40 cycles de PCR avec extension à 72 ° C (2 min) et de recuit et des températures de fusion en fonction des caractéristiques de fusion des amorces utilisées.
- Digérer le produit de PCR obtenu et le vecteur pGL3-Basic, en utilisant les endonucléases de restriction spécifiques pour les sites de digestion de restriction introduits dans les amorces sens et antisens selon instructions fournies avec les enzymes de restriction de digestion.
- Purifier les réactions de digestion à l' aide de gel de SV commercial et kit PCR Clean-Up Systems (voir la liste des matériaux et équipements), suivant le protocole du kit 21.
- Vérifier la digestion et la linéarisation du vecteur en le comparant contre le vecteur uncut par électrophorèse sur gel d'agarose, puis couper et purifier la bande d'ADN de vecteur digéré. Mesurer la concentration du produit de PCR purifié et le vecteur purifié par spectrométrie UV (voir la liste des matériaux et équipements).
- Purifier les réactions de digestion à l' aide de gel de SV commercial et kit PCR Clean-Up Systems (voir la liste des matériaux et équipements), suivant le protocole du kit 21.
- Préparer la construction rapporteur E1U en ligaturant le purifiée, l'enzyme de restriction digéré produit de PCR et luciole vecteur rapporteur luciférase pGL3-Basic (contenu dans le kit de dosage de rapporteur; voir la liste des matériaux et de l'équipement) à insérer: ratios de vecteur de 11, 21 et 31, en utilisant l ' «ADN ligase kit de ligature rapide de T4" selon les instructions du kit 22, produisant ainsi le E1U reporter construction, nommé pGL3-E1U.
- Utilisez le plasmide pGL3-E1U pour transformer des bactéries pour développer clonale pGL3-E1U instructions suivantes dans le kit de clonage TA (voir la liste des matériaux et équipements).
- Confirmer l'orientation et la fidélité de l'insert par analyse de séquence.
- Préparer journaliste construit pour E1A, E1B et E1C en utilisant une méthodologie similaire pour E1U. Confirmer la fidélité des inserts par séquençage de l'article 2.1.5.2.
Nota: Les inserts de promoteurs pour E1A, E1B et E1C doit être d'environ -1875 / + 10 -1847 / + 60 et -1904 / + 83 par rapport à la première 5 nucleotide (désigné par 1) de E1A, E1B ou E1C, respectivement.
- Méthodes de dosage de rapporteur
Remarque: La stratégie générale des dosages de rapporteur: le promoteur putatif (5 'en amont de la région) d'un gène est inséré dans le site de clonage multiple d'un "reporter" vecteur vide qui contient un "reportegène r "(par exemple la luciférase de luciole) en aval du site de clonage multiple. Le vecteur est ensuite transfecté dans des cellules eucaryotes qui expriment le gène d'intérêt. Les facteurs agissant en trans qui favorisent l' expression du gène d'intérêt dans ces cellules doivent activer le promoteur dans le vecteur rapporteur transfectées, ce qui provoque l'expression de la luciférase de luciole, qui peut être aisément quantifié par un dosage par luminescence.- Sélectionnez la ligne cellulaire appropriée à utiliser pour le dosage de rapporteur.
Remarque: Pour évaluer l'activité du promoteur alternatif E1U construction rapporteur, il est nécessaire de transfecter cette construction dans des cellules qui expriment BCRP1 sous le contrôle du promoteur E1U. La lignée cellulaire de Sertoli murin TM4 (voir la liste des matériaux et de l' équipement) exprime la protéine BCRP1 et BCRP1 ARNm contenant E1U, ainsi que E1A, E1B et E1C 5. Comme témoin négatif, pensez à utiliser une lignée cellulaire qui n'exprime pas la protéine BCRP1 ou de l'ARNm. - Culture du CE TM4IIs dans des plaques à 24 puits à une densité initiale de 200.000 cellules / puits dans un mélange 1: 1 de milieu F12 de Ham et de Eagle modifié du milieu de Dulbecco avec 1,2 g / L de bicarbonate de sodium, 15 mM de HEPES complété avec du sérum de cheval à 5%, 2,5% sérum fœtal bovin, de la pénicilline (100 UI / ml) et streptomycine (100 pg / ml) à 37 ° C, 5% de CO 2, comme décrit précédemment 5.
