Summary
Con il murino ABC trasportatore Bcrp1 (ABCG2), come esempio, in-silico protocolli sono presentati per rilevare utilizzo promotore alternativo geni espressi in tessuti di topo, e per valutare la funzionalità dei promotori alternativi identificati mediante saggi del reporter.
Abstract
L'espressione genica in diversi tessuti è spesso controllata da promotori alternativi che risultano nella sintesi di mRNA con uniche - di solito non tradotte - primi esoni. Bcrp1 (ABCG2), il ortologo murino della ABC trasportatore Breast Cancer Resistenza Protein (BCRP, ABCG2), ha almeno quattro promotori alternativi che sono designati dai corrispondenti quattro primi esoni alternativi prodotte: E1U, E1A, E1B, e E1C. Qui, in-silico protocolli vengono presentati per prevedere l'utilizzo promotore alternativa per Bcrp1. Inoltre, metodi di analisi giornalista sono descritti per produrre costrutti reporter per promotori alternativi e per determinare la funzionalità dei promotori putativi monte dei primi esoni alternativi identificati.
Introduction
Più della metà dei geni umani sono regolati dai promotori alternativi 1. Ogni promotore alternativa può contenere elementi regolatori che possono essere diverse da quelle degli altri promotori alternativi. Il promotore (s) utilizzato in un tessuto può differire da quelli utilizzati in un altro tessuto. Ad esempio, è possibile che l'attivazione di un dato percorso di segnalazione può attivare il promotore alternativa a un gene utilizzata in un tessuto, ma non hanno alcun effetto o reprimere un promotore alternativa separato per lo stesso gene che viene utilizzata in un altro tessuto.
L'espressione del gene Bcrp1 è governato da promotori alternativi. Bcrp1 è il ortologo murino del gene materno Resistenza Cancer Protein (BCRP). BCRP è un trasportatore di ATP-binding cassette (ABC), ABCG2 2, 3 formalmente designato. Come una proteina di membrana apicale, BCRP funzioni / Bcrp1 di efflusso una vasta gamma di substrati naturali e xenobiotici
Nel lavoro presto per capire la regolazione dell'espressione BCRP in cellule normali e neoplastiche, 5 'rapida amplificazione del cDNA estremità (5'-RACE) analisi di BCRP mRNA è stata eseguita per determinare il suo sito di inizio della trascrizione esatta 13. Non solo erano più siti di inizio della trascrizione trovati; anche incontrato erano tre forme alternative di primo esone, che a sua BCRP è tradotto. Queste alternative primi esoni - designati E1a, E1b, E1c - sono stati espressi in modo diverso in una varietà di tessuti umani. Due ulteriori varianti primo esone sono stati scoperti in una ricerca BLAST del database EST umana utilizzando il secondo esone del BCRP 13. Quattro partite rivelato un primo esone> 70 kb a monte dell'esone 2 che sono stati designati E1U; altre quattro partite hanno rivelato BCRP mRNA che mancava di un primo esone del tutto, che sono stati designati E1 13. La presenza di esoni capo alternativi è considerato una manifestazione di utilizzo promotore alternativa 14.
Nei topi, quattro alternative primi esoni di Bcrp1 sono descritte che può corrispondere ai promotori alternativi che governano BCRP 1 trascrizione in diversi tessuti di topo; questi esoni / promotori sono designati E1U, E1A, E1B e E1C, e si trovano a circa 70, 58, 15, e 5 kb a monte Bcrp1 esone 2 5, 15. L'isoforma E1A mRNA è risultata predominante in MurinLe cellule staminali ematopoietiche e, cuore, polmone, milza e cervello, mentre l'isoforma E1B è stata espressa in nell'intestino del mouse, le cellule del fegato fetale, e precursori eritroidi nel midollo osseo 5, 15. Il promotore a monte E1B ha dimostrato di essere il principale promotore di alternativa di governo Bcrp1 trascrizione nell'intestino del mouse, regolato almeno in parte, da fosfo-ciclico-AMP risposta elemento binding protein (p-CREB) e un elemento di risposta CREB unico per quella alternativa promotore Bcrp1 16. L'isoforma E1C mRNA è prevalentemente espresso nel fegato murino adulti e reni 5. L'isoforma E1U è rilevabile nella maggior parte dei tessuti esaminati eccetto testicolo murino, dove è l'isoforma predominante espresso 5. Bcrp1 espresso in testicoli di ratto si trova in entrambe le somatiche (giunzioni strette endoteliali, cellule myoid peritubulari, e cellule di Sertoli) e le cellule germinali (nel endotelio seminifero, dove si può proteggere spermatidi fase tardo-4). il region monte E1U contiene un elemento di risposta funzionale per steroidea factor-1 (SF-1) 5. Bcrp1 mRNA e di proteine sono marcatamente ridotti nei testicoli di topi knockout Sertoli cellule specifiche SF-1, suggerendo che l'espressione Bcrp1 in cellule di Sertoli murine è controllato da SF-1 5.
