Summary
Med den murine ABC-transportør Bcrp1 (ABCG2) som et eksempel, i-silico-protokoller er presentert for å detektere alternativ promoter bruk i gener som blir uttrykt i musevev, og for å evaluere funksjonaliteten av de alternative promotorer som er identifisert ved hjelp av rapportør analyser.
Abstract
Genekspresjon i forskjellige vev blir ofte styrt av alternative promotorer som resulterer i syntese av mRNA med unike - vanligvis utranslaterte - først eksoner. Bcrp1 (ABCG2), murine orthologue av ABC transportør Breast Cancer Resistance Protein (BCRP, ABCG2), har minst fire alternative arrangører som er utpekt av de tilsvarende fire alternative første eksoner produsert: E1U, E1A, E1B, og E1C. Heri, in-silico protokoller presenteres å forutsi alternativ arrangøren bruk for Bcrp1. Videre er rapportøranalysefremgangsmåter er beskrevet for å fremstille rapportør konstruksjonene for alternative promotorer og for å bestemme funksjonaliteten av mulige aktivatorer oppstrøms av de alternative første eksonene som er identifisert.
Introduction
Mer enn halvparten av menneskets gener er regulert av alternative arrangører 1. Hvert alternativ arrangøren kan inneholde regulatoriske elementer som kan være forskjellige fra de i andre alternative arrangører. Promotoren (e) anvendes i en vev kan være forskjellig fra de som brukes i et annet vev. For eksempel, er det mulig at aktivering av en gitt signalveien kan utløse den alternative promoter for et gen utnyttes i en vev, men har ingen effekt på eller undertrykke en separat alternativ promoter for det samme gen som er benyttet i et annet vev.
Uttrykk for Bcrp1 genet er styrt av alternative arrangører. Bcrp1 er den murine orthologue av det humane brystkreft Resistance protein (BCRP) genet. BCRP er en ATP-bindende kassett (ABC) transporter, formelt utpekt ABCG2 to, tre. Som en apikal plasmamembranprotein, for å BCRP / Bcrp1 funksjoner dyseutstrømningen et bredt utvalg av naturlige og xenobiotiske substrater
Tidlig i arbeidet med å forstå regulering av BCRP uttrykk i normale og neoplastiske celler, ble 5 'rask forsterkning av cDNA endene (5'-RACE) analyse av BCRP mRNA utføres for å fastslå den nøyaktige transkripsjonen start side 13. Ikke bare var flere transkripsjonen startsider funnet; også oppdaget var tre alternative former for det første ekson, som i BCRP er uoversatt. Disse alternative første eksoner - utpekt E1A, E1B, E1c - ble uttrykt forskjellig i forskjellige humane vev. Ytterligere to første ekson varianter ble oppdaget i en BLAST søk av menneske EST databasen ved hjelp av andre exon av BCRP 13. Fire kamper avdekket en første ekson> 70 kb oppstrøms ekson 2, som ble utpekt E1u; fire andre kampene avslørte BCRP mRNA som manglet et første ekson helt, som ble utpekt E1- 13. Tilstedeværelsen av alternative leder eksoner er ansett for å være en manifestasjon av alternative promoter bruk 14.
Hos mus er fire alternative første eksoner av Bcrp1 beskrevet som kan tilsvare alternative arrangører som styrer BCRP en transkripsjon i forskjellige muse vev; disse eksoner / arrangører er utpekt E1U, E1A, E1B og E1C, og ligger ca 70, 58, 15 og 5 kb oppstrøms fra Bcrp1 exon 2 5, 15. Den E1A mRNA isoform ble funnet å være dominerende i Murine hematopoetiske stamceller, hjerte, lunge, milt, og hjernen, mens E1B isoform ble uttrykt i mus tarmen, føtale leverceller, og erytroide forløperceller i benmargen 5, 15. Promoteren oppstrøms fra E1B ble vist å være den viktigste alternative promotoren som styrer Bcrp1 transkripsjon i mus tarmen, reguleres i det minste delvis, ved fosfo-cyklisk-AMP responselement bindende protein (p-CREB) og en CREB responselement som er unik for den alternative Bcrp1 promoter 16. Den E1C mRNA isoform er hovedsakelig uttrykt i voksen murine lever og nyre fem. Den E1U isoformen ikke påvises i de fleste vev som ble testet med unntak av muse-testikler, hvor det er den dominerende isoform uttrykt 5. Bcrp1 uttrykt i rotte testiklene finnes i både somatiske (endotelceller tett veikryss, peritubular myoid celler og Sertoli celler) og kjønnsceller (i seminiferøst endotelet, hvor det kan beskytte sent stadium spermatider 4). region oppstrøms fra E1U inneholder en funksjonell respons element for steroidogenic faktor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA og protein er markert redusert i testiklene til Sertoli celle-spesifikke SF-1 knockout mus, noe som tyder på at Bcrp1 uttrykk i murine Sertolicellene styres av SF-1 5.