- Six heures après avoir placé les cellules en culture, la transfection des cellules avec 0,2 pg du vecteur pGL3-basic vide ou avec 0,2 pg du vecteur pGL3 contenant les -1906 / + 64 E1U ou -1875 / + 10 E1A ou -1847 / + 60 E1B ou -1904 / + 83 E1C Bcrp 1 délétion construire avec 4 ng de la pRL-TK (un vecteur de luciférase exprimant Renilla) en tant que contrôle interne, en utilisant un kit ADN de transfection commerciale et le protocole du fabricant 23 (voir la liste des matériaux et équipements) .
- 30 h de transfection, retirez le support de croissance de la cultured cellules transfectées. Laver les cellules une fois avec 200 pi de PBS, puis retirer la solution de lavage.
- Mesurer la luciole et l' activité luciférase de Renilla en utilisant un kit commercial selon les 24 protocoles du fabricant.
- Exprimer l'activité pour chaque tube comme le rapport de l'activité de la luciférase de luciole , divisé par le (luciférase de Renilla) de contrôle interne; les résultats globaux sont habituellement exprimés sous forme de l'activité de chaque construction de rapporteur par rapport à celle des cellules transfectées avec le vecteur pGL3 de base vide, qui est donné une valeur de 1.
- Sélectionnez la ligne cellulaire appropriée à utiliser pour le dosage de rapporteur.
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Representative Results
Identification de Bcrp 1 variante promoteur utilisation dans les testicules de souris par l' analyse des exons leader
Lorsque la base de données EST au NCBI a été sondé (Avril 2015) en utilisant les étapes décrites dans le protocole 1, les écotechnologies trouvé qui étaient contiguës à l' extrémité 5 'de l' exon 2 dans Bcrp 1 ARNm sont présentés dans le tableau 1, ainsi que leur position dans génomique ADN par rapport au début de l' exon 2. Un eST provenant C57BL / 6J testicule de souris qui est contiguë à l' exon 2 de l' ARNm de BCRP 1 a des séquences dans l' ADN génomique de 70 kb en amont de l' exon 2, ce qui correspond à E1U (tableau 1). De même, écotechnologies correspondant à E1A, E1B et E1C ont été détectés. À noter est que les deux écotechnologies correspondant à E1C contenaient également E1B épissage à l'extrémité 5 'de E1C. L'emplacement de ces premiers exons préditsBCRP1 rapport à l' exon 2 de la souris sur le chromosome 6 est représenté sur la figure 1.
Évaluation de Bcrp fonction de promoteur 1 alternative
Les résultats d'analyse de luciférase typiques correspondant à E1U, E1A, E1B et E1C constructions rapporteurs promoteur-luciférase transfectées dans TM4 cellules de Sertoli murin (voir section 2.2) sont présentés dans la figure 2A.
Dans des travaux antérieurs, un élément de réponse SF-1 a été prévu pour être dans le promoteur E1U 5. Si cette SF-1 élément de réponse putatif est impliquée dans la régulation de la BCRP1 transcription dans les testicules de souris, puis mutation (comme décrit dans un précédent article 5) de cet élément de réponse dans le E1U promoteur construction rapporteur permettra de réduire l'activité de la luciférase produite par cette construction lorsqu'il est transfecté danscellules TM4. Les résultats d'une expérience typique sont présentés dans la figure 2B. Le produit de construction mutée présente une activité luciférase inférieure à la construction non-muté, avec une activité comparable à celle du vecteur pGL3-basic vide, même dans des cellules présentant une expression forcée de SF-1 (décrit dans un article précédent 5). l'expression forcée de SF-1 augmente l'activité de la construction non-muté, mais non celle de celui muté.