I protocolli presentati metodi dettaglio per rilevare alternative primi esoni del Bcrp1 in-silico, e di stabilire saggi luciferasi-based per i promotori putativi monte dalle prime esoni alternativi individuati.
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Protocol
1. previsione in silico della alternativi primi esoni del Bcrp1 Usando BLAST Analisi del mouse EST database
Nota: Questo protocollo viene descritto come cercare il tag del mouse sequenza espressa (EST) del database per EST con similarità di sequenza di esone 2 di Bcrp1 (che contiene il sito di inizio traslazionale) e poi come allineare le corrispondenti sequenze EST di sequenze genomiche per accertare il loro posizione nel topo Bcrp1 gene rispetto alla estremità 5 'di Bcrp1 dell'esone 2.
- Ottenere la sequenza per il mouse Bcrp1 esone 2 inserendo l'ID sequenza di riferimento di mRNA (NM_011920.3) nella finestra di ricerca del Ensembl Genome Browser 17, cliccare su "GO". Nella schermata successiva, selezionare una sequenza full-length (contiene 16 esoni):
- Nella schermata successiva ( "Trascrizione a base Display"), selezionare "16 esoni." Verrà visualizzata una schermata che contiene la sequenza di tutti gli esoni di Bcrp1. Exon 2 di Bcrp1 leggerà "59; -AAAGGC ... TATCAA-3 ' "I risultati ottenuti saranno simili a quelli mostrati in riferimento 18..
- Fare clic sull'opzione "Download sequenza". Nella schermata successiva, scegliere il formato FASTA, e quindi fare clic su "Anteprima". Nella schermata successiva, copiare la sequenza Anteprima dell'esone 2 negli appunti.
- Passare alla home page BLAST 19 sul National Center for Biotechnology Information (NCBI) sito web 20.
- Selezionare genoma "Mouse". Incollare la sequenza dell'esone 2 dagli appunti nella casella di ricerca.
- Seleziona "EST" dal menu a discesa del database, ottimizzare per "sequenze altamente simili," e quindi scegliere "BLAST". Durata richiederà alcuni minuti. Quando la corsa BLAST è completo, verrà visualizzata la pagina "Risultati".
- Sotto la voce "Descrizione" della pagina "Risultati", selezionare "ALL", quindi "Download", quindi "FASTA (completosequenza) "nel menu a discesa, e poi scegliere" Continua "Apparirà un file txt,. aprire e copiare l'intero file negli appunti Il file txt contiene le sequenze di tutte le EST ad alta sequenza somiglianza con il exon2 del mouse Bcrp1. ma non la loro posizione rispetto al esone 2 del gene Bcrp1.
Nota: L'analisi eseguita su 15 aprile 2015 ha individuato 14 EST murini che allineata con Bcrp1 esone 2. Questi sono elencati nella tabella 1.
- Identificare la posizione della sequenza EST che è 5 'to esone 2 del gene Bcrp1. Il gene del mouse Bcrp1 si trova nel cromosoma 6 contig NC_000072.6 (GI: 372.099.104).
- Sulla homepage BLAST sotto il sottotitolo "Blast Specialized", selezionare "Allinea due (o più) sequenze utilizzando BLAST (bl2seq)."
- Incollare il file di testo dagli appunti nella casella di ricerca e digitare 372099104 nella casella sequenza di soggetto. Ottimizza per "sequenze altamente simili" nell'ambito del programmaselezione e BLAST eseguire.