Protokollene som presenteres detalj metoder for å oppdage alternative første eksoner av Bcrp1 in-silico, og å etablere luciferase-baserte reporter analyser for mulige arrangører oppstrøms fra de alternative første eksoner identifisert.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. I Silico Prediction of Alternative Første Eksoner av Bcrp1 Bruke BLAST analyse av Mouse EST Database
Merk: Denne protokollen beskriver hvordan du søker musen uttrykte sekvens tag (EST) database for ESTs med sekvenslikhet til ekson 2 av Bcrp1 (som inneholder translasjonsforskning start stedet) og deretter hvordan å justere matchende EST sekvenser til genomiske sekvenser for å fastslå deres plassering i mus Bcrp1-genet i forhold til 5'-enden av exon 2 Bcrp1.
- Skaff sekvensen for mus Bcrp1 exon 2 ved å taste inn mRNA referansesekvensen ID (NM_011920.3) i søkevinduet på Ensembl Genome Browser 17, klikk på "GO". I neste skjermbilde velger du en full-lengde sekvens (inneholder 16 eksoner):
- I neste skjermbilde ( "Transcript-baserte Display"), velg "16 Eksoner." Dette vil vise et skjermbilde som inneholder sekvensen av alle eksoner av Bcrp1. Exon 2 av Bcrp1 vil lese "59; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' »De oppnådde resultater vil være lik de som er vist i referanse 18..
- Klikk på "Last ned sekvensen" alternativet. I neste vindu velger FASTA format, og klikk deretter på "Preview". I neste skjermbilde, kopiere Forhåndsvisning sekvens av exon 2 til utklippstavlen.
- Naviger til BLAST hjemmeside 19 på Nasjonalt Senter for Bioteknologi Information (NCBI) website 20.
- Velg "Mouse" genom. Lim exon 2 sekvens fra utklippstavlen i tekstboksen.
- Velg "ESTs" fra databasen dropdown, optimalisere for "svært lignende sekvenser," og velg deretter "BLAST." Kjør tid vil ta noen minutter. Når BLAST løp er fullført, vil "Resultater" side vises.
- Under "Beskrivelser" varenummer av "Resultater" side, velg "ALL" og deretter "Last ned" og deretter "FASTA (komplettsekvens) "i rulle, og velg deretter" Fortsett "en .txt-fil vises,. åpne og kopiere hele filen til utklippstavlen TXT-filen inneholder sekvenser av alle ESTs med høy sekvenslikhet med musen Bcrp1 exon2. men ikke deres posisjon i forhold til ekson 2 i Bcrp1 genet.
Merk: En analyse utført på 15 april 2015 identifisert 14 murine ESTs som på linje med Bcrp1 ekson 2. Disse er listet opp i tabell 1.
- Identifisere plasseringen av EST-sekvensen som er 5 'til ekson 2 i Bcrp1 genet. Musen Bcrp1 genet er lokalisert i kromosom 6 contig NC_000072.6 (GI: 372,099,104).
- På BLAST hjemmeside under "Specialized Blast" underposisjon, velg "Align to (eller flere) sekvenser ved hjelp av BLAST (bl2seq)."
- Lim tekstfilen fra utklippstavlen i tekstboksen og skriv 372099104 i faget sekvens boksen. Optimaliser for "svært lignende sekvenser" under programmetutvalg, og kjøre BLAST.
- Når resultatene vises, se de justeringer grafisk ved å klikke på "Graphics" i "Justeringer" -vinduet. Bruk høyre og venstre pilene og zoom til å fokusere på Bcrp1 / ABCG2 og sekvenssammenstillinger.
- Redd sekvenssammenstillinger: velg "ALL" i "Beskrivelser" boksen, og deretter under "last ned" rullegardin velg "Hit tabellen (CSV)", og klikk deretter på "fortsett". Denne filen inneholder sekvensen justeringen av Bcrp1 exon 2 og justeringen av alle EST sekvenser med sekvenslikhet til Bcrp1 Exon2 forhold til nummereringen av nukleotidene i musen kromosom 6 contig. Hver fullstendig EST-sekvens kan generere flere sammenstillinger som strekker seg over områder 5 'og 3' til ekson 2 inkludert sekvensene som overlapper med Bcrp1 exon 2.
- Som posisjonen til 5'-enden av exon 2 vil tilsvare til nukleotid 58655638 i kromosomet 6 contig, utpeke denne som1, og deretter beregne posisjonen av de partielle sekvenser av hver enkelt EST 5 'til 58.655.638. Resultatene for de 14 EST er gitt i tabell 1.