La figure 1. Schéma de l'alignement génomique des écotechnologies avec une identité de séquence BCRP1 exon 2 avec le chromosome murin 6. Ces alignements ont été identifiés dans une recherche BLAST dbEST réalisée en Avril 2015. Quatre alignements distincts ont été trouvés, ce qui correspond à BCRP1 alternatives premiers exons E1U, E1A, E1B et E1C. Ce chiffre est reproduit à partir d' une publication antérieure 5. 
La figure 2. Essai (A) Reporter pour BCRP1 promoteurs E1U, E1A, E1B et E1C dans c Sertoli cellules TM4 BALB / dérivés de cellules. Les données sont exprimées comme la luminescence de la luciférase de luciole normalisée à celle de Renilla luciférase, en utilisant des méthodes décrites dans la section 2. Les données présentées sont la moyenne et l' écart type de trois expériences différentes, effectuées sur des jours différents. L'astérisque indique une différence significative de la lutte contre les vecteurs pGL3 vide en utilisant le t -test (P <0,01). Ce chiffre est reproduit à partir d' une publication antérieure 5. (B) Les effets de la mutation de l'élément de réponse SF-1 dans le re BCRP1 E1Uporter construire sur l'activité luciférase. journaliste BCRP1 construit avec la région de liaison putative SF-1 (muté ou non muté) ont été transfectées dans des cellules TM4 avec (SF-1 transfectées) et sans (vecteur transfectées) l'expression forcée de données SF-1.Les indiqués sont la moyenne de 3 expériences différentes, effectuées sur des jours différents; les barres d'erreur représentent les écarts types. Pour chaque expérience, des dosages individuels ont été effectués en double. Dans la figure, (A) représente une différence significative par rapport au contrôle pGL3 vecteur vide (P <0,05) en utilisant le t -test; (B) signifie une différence statistiquement significative par rapport à la construction de promoteur E1U utilisant le t -test (P < 0,05). Ce chiffre est reproduit à partir d' une publication antérieure 5. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.
Tableau 1. Recherche Blast de la base de données EST de souris contre la séquence du second exon de BCRP1 25 -28. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette table.
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Discussion
La majorité des méthodes et des résultats représentatifs présentés sont décrits dans les travaux antérieurs intitulé "B CRP1 transcription dans les testicules de souris est contrôlée par un promoteur en amont d'un premier roman exon (E1U) régulé par stéroïdogénique factor-1," qui a été publié en 2013 5 . En plus des résultats représentatifs décrits ici, le document précédent a fourni des estimations de remplacement première utilisation de l'exon en utilisant la méthodologie de PCR et RT-PCR 5'-RACE. En outre, in-silico identification d'un SF-1 élément de réponse putative dans le promoteur en amont de E1U a été accompli, et immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) des essais ont démontré que SF-1 lié à la SF-1 élément de réponse putatif. Des études fonctionnelles ont montré que dans les cellules de Sertoli de souris, 1 Bcrp la transcription est contrôlée par SF-1 par l' intermédiaire de l'élément SF-1 dans la réponse du promoteur E1U. Ces études fonctionnelles comprenaient une régulation positive de SF-1 dans les cellules TM4 par transfection ou par l'utilisation d'un inhibiteur d' histone désacétylase (en vorinostat), ce qui a donné lieu à une expression accrue de Bcrp 1 E1U ARNm, et une augmentation Bcrp 1 protéines ainsi que l' activité du Bcrp 1 E1U promoteur dans un dosage rapporteur. Enfin, ces études ont prouvé que dans les testicules de SF-1 souris knockout spécifiques Sertoli cellules adultes, les expressions de Bcrp 1 E1U ARNm, protéine totale Bcrp 1 ARNm et BCRP1 ont été nettement diminués 5. Le même travail a également signalé les profils d'expression des isoformes BCRP1 ARNm dans une variété de tissus murins, y compris les reins, le foie, les testicules, le cerveau, le cœur, les poumons, les muscles et la rate 5.