- Una volta visualizzata la finestra dei risultati, visualizzare gli allineamenti graficamente cliccando su "Grafica" nella finestra "allineamenti". Utilizzare le frecce destra e sinistra e zoom per concentrarsi su Bcrp1 / ABCG2 e gli allineamenti di sequenze.
- Salvare gli allineamenti di sequenza: selezionare "ALL" nella casella "Descrizione", poi sotto il "download" a discesa selezionare "Hit tabella (CSV)," e quindi fare clic su "continua". Questo file contiene l'allineamento di sequenze di Bcrp1 esone 2 e l'allineamento di tutte le sequenze EST con similarità di sequenza a Bcrp1 exon2 relative alla numerazione dei nucleotidi nel topo cromosoma 6 contig. Ogni sequenza completa EST potrebbe generare più allineamenti che abbracciano le regioni 5 'e 3' to esone 2 comprese le sequenze che si sovrappongono con Bcrp1 esone 2.
- Poiché la posizione di estremità 5 'dell'esone 2 corrisponderà al nucleotide 58.655.638 nel cromosoma 6 contig, designare questo come+1, Quindi calcolare la posizione delle sequenze parziali di ciascun EST 5 'a 58.655.638. I risultati per le 14 EST sono riportati nella tabella 1.
Nota: Fare attenzione ad analizzare le sequenze EST che sono 5 'a +1 (ad esempio, avere un valore negativo nucleotide) come potenziali primi esoni. Ad esempio, in due delle EST che allineati con Bcrp1 esone 2 mostrato nella Tabella 1 (AI647825 e AI664571) la sequenza rimanente era 3 'to esone 2.
Funzione 2. Valutazione di Bcrp1 Alternative Promotore
- Progettazione di giornalista costrutti per Bcrp1 E1U, E1A, E1B e promotori E1C
- Utilizzando la sequenza di E1U ottenuto dalla ricerca nel database EST, designare i primi 5 'nucleotide di E1U come +1.
- Ottenere un cromosoma artificiale batterico (BAC) clone di topo cromosoma 6 che contiene la sequenza genica Bcrp1 / ABCG2 e la sequenza di almeno 100 kb a monte dellaBcrp1 / ABCG2 gene (vedi elenco dei materiali e attrezzature).
- Identificare un adatto vettore giornalista come la luciferasi giornalista plasmide pGL3-base.
- Determinare i polylinker nel vettore giornalista. KpnI, Saci Mlu1, NheI, Smal, XhoI, BglII e HindIII sono i siti di restrizione endonucleasi nel sito di clonazione multiplo del vettore pGL3-base, nel 5 'a 3' orientamento.
Nota: La sequenza dei siti di digestione è disponibile da cataloghi di prodotti di aziende che producono gli enzimi di restrizione. - Identificare tutti i siti di digestione della esone E1U e la regione 2 kb 5 'di E1U utilizzando programmi software come DNA5. Individuare almeno due siti di digestione nel polylinker pGL3-base che non si trovano in E1U o la regione a monte 2 kb.
Nota: assicurarsi di scegliere un sito di restrizione polylinker per il primer in avanti che sta a monte di quello scelto per il primer inverso per assicurare che il wil insertol è nella corretta posizione.
- Preparare in avanti e primer per PCR che contengono sequenze per i siti multipli di restrizione sito di clonazione endonucleasi PGL3-base selezionati che utilizzano i servizi di sintesi del gene / primer commerciali o software selezione di primer (vedi elenco dei materiali e attrezzature) retromarcia. Selezionare un primer in avanti trova ~ 2 kb a monte della sequenza di E1U e un primer inverso all'interno della sequenza E1U. I primers utilizzati nei autori lavoro precedente incorporati un sito SacI nel primer forward, e un sito NheI nel primer reverse, e amplificate la regione genomica da circa -1.906 al +64 con il primo 5 'nucleotide di E1U specificato come + 1 (vedi al punto 2.1.1), e sono fornite in riferimento 16.