Merk: Vær forsiktig med å analysere EST sekvenser som er 5 'til en (dvs. har en negativ nukleotid verdi) som potensielle første eksoner. For eksempel, i to av EST som er innrettet med Bcrp1 exon 2 som er vist i tabell 1 (AI647825 og AI664571) den gjenværende sekvens var 3 'til ekson 2.
2. Evaluering av Bcrp1 Alternative Arrangøren Funksjon
- Design av reporter konstruerer for Bcrp1 E1U, E1A, E1B og E1C arrangører
- Bruke sekvens av E1U innhentet fra å søke den EST database, utpeke den første 5 'nucleotide av E1U som en.
- Oppnå et bakterielt kunstig kromosom (BAC) klon fra mus kromosom 6 som inneholder Bcrp1 / ABCG2 gen-sekvensen og sekvensen minst 100 kb oppstrøms forBcrp1 / ABCG2 genet (se Liste over materialer og utstyr).
- Identifisere en egnet reporter vektor slik som luciferase reporter plasmid pGL3-Basic.
- Bestem flere kloningsseter i reporter vektor. Kpnl, SacI, Mlu1, Nhel, Smal, Xhol, Bglll og Hindlll er restriksjonsendonukleaseseter i det multiple kloningssetet til pGL3-Basic vektor, i 5 'til 3' orientering.
Merk: Sekvensen av fordøyelsen nettsteder er tilgjengelig fra produktkataloger i selskaper som produserer restriksjonsenzymer. - Identifisere alle fordøyelse steder i E1U ekson og 2 kb region 5 'av E1U å bruke programmer som DNA5. Identifisere minst to fordøyelsen områder i pGL3-Basic multiple kloningssete som ikke finnes i E1U eller 2 kb oppstrøms regionen.
Merk: Sørg for å velge en multiple kloningssete restriksjonssetet for den videre primer som er oppstrøms for en valgt for revers primer for å sikre at innsatsen will være i riktig retning.
- Forbered forover og bakover primere for PCR som inneholder sekvenser for de utvalgte pGL3-grunnleggende multiple kloningssete restriksjonsendonukleaseseter bruker kommersielle genet / primer syntese tjenester eller primer utvalg programvare (se Liste over materialer og utstyr). Velg en fremover primer ligger ~ 2 kb oppstrøms fra E1U sekvens og en revers primer i E1U sekvensen. Primere som brukes i forfatternes tidligere arbeid innarbeidet en SacI område i termin primer, og et NheI område i revers primer, og forsterket genomisk region fra ca -1906-64 med de første 5 'nucleotide av E1U angitt som + 1 (se trinn 2.1.1 ovenfor), og er gitt i referanse 16.
- PCR forsterke E1U genomisk region ved hjelp av disse primere, 0,01 til 1 mikrogram av BAC, og PCR Master Mix inneholder høy-fidelity Taq polymerase (se liste av materialer og utstyr) med denaturering ved95 ° C i 30 sek, og deretter 35 til 40 cykler av PCR, med forlengelse ved 72 ° C (2 min), og gløding og smeltetemperaturer basert på smelte egenskapene til primerne anvendt.
Merk: Bruken av high-fidelity Taq polymeraser er avgjørende for sekvense promoter regioner som har høy GC innhold. Ved bruk av store genomiske DNA-fragmenter som for eksempel en BAC som templat, kan den sekundære strukturen av det genomiske DNA som gjør det vanskelig for PCR-primere til å binde. Hvis dette problemet oppstår, kan bedre PCR resultater oppnås dersom det lange genomiske DNA-templatet blir skåret forsiktig ved ultralydbehandling før PCR-reaksjonen. - Bekrefte lengden av det amplifiserte PCR-produkt ved å sammenligne mot en 1 kb DNA-stige ved hjelp av 0,8% TAE-agarosegel-elektroforese.
- PCR forsterke E1U genomisk region ved hjelp av disse primere, 0,01 til 1 mikrogram av BAC, og PCR Master Mix inneholder høy-fidelity Taq polymerase (se liste av materialer og utstyr) med denaturering ved95 ° C i 30 sek, og deretter 35 til 40 cykler av PCR, med forlengelse ved 72 ° C (2 min), og gløding og smeltetemperaturer basert på smelte egenskapene til primerne anvendt.
- Fordøye PCR produkt oppnådd og den pGL3-Basic vektor ved å bruke restriksjonsendonukleaser som er spesifikt for restriksjonsfordøyelses seter innført inn i forover og bakover-primere som per instructions leveres med begrensning fordøyelse enzymer.