Les protocoles décrits ici - à l' aide de la réglementation spécifique du tissu de Bcrp 1 comme un modèle - fournissent un cadre expérimental facile à démêler la complexité de la transcription d'un gène quelconque pour déterminer son différentiell'expression dans divers tissus ou sous-types cellulaires. Il faut souligner que les résultats obtenus à partir des étapes de protocole décrites pour les évaluations in silico peuvent être en fonction du temps des divers sites Web qui hébergent le logiciel et les bases de données utilisées peuvent être sujets à changement. La méthodologie de silico en présentée ici utilise des recherche dans la base de données EST (dbEST) tel que rapporté précédemment 29, qui estime qu'environ 18% de tous les gènes humains dans l'ensemble de données EST emploient des promoteurs alternatifs. Recherche de l'dbEST peut sous-estimer d'autres premiers exons, parce que d'autres chercheurs - en utilisant une méthode «oligo-capping" pour produire 1,8 million de séquences 5'-terminales des ADNc de nombreux tissus humains - ont été en mesure d'identifier les sites de début de transcription putatifs pour les gènes humains et estimation que 52% des gènes humains RefSeq étudiés ont été peut - être régulée par des promoteurs alternatifs 1. Fait intéressant, cette dernière étude a révélé que latissus utilisés promoteurs alternatifs putatifs l'étaient plus testis et le cerveau; En outre, ils ont constaté que les gènes codant pour des protéines liées à des voies de transduction du signal sont plus susceptibles d' avoir recours à spécificité tissulaire des promoteurs alternatifs 1. Malgré les inconvénients mentionnés, dbEST analyses donnent une idée approximative de 5 'utilisation de UTR pour un gène particulier dans de nombreux tissus avec un minimum d'effort.
Bien que l'analyse dbEST donne un aperçu facile à alternatif première utilisation exon, nous vous recommandons fortement d'effectuer 5 'amplification rapide des extrémités d'ADNc (5'-RACE) analyse pour vérifier la première utilisation de l'exon dans une ligne de tissus ou de cellules à l'étude. Des kits commerciaux sont disponibles pour 5'-RACE, avec des procédures détaillées et simples fournies par le fabricant (voir la liste des matériaux et équipements). Bien que quelque peu consommatrice de temps, des études 5'-RACE fournissent des estimations réelles de la présence ainsi que la séquence de remplacement premier exons dans l'ARNm d'intérêt; En outre, la présence de plusieurs sites d'initiation de la transcription peut également être détectée 13. Pour assurer une représentation suffisante, le séquençage d'au moins 15 à 25 clones est nécessaire. Avant le séquençage, il est essentiel d'éliminer contaminantes séquences de vecteurs à partir de produits 5 'RACE. Si cela n'a pas été fait, l'analyse BLAST peut échouer complètement pour détecter un alignement de séquence avec le génome de la souris. Une fois que la première utilisation de l'exon est établie, les résultats 5'-RACE peuvent être utilisées pour valider des essais quantitatifs ultérieurs RT-PCR pour d'autres premiers exons. En général, les travaux antérieurs des auteurs a constaté qu'il existe une bonne corrélation entre le pourcentage de premiers clones d'ARNm exon récupérés par 5'RACE et le pourcentage de produit de PCR récupéré pour un premier exon alternatif donné à partir de la même ligne de tissus ou de cellules 5. En outre, une bonne corrélation a été trouvée entre les activités de constructions de promoteur luciférase pour d'autres promoteurs BCRP1 une l'expression du premier exon alternatif correspondant dans une lignée cellulaire particulière 5.
Dans la recherche de l' utilisation alternative de promoteur spécifique des tissus, si des organes entiers sont utilisés, il faut être conscient que les promoteurs / premiers exons alternatifs trouvés reflètent l'hétérogénéité des tissus de l'organe tels que des éléments glandulaires, les vaisseaux sanguins, stroma, etc. Pour par exemple, le testicule est un mélange de somatique (Leydig, Sertoli, myoïde et endothéliales) et des cellules germinales (haploïdes), ainsi que la vascularisation. Pour sonder premier exon expression spécifique d'un tissu, il sera nécessaire d'isoler les tissus spécifiques des organes.