- PCR amplifica la regione genomica E1U l'utilizzo di questi fondi, 0,01-1 mg del BAC, e la PCR master mix contenente Taq polimerasi ad alta fedeltà (vedi elenco di materiali e attrezzature) con denaturazione a95 ° C per 30 sec, quindi 35 a 40 cicli di PCR, con estensione a 72 ° C (2 minuti), e ricottura e temperature di fusione in base alle caratteristiche di fusione dei primer utilizzati.
Nota: L'uso di alta fedeltà Taq polimerasi è essenziale per le regioni promotrici sequenziamento che hanno un elevato contenuto di GC. Quando si utilizzano grandi frammenti di DNA genomico, come un tasso alcolemico come modello, la struttura secondaria del DNA genomico può rendere difficile per primer PCR per legare. Se questo problema si pone, migliori risultati PCR possono essere ottenuti se il modello DNA genomico lungo viene tagliata delicatamente per sonicazione prima della reazione di PCR. - Rilevare la lunghezza del prodotto di PCR amplificato confrontando contro una scaletta DNA 1 kb usando 0,8% TAE gel di agarosio.
- PCR amplifica la regione genomica E1U l'utilizzo di questi fondi, 0,01-1 mg del BAC, e la PCR master mix contenente Taq polimerasi ad alta fedeltà (vedi elenco di materiali e attrezzature) con denaturazione a95 ° C per 30 sec, quindi 35 a 40 cicli di PCR, con estensione a 72 ° C (2 minuti), e ricottura e temperature di fusione in base alle caratteristiche di fusione dei primer utilizzati.
- Digerire il prodotto PCR ottenuto e il vettore pGL3-Basic, utilizzando l'endonucleasi di restrizione specifica per i siti di digestione di restrizione introdotte nel primer avanti e indietro secondo instructions forniti con gli enzimi di restrizione digestione.
- Purificare le reazioni di digestione mediante gel SV commerciale e kit per la PCR Clean-Up Systems (vedi Lista dei Materiali e attrezzature), seguendo il protocollo kit di 21.
- Verifica digestione e linearizzazione del vettore confrontando il vettore uncut usando elettroforesi su gel di agarosio, quindi tagliare e purificare il DNA band vettore digerito. Misurare la concentrazione del prodotto purificato PCR e il vettore purificato mediante spettrometria UV (vedi elenco dei materiali e attrezzature).
- Purificare le reazioni di digestione mediante gel SV commerciale e kit per la PCR Clean-Up Systems (vedi Lista dei Materiali e attrezzature), seguendo il protocollo kit di 21.
- Preparare il giornalista costrutto E1U legando il purificato, enzima di restrizione digerito prodotto di PCR e pGL3-Basic lucciola luciferasi giornalista vettore (contenuta nel kit di analisi giornalista, vedere elenco dei materiali e macchinari) a inserto: rapporti di vettore di 11, 21 e 31, utilizzando il "T4 DNA ligasi kit legatura rapida" come da istruzioni del kit 22, producendo in tal modo la E1U reporter costrutto, chiamato pGL3-E1U.
- Utilizzare il plasmide pGL3-E1U per trasformare i batteri per espandere clonale pGL3-E1U seguenti istruzioni nel kit di clonazione TA (vedi elenco dei materiali e attrezzature).
- Conferma l'orientamento e la fedeltà dell'inserto mediante analisi di sequenza.
- Preparare giornalista costrutti per E1A, E1B e E1C utilizzando la metodologia simile a quella per E1U. Confermare la fedeltà degli inserti di sequenziamento come nella sezione 2.1.5.2.
Nota: Gli inserti promotore per E1A, E1B e E1C dovrebbe essere di circa -1875 / + 10, -1847 / + 60, e -1904 / + 83 rispetto al primo 5 'nucleotide (designato come +1) di E1A, E1B, o E1C rispettivamente.
- Metodi di analisi Reporter
Nota: Strategia generale di saggi Reporter: il promotore putativo (5 'upstream regione) di un gene viene inserito nel sito di clonazione multiplo di un vettore vuoto "reporter" che contiene un "reporter gene "(ad esempio, lucciola luciferasi) a valle del sito di clonaggio multiplo. Il vettore viene poi trasfettato in cellule eucariotiche che esprimono il gene di interesse. I fattori trans-acting che promuovono l'espressione del gene di interesse in queste cellule deve attivare la promotore nel vettore giornalista transfettate, causando espressione di luciferasi di lucciola, che può essere facilmente quantificato con un saggio luminescenza.- Selezionare la linea cellulare appropriata da utilizzare per il saggio giornalista.