- Rense fordøyelses reaksjoner ved bruk av kommersielle SV Gel og PCR Clean-Up Systems kit (se Liste over materialer og utstyr), som følge av kit protokoll 21.
- Bekrefte fordøyelse og linearisering av vektoren ved å sammenligne den mot den uslipte vektoren ved hjelp av agarosegel-elektroforese, og deretter kuttet og rense det spaltede vektor-DNA-båndet. Måle konsentrasjonen av det rensede PCR produktet og renset vektor bruker UV-spektrometri (se Liste over materialer og utstyr).
- Rense fordøyelses reaksjoner ved bruk av kommersielle SV Gel og PCR Clean-Up Systems kit (se Liste over materialer og utstyr), som følge av kit protokoll 21.
- Klargjør E1U reporter konstruere ved å ligere den rensede, restriksjonsenzymet fordøyd PCR produkt og pGL3-Basic ildflue luciferase reporter vektor (som finnes i reporter analysen kit, se liste over materialer og utstyr) ved Innsats: vektor forholdstall på 11, 21 og 31, ved hjelp av "T4 DNA-ligase hurtigligeringssett" i henhold til instruksjonene i settet 22, for derved å frembringe den E1U reporter konstruere, heter pGL3-E1U.
- Bruk pGL3-E1U plasmid å transformere bakterier til clonally utvide pGL3-E1U følgende instruksjoner i TA kloning kit (se Liste over materialer og utstyr).
- Bekreft orientering og troskap av innsatsen ved sekvensanalyse.
- Forbered reporter konstruerer for E1A, E1B og E1C bruker tilsvarende metodikk som for E1U. Bekreft fidelity av innsatsene ved sekvensering som i punkt 2.1.5.2.
Merk: promoter innsatser for E1A, E1B og E1C bør være ca -1875 / + 10, -1847 / + 60, og -1904 / + 83 i forhold til den første 5 'nucleotide (utpekt som ett) av E1A, E1B, eller E1C hhv.
- Reporter analysemetoder
Merk: Generell strategi av rapportør assays: den antatte promoter (5 'oppstrøms region) av et gen som er innført i det multiple kloningssete av en tom "reporter" vektor som inneholder en "reporter gen "(som ildflue luciferase) nedstrøms fra det multiple kloningssete. Vektoren blir deretter transfektert inn i eukaryote celler som uttrykker genet av interesse. De trans-virkende faktorer som fremmer ekspresjon av genet av interesse i disse cellene bør aktivere -promoteren i vektoren transfektert reporter, forårsaker ekspresjon av ildflueluciferase, som lett kan kvantifiseres med en luminescens analyse.- Velg riktig cellelinje som skal brukes til reporteren analysen.
Merk: For å evaluere aktiviteten av E1U alternative promoteren reporter konstruksjon, er det nødvendig å transfektere at konstruere inn i celler som uttrykker Bcrp1 under styring av E1U promoteren. Den TM4 murine Sertoli cellelinje (se liste over materialer og utstyr) uttrykker Bcrp1 protein og Bcrp1 mRNA inneholder E1U, samt E1A, E1B, og E1C 5. Som en negativ kontroll, vurdere å bruke en cellelinje som ikke uttrykker Bcrp1 protein eller mRNA. - Kultur TM4 cells i 24-brønners plater ved en initial densitet på 200.000 celler / brønn i en 1: 1 blanding av Hams F12-medium og Dulbeccos modifiserte Eagles medium med 1,2 g / l natriumbikarbonat, 15 mM HEPES supplementert med 5% hesteserum, 2,5% føtalt bovint serum, penicillin (100 IU / ml) og streptomycin (100 ug / ml), ved 37 ° C, 5% CO2, som beskrevet tidligere 5.
- Seks timer etter å plassere cellene i kultur, transfektere cellene med 0,2 mikrogram tom pGL3-basisvektoren eller med 0,2 mikrogram pGL3 vektor som inneholder -1906 / + 64 E1U eller -1875 / + 10 E1A eller -1847 / + 60 E1B eller -1904 / + 83 E1C BCRP en sletting konstruere sammen med 4 ng av PRL-TK (en Renilla luciferase-uttrykke vektor) som intern kontroll, ved hjelp av et kommersielt DNA transfeksjon kit og produsentens protokoll 23 (se Liste over materialer og utstyr) .
- 30 timer etter transfeksjon, fjerner vekstmedier fra cultured transfekterte celler. Vask cellene gang med 200 mL PBS, og deretter fjerne vaskeløsning.
- Mål ildflue og Renilla luciferase aktivitet ved hjelp av et kommersielt kit i henhold til produsentens protokoller 24.