D'autres méthodes ont été rapportées pour identifier l'usage alternatif du promoteur et de la réglementation; cependant, ceux-ci exigent le séquençage de prochaine génération et de la bioinformatique calcul capable d'analyser la grande quantité de données produites. Ces méthodes comprennent le séquençage de transcriptosome ensemble (ARN suivants), et ChIP-seq dehistones tels que H3K4me3, qui se lie préférentiellement aux promoteurs 30. Bien que ces méthodes peuvent être coûteux pour effectuer de-novo, lorsque l'accent est mis sur l' expression de quelques gènes et des tissus spécifiques, l' exploitation minière des données existantes peut être une approche plus pratique.
Les dosages pour l'estimation de l'activité de promoteur présentée ici emploient le vecteur pGL3-basic, qui contient une région de clonage multiple en amont du gène de la luciférase de luciole. L'activité du promoteur est mesurée par la production de luciférase de luciole, qui est facilement quantifiée, après addition de cofacteurs et d'un substrat luminescent, par mesure de luminescence dans un luminomètre commercial (voir la liste des matériaux et équipements). Le vecteur pGL4 lié peut être fait pour contenir des marqueurs sélectionnables (par exemple, la néomycine, hygromycine, puromycine), ce qui permet la production de cellules transfectées de façon stable. Les protocoles donnés dans le présent document utilisent transfection transitoire. En général, des dosages de rapporteur pour promotactivité er sont effectuées en utilisant une co-transfection avec un vecteur qui exprime constitutivement Renilla (Sea Pensée) luciférase (PRL-TK), afin de contrôler les variations du nombre de cellules et l'efficacité de la transfection. Une étape cruciale dans l'établissement d'un essai de promoteur pour un gène donné est d'être sûr que le gène d'intérêt est exprimée dans la lignée cellulaire qui est transfectée avec la construction reporter. D'autre part, lorsque l'usage alternatif du promoteur est présent, il est important d'utiliser la construction de promoteur qui correspond au premier exon exprimée dans la lignée cellulaire transfectée. Par exemple, ne vous attendez pas à voir la luminescence pour la construction de promoteur E1U qui est transfecté dans des cellules qui expriment BCRP1 uniquement sous le contrôle du promoteur de E1B. En variante, comme un contrôle négatif, la transfection de la construction de rapporteur dans une lignée de cellules qui n'expriment pas le gène ou l'ARNm de l'isoforme d'intérêt devraient se traduire par aucune production de luciférase de luciole.
Le cONSEQUENCES d'usage alternatif du promoteur comprennent la production de la même protéine, la production de protéines ayant des extrémités N-terminales différentes, ou à la production de différentes protéines 29. Dans le cas de BCRP1 / BCRP, multiple (tissu ou spécifiques de type cellulaire), les promoteurs contrôlent la production de la même protéine. Il existe un modèle similaire pour la CYP19 (aromatase) gène 29, 31. Les protocoles présentés ici fournissent les étapes fondamentales on peut utiliser pour déchiffrer dans une lignée cellulaire ou tissulaire des mécanismes complexes de contrôle de la transcription d'une protéine d'intérêt.
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Disclosures
Douglas D. Ross et l'Université du Maryland, Baltimore détiennent des droits de brevet à BCRP humaine.
Acknowledgments
Ce travail a été soutenu par le mérite examen des prix à Douglas D. Ross et à Arif Hussain du ministère des Anciens Combattants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 | |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Ensembl Genome Browser. , http://Ensembl.org (2015).
- Transcript-based Display from Ensembl. , http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822 (2015).
- Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome (2015).
- National Center for Biotechnology Information (NCBI). , http://www.ncbi.nlm.nih.gov (2015).
- Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. , (2014).
- Roche. XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