Nota: Per valutare l'attività del promotore E1U alternativa giornalista costrutto, è necessario trasfezione che costruiscono in cellule che esprimono Bcrp1 sotto il controllo del promotore E1U. La linea cellulare murina Sertoli TM4 (vedi elenco dei materiali e macchinari) esprime la proteina Bcrp1 e Bcrp1 mRNA contenente E1U, così come E1A, E1B, e E1C 5. Come controllo negativo, considerare l'utilizzo di una linea cellulare che non esprime la proteina Bcrp1 o mRNA. - Cultura ce TM4lls in piastre da 24 pozzetti ad una densità iniziale di 200.000 cellule / pozzetto in una miscela 1: 1 di mezzo F12 di Ham modificandoli mezzo di Dulbecco Eagle con bicarbonato di sodio 1,2 g / L, 15 mM HEPES integrato con 5% siero di cavallo, 2,5% siero fetale bovino, penicillina (100 UI / ml), e streptomicina (100 ug / ml), a 37 ° C, 5% CO 2, come descritto in precedenza 5.
- Sei ore dopo aver piazzato le cellule in coltura, trasfezione le cellule con 0,2 mcg di vettore vuoto pGL3-base o con 0,2 mg di pGL3 vettore contenente il E1U -1906 / + 64 o -1875 / + 10 E1A o -1847 / + 60 E1B o -1904 / + 83 E1C BCRP 1 delezione costruire insieme a 4 ng di prl-TK (un Renilla luciferasi che esprimono vettore) come controllo interno, utilizzando un kit trasfezione del DNA commerciale e il protocollo 23 del produttore (vedi elenco dei materiali e attrezzature) .
- 30 ore dopo la trasfezione, rimuovere il supporto della crescita della culturEd transfettate cellule. Lavare le cellule una volta con 200 ml di PBS, quindi rimuovere la soluzione di lavaggio.
- Misurare lucciola e Renilla attività luciferasi utilizzando un kit commerciale secondo i protocolli 24 del produttore.
- Esprimere l'attività per ciascun tubo come il rapporto tra l'attività della luciferasi di lucciola diviso per il (luciferasi Renilla) controllo interno; risultati complessivi sono generalmente espressi come attività di ciascuna giornalista costrutto rispetto a quello delle cellule trasfettate con il vuoto pGL3 vettore di base, che è dato un valore 1.
- Selezionare la linea cellulare appropriata da utilizzare per il saggio giornalista.
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Representative Results
Identificazione di BCRP 1 alternativa utilizzo promotore nei testicoli del mouse attraverso l'analisi degli esoni capo
Quando il database EST a NCBI era sondato (aprile 2015) utilizzando la procedura descritta nel protocollo 1, le EST scoperto che erano contigui con 5 'dell'esone 2 in BCRP 1 mRNA sono riportati nella tabella 1, insieme con la loro posizione nella genomica DNA relativo all'inizio dell'esone 2. Una EST derivato da C57BL / 6J testicoli di topo che è contiguo al esone 2 in BCRP 1 mRNA ha sequenze nel DNA genomico 70 kb upstream da esone 2, corrispondente a E1U (Tabella 1). Allo stesso modo, sono stati rilevati EST corrispondenti a E1A, E1B, e E1C. Da segnalare anche che i due EST corrispondenti ai E1C contenevano anche E1B impiombato alla fine del 5 'di E1C. La posizione di questi primi esoni previsti inrelazione Bcrp1 esone 2 on topo cromosoma 6 è mostrato in Figura 1.
Valutazione della BCRP funzione di promotore 1 alternativa
Risultati tipici del test luciferasi corrispondenti a E1U, E1A, E1B e E1C promotore-luciferasi costrutti reporter trasfettate in cellule murine Sertoli TM4 (vedere paragrafo 2.2) sono mostrati in figura 2A.