- Uttrykke aktiviteten for hvert rør som forholdet mellom den ildflue luciferase-aktivitet dividert med det indre (Renilla luciferase) kontroll; samlede resultater blir vanligvis uttrykt som aktivitet av hver reporter konstruksjon i forhold til den for celler transfektert med den tomme pGL3 basisvektoren, som er gitt en verdi på en.
- Velg riktig cellelinje som skal brukes til reporteren analysen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Identifisering av BCRP en alternativ arrangøren utnyttelse i mus testikkel ved analyse av leder eksoner
Når EST-databasen ved NCBI ble probet (april 2015) ved bruk av trinnene som skissert i protokoll 1, de ESTs funnet at var sammenhengende med 5'-enden av exon 2 i BCRP 1 mRNA er vist i tabell 1, sammen med deres posisjon i genomisk DNA i forhold til starten av exon 2. en EST avledet fra C57BL / 6J mus testis som er sammenhengende til ekson 2 i BCRP en mRNA har sekvenser i genomisk DNA 70 kb oppstrøms fra exon 2, tilsvarende E1U (tabell 1). Tilsvarende ble ESTs tilsvarer E1A, E1B, og E1C oppdaget. Av notatet er at de to ESTs tilsvarer E1C også inneholdt E1B skjøtes til 5 'enden av E1C. Plasseringen av disse spådd første eksoner iforhold til Bcrp1 exon 2 på mus kromosom 6 er vist i figur 1.
Evaluering av BCRP en alternativ arrangøren funksjon
Typiske luciferase-analyseresultatene som tilsvarer E1U, E1A, blir E1B og E1C promotor-luciferase-rapportør konstruksjonene transfektert inn i TM4 murine Sertoli-celler (se avsnitt 2.2) som er vist i figur 2A.
I tidligere arbeid, ble et SF-1-responselement anslått til å være i den E1U promotoren 5. Hvis denne formodede SF-en responselement er involvert i reguleringen av Bcrp1 transkripsjon i mus testikler, vil da mutasjon (som beskrevet i et tidligere papir 5) i nevnte responselement i E1U promoteren reporter-konstruksjonen reduserer luciferaseaktiviteten produsert av at konstruksjonen når transfektert inn iTM4 celler. Resultater fra et typisk forsøk er vist i figur 2B. Den muterte Konstruksjonen viser lavere luciferase-aktivitet enn den ikke-muterte konstruksjon, med aktivitet sammenlignbar med den til den tomme pGL3-basisvektor, selv i celler med tvungen ekspresjon av SF-1 (beskrevet i et tidligere papir 5). Tvangs ekspresjon av SF-1 øker aktiviteten av den ikke-muterte konstruksjon, men ikke den for den muterte en.
Figur 1. Diagram av genomisk justering av ESTs med sekvensidentitet Bcrp1 exon 2 med muse-kromosom 6. Disse justeringer ble identifisert i en dbEST BLAST søk utført i april, ble 2015. Fire forskjellige justeringer funnet, tilsvarende Bcrp1 alternative første eksoner E1U, E1A, E1B, og E1C. Dette tallet er gjengitt fra en tidligere publikasjon 5. 
Figur 2. (A) Reporter assay for Bcrp1 promotere E1U, E1A, E1B, og E1C i BALB / c Sertoli-celle-stammer TM4 celler. Data er uttrykt som den luminescens av ildflueluciferase normalisert til den av Renilla luciferase, ved anvendelse av metoder som er beskrevet i avsnitt 2. De viste data er middelverdien og standardavvik for tre forskjellige forsøk, utført på forskjellige dager. Stjernen indikerer en signifikant forskjell fra den tomme pGL3 vektor kontroll ved hjelp av t-test (P <0,01). Dette tallet er gjengitt fra en tidligere publikasjon 5. (B) Effekter av mutasjon av SF-en respons element i Bcrp1 E1U reporter bygge på luciferase aktivitet. Bcrp1 reporter konstruerer med den antatte SF-en bindende region (mutert eller un-mutert) ble transfektert inn TM4 celler med (SF-1 transfektert) og uten (vektor transfektert) håndheves uttrykk for SF-1. De data som vises er gjennomsnittet av 3 forskjellige forsøk utført på forskjellige dager; de feilfelt representerer standardavvik. For hvert forsøk ble de enkelte analyser ble gjort i duplikat. I figuren (A) angir en signifikant forskjell fra den tomme vektoren pGL3 kontroll (P <0,05) ved anvendelse av t-test, (B) betyr en statistisk signifikant forskjell sammenlignet med den E1U promoteren konstruksjonen ved hjelp av t-test (P < 0,05). Dette tallet er gjengitt fra en tidligere publikasjon fem. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Tabell 1. Blast søk på musen EST databasen mot sekvensen til andre exon av Bcrp1 25 -28. Klikk her for å se en større versjon av denne tabellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De fleste av metodene og representative resultater som er presentert, er beskrevet i tidligere arbeid med tittelen "B crp1 transkripsjon i mus testikkel styres av en promoter oppstrøms for en ny første ekson (E1U) regulert av steroidogenic faktor-1", som ble publisert i 2013 5 . i tillegg til de representative resultater avbildet her, det forrige papiret gitt estimater for alternative første ekson utnyttelse hjelp 5'-RACE PCR og RT-PCR metodikk. Videre er det i-silico identifikasjon av en antatt SF-1-responselement i promoteren oppstrøms fra E1U ble oppnådd, og kromatin immunutfelling (chip) analyser viste at SF-1 bundet til den antatte SF-1-responselement. Funksjonelle studier viste at i murine Sertoli-celler, er BCRP-1 transkripsjon kontrollert av SF-1 via SF-en responselement i E1U promoteren. Disse funksjonelle studier inkludert oppregulering av SF-1 i TM4 celler ved transfection eller ved bruk av en histondeacetylase-inhibitor (vorinostat), noe som resulterte i økt ekspresjon av BCRP en E1U mRNA, og en økning i BCRP en protein såvel som aktiviteten av BCRP en E1U promoter i en reporter assay. Til slutt, disse studiene gitt bevis for at i testiklene fra voksen Sertoli-cellespesifikke SF-1 knockout mus, uttrykk for BCRP en E1U mRNA, total BCRP en mRNA, og Bcrp1 protein ble markert redusert fem. Det samme arbeidet også rapportert ekspresjons mønstre av Bcrp1 mRNA-isoformer i en rekke murine vev, inkludert nyre, lever, testikler, hjerne, hjerte, lunge, muskel og milt 5.
Protokollene er beskrevet her - bruk av vev-spesifikk regulering av BCRP en som modell - gir en lettvinte eksperimentell rammeverk for å løse transkripsjons kompleksiteten av noen genet for å bestemme dens differensialekspresjon i forskjellige vev eller cellulære subtyper. Det må understrekes at resultatene som oppnås fra protokoll trinnene beskrevet for i-silico evalueringer kan være tidsavhengig ettersom de ulike nettsteder som huset programvare og databaser som brukes kan endres. Den in-silico metodikken som presenteres her benytter søke på EST database (dbEST) som rapportert tidligere 29, som anslått at ca 18% av alle menneskelige gener i EST datasettet ansette alternative arrangører. Søke på dbEST kan undervurdere alternative første eksoner, fordi andre forskere - ved hjelp av en "oligo-capping" metode for å produsere 1,8 millioner 5'-end sekvenser av cDNA fra mange menneskelige vev - var i stand til å identifisere mulige transkripsjonsstartsider for menneskelige gener og anslag at 52% av de menneskelige RefSeq gener studert ble muligens regulert av alternative arrangører 1. Interessant, sistnevnte studie fant atvev som benyttes mulige alternative arrangører mest var testis og hjernen; Videre fant de at gener som koder for proteiner som er relatert til signaltransduksjonsbaner som var mer sannsynlig å anvende vevsspesifikke alternative promotorer 1. Til tross for de nevnte ulemper, analyser dbEST tilveiebringe en grov oversikt over 5 'UTR bruk for et spesielt gen i flere vev med minimal anstrengelse.
Selv dbEST analysen gir en lettvinte innblikk i alternative første exon bruk, anbefaler vi å utføre 5 'rask forsterkning av cDNA endene (5'-RACE) analyse for å bekrefte første exon bruk i et vev eller cellelinje under etterforskning. Kommersielle Pakkene er tilgjengelig for 5'-RACE, med detaljerte og enkle prosedyrer gitt av produsenten (se Liste over materialer og utstyr). Selv om noe tidkrevende, 5'-RACE-studiene gir virkelige beregninger av nærvær, så vel som sekvensen av alternative første exons i mRNA av interesse; Videre kan tilstedeværelsen av flere transkripsjonelle startsider også detekteres 13. For å sikre tilstrekkelig representasjon, er sekvensering av minst 15 til 25 kloner nødvendig. Før sekvensering, er det viktig å fjerne kontaminerende vektorsekvenser fra 5 'RACE produkter. Hvis dette ikke gjøres, kan BLAST analyse klarer helt å påvise en sekvens innretting med musen genomet. Når første ekson bruk er etablert, kan den 5'-RACE funn kan brukes til å validere følgende kvantitative RT-PCR-analyser for alternative først eksoner. Generelt forfatternes tidligere arbeid funnet at det er god korrelasjon mellom prosent av første ekson mRNA kloner utvinnes av 5'RACE og prosentandelen av PCR-produktet utvunnet i en gitt alternativ første exon fra samme vev eller cellelinje 5. I tillegg ble god korrelasjon funnet mellom aktivitetene til luciferase promoter konstruksjoner for alternative Bcrp1 arrangører ennd ekspresjon av det tilsvarende alternative første exon i en bestemt cellelinje 5.
I jakten på vev-spesifikk alternativ promoter bruk, hvis hele organer blir brukt, må man være klar over at de alternative arrangører / første eksoner funnet vil gjenspeile vev heterogenitet av orgelet som kjertel elementer, blodårer, stroma, etc. For eksempel, er det testiklene en blanding av somatiske (Leydig, Sertoli, myoid, og endotel-celler) og germinal (haploide celler), så vel som vaskulatur. For å undersøke for vev-spesifikk ekspresjon første ekson, vil det være nødvendig å isolere bestemte vev fra organene.
Andre metoder er blitt rapportert for å identifisere alternative promoter bruk og regulering; Men dette krever neste generasjons sekvensering og bioinformatikk databehandling i stand til å analysere den store mengden av data produsert. Disse metodene omfatter hele transcriptosome sekvensering (RNA seq), og chip-seq avhistoner som H3K4me3, som binder seg fortrinnsvis til arrangører 30. Selv om disse metodene kan være dyrt å utføre de-novo, når fokuset er på uttrykk for noen spesifikke gener og vev, kan utvinning av eksisterende data være en mer praktisk tilnærming.
Analysene for å anslå promoteraktivitet som presenteres her anvende pGL3-basisvektor, som inneholder et multippelt klonings region oppstrøms fra ildflue luciferase-genet. Promoter-aktivitet blir målt ved produksjonen av ildflueluciferase, som er lett kvantifiseres etter tilsetning av kofaktorer og et luminescerende substrat, ved måling av luminescens i et kommersielt luminometer (se liste av materialer og utstyr). Den beslektede pGL4 Vektoren kan bringes til å inneholde seleksjonsmarkører (f.eks, neomycin, hygromycin, puromycin), muliggjør fremstilling av stabilt transfekterte celler. Protokollene som er gitt i denne rapporten benytter transient transfeksjon. Vanligvis reporter analyser for kaer aktivitet er gjort ved hjelp kotransfeksjonen med en vektor som konstitutivt uttrykker Renilla (Sea Pansy) luciferase (PRL-TK), for å kontrollere for variasjoner i celle nummer og effektiviteten av transfeksjon. Et kritisk trinn i å etablere en promoter assay for et gitt gen er for å være sikker på at genet av interesse er uttrykt i den cellelinje som er transfektert med reporteren konstruksjonen. For det andre, da alternative promotor bruk er til stede, er det viktig å bruke promoteren konstruksjon som tilsvarer den alternative første ekson uttrykt i cellelinjen transfektert. For eksempel ikke forvente å se luminescens for E1U arrangøren konstruksjon som er transfektert inn i celler som uttrykker Bcrp1 utelukkende under kontroll av E1B promoter. Alternativt, som en negativ kontroll, transfeksjon av reporter bygge inn i en cellelinje som ikke uttrykker genet eller mRNA isoform av interesse, bør resultere i ingen produksjon av ildflueluciferase.
den consequences av alternative promotor bruk omfatter produksjon av det samme protein, produksjon av proteiner med forskjellige N-termini, eller produksjon av forskjellige proteiner 29. I tilfelle av Bcrp1 / BCRP, flere (vevs- eller celletype-spesifikk) promotorer styre produksjonen av det samme proteinet. Et lignende mønster finnes for CYP19 (aromatase) gen 29, 31. Protokollene som presenteres her gir de grunnleggende trinnene man kan bruke for å dechiffrere i et vev eller cellelinje de komplekse mekanismer for transkripsjonen kontroll av et protein av interesse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Douglas D. Ross og University of Maryland, Baltimore holde patentrettigheter til human BCRP.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Merit anmeldelse Awards til Douglas D. Ross og til Arif Hussain fra Department of Veterans 'Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 | |
References
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al. A multidrug resistance transporter from human MCF-7 breast cancer cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15665-15670 (1998).
- Natarajan, K., Xie, Y., Baer, M. R., Ross, D. D. Role of breast cancer resistance protein (BCRP/ABCG2) in cancer drug resistance. Biochem Pharmacol. 83 (8), 1084-1103 (2012).
- Qian, X., Cheng, Y. H., Mruk, D. D., Cheng, C. Y. Breast cancer resistance protein (Bcrp) and the testis--an unexpected turn of events. Asian J Androl. 15 (4), 455-460 (2013).
- Xie, Y., et al. Bcrp1 transcription in mouse testis is controlled by a promoter upstream of a novel first exon (E1U) regulated by steroidogenic factor-1. Biochim Biophys Acta. 1829 (12), 1288-1299 (2013).
- Maliepaard, M., et al. Subcellular localization and distribution of the breast cancer resistance protein transporter in normal human tissues. Cancer Res. 61 (8), 3458-3464 (2001).
- Fetsch, P. A., et al. Localization of the ABCG2 mitoxantrone resistance-associated protein in normal tissues. Cancer Lett. 235 (1), 84-92 (2006).
- Cooray, H. C., Blackmore, C. G., Maskell, L., Barrand, M. A. Localisation of breast cancer resistance protein in microvessel endothelium of human brain. Neuroreport. 13 (16), 2059-2063 (2002).
- Kolwankar, D., Glover, D. D., Ware, J. A., Tracy, T. S. Expression and function of ABCB1 and ABCG2 in human placental tissue. Drug Metab Dispos. 33 (4), 524-529 (2005).
- Xiong, H., et al. ABCG2 is upregulated in Alzheimer's brain with cerebral amyloid angiopathy and may act as a gatekeeper at the blood-brain barrier for Abeta(1-40) peptides. J Neurosci. 29 (1-40), 5463-5475 (2009).
- Woodward, O. M., et al. Identification of a urate transporter, ABCG2, with a common functional polymorphism causing gout. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (25), 10338-10342 (2009).
- Huls, M., et al. The breast cancer resistance protein transporter ABCG2 is expressed in the human kidney proximal tubule apical membrane. Kidney Int. 73 (2), 220-225 (2008).
- Nakanishi, T., et al. Novel 5' untranslated region variants of BCRP mRNA are differentially expressed in drug-selected cancer cells and in normal human tissues: implications for drug resistance, tissue-specific expression, and alternative promoter usage. Cancer Res. 66 (10), 5007-5011 (2006).
- Ayoubi, T. A., Van De Ven, W. J. Regulation of gene expression by alternative promoters. FASEB J. 10 (4), 453-460 (1996).
- Zong, Y., Zhou, S., Fatima, S., Sorrentino, B. P. Expression of mouse Abcg2 mRNA during hematopoiesis is regulated by alternative use of multiple leader exons and promoters. J Biol Chem. 281 (40), 29625-29632 (2006).
- Natarajan, K., et al. Identification and characterization of the major alternative promoter regulating Bcrp1/Abcg2 expression in the mouse intestine. Biochim Biophys Acta. 1809 (7), 295-305 (2011).
- Ensembl Genome Browser. , http://Ensembl.org (2015).
- Transcript-based Display from Ensembl. , http://www.ensembl.org/Mus_musculus/Transcript/Exons?db=core;g=ENSMUSG00000029802;r=6:58584523-58692869;t=ENSMUST00000031822 (2015).
- Basic Logical Alignment Search Tool (BLAST) homepage. , http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD=Web&PAGE_TYPE=BlastHome (2015).
- National Center for Biotechnology Information (NCBI). , http://www.ncbi.nlm.nih.gov (2015).
- Promega. Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System - INSTRUCTIONS FOR USE OF PRODUCT. , (2009).
- New_England_Biolabs. Quick Ligation Kit Protocol - M2200S. , (2014).
- Roche. XtremeGENE HP DNA Transfection Reagent Protocol - Manual version 1.0). , (2010).
- Promega. Quick Protocol for the use of the Dual-Luciferase Reporter Assay. , (2009).
- Carninci, P., et al. The transcriptional landscape of the mammalian genome. Science. 309 (5740), 1559-1563 (2005).
- VanBuren, V., et al. Assembly, verification, and initial annotation of the NIA mouse 7.4K cDNA clone set. Genome Res. 12 (12), 1999-2003 (2002).
- Bonaldo, M. F., Lennon, G., Soares, M. B. Normalization and subtraction: two approaches to facilitate gene discovery. Genome Res. 6 (9), 791-806 (1996).
- Okazaki, Y., et al. Analysis of the mouse transcriptome based on functional annotation of 60,770 full-length cDNAs. Nature. 420 (6915), 563-573 (2002).
- Landry, J. R., Mager, D. L., Wilhelm, B. T. Complex controls: the role of alternative promoters in mammalian genomes. Trends Genet. (11), 640-648 (2009).
- Park, P. J. ChIP-seq: advantages and challenges of a maturing technology. Nat Rev Genet. 10 (10), 669-680 (2009).
- Bulun, S. E., et al. Regulation of aromatase expression in breast cancer tissue. Ann N Y Acad Sci. 1155, 121-131 (2009).