In un lavoro precedente, con un elemento di risposta SF-1 è stato previsto per essere nel promotore E1U 5. Se questo putativo SF-1 risposta elemento è coinvolto nella regolazione della Bcrp1 trascrizione in testis mouse, quindi mutazione (come descritto in un precedente foglio 5) di detto elemento di risposta nel E1U promoter giornalista costrutto ridurre l'attività della luciferasi prodotta da tale costrutto quando transfettate incellule TM4. I risultati di un tipico esperimento sono mostrati nella Figura 2B. Il costrutto mutato mostra minore attività luciferasi rispetto al costrutto non-mutato, con un'attività paragonabile a quella del vettore pGL3-basic vuoto, anche in cellule con espressione forzata di SF-1 (descritta in una precedente carta 5). espressione forzata di SF-1 aumenta l'attività del costrutto non-mutato, ma non quella di quella mutata.
Figura 1. Schema dell'allineamento genomica di EST con identità di sequenza di Bcrp1 esone 2 con cromosoma murino 6. Questi allineamenti sono stati individuati in una ricerca BLAST dbEST eseguita nel mese di aprile, 2015. Quattro allineamenti distinti sono stati trovati, corrispondente a Bcrp1 alternativi primi esoni E1U, E1A, E1B, e E1C. Questa figura è riprodotta da una precedente pubblicazione 5. 
Figura 2. Saggio (A) Reporter per Bcrp1 promotori E1U, E1A, E1B, e E1C a / c Sertoli cellule TM4 derivati da cellule BALB. I dati sono espressi come la luminescenza di luciferasi di lucciola normalizzata a quella di Renilla luciferasi, usando i metodi descritti nella sezione 2. I dati riportati sono la media e la deviazione standard di tre esperimenti diversi, fatto in giorni diversi. L'asterisco indica una differenza significativa dal vuoto di controllo pGL3 vettore con il t-test (P <0,01). Questa figura è riprodotta da una precedente pubblicazione 5. (B) Effetti della mutazione del elemento di risposta SF-1 in re Bcrp1 E1Uporter costruire sull'attività luciferasi. giornalista Bcrp1 costruisce con la regione di legame putativo SF-1 (mutato o non-mutato) sono state trasfettate in cellule TM4 con (SF-1 trasfettate) e senza (vettore trasfettate) l'espressione forzata di dati SF-1.I mostrato sono la media di 3 diversi esperimenti, fatto in giorni diversi; le barre di errore rappresentano deviazioni standard. Per ogni esperimento, i singoli saggi sono stati eseguiti in duplicato. Nella figura, (A) indica una differenza significativa dal controllo pGL3 vettore vuoto (P <0.05) utilizzando il t-test; (B) indica una differenza statisticamente significativa rispetto al promotore costrutto E1U utilizzando il t-test (P < 0.05). Questa figura è riprodotta da una precedente pubblicazione 5. Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.
Tabella 1. Ricerca Blast del database del mouse EST contro la sequenza del secondo esone del Bcrp1 25 -28. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa tabella.
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Discussion
La maggior parte dei metodi e dei risultati rappresentativi presentati sono descritti nel precedente lavoro intitolato "B crp1 trascrizione nei testicoli del mouse è controllato da un promotore a monte di un romanzo primo esone (E1U) regolato da steroidea fattore-1", che è stato pubblicato nel 2013 5 . Oltre ai risultati rappresentativi raffigurati, la carta precedente fornito stime delle alternative prima utilizzazione esone usando 5'-RACE metodologia PCR e RT-PCR. Inoltre, in-silico fu compiuta identificazione di un SF-1 risposta elemento putativo nel promotore a monte E1U e cromatina (ChIP) saggi dimostrato che SF-1 legato alla SF-1 elemento di risposta putative. Studi funzionali hanno rivelato che in cellule di Sertoli murine, BCRP 1 trascrizione è controllata da SF-1 tramite l'elemento di risposta SF-1 nel promotore E1U. Questi studi funzionali inclusi sovraregolazione di SF-1 nelle cellule TM4 di TRAnsfection o con l'uso di un inibitore della deacetilasi (vorinostat), che ha portato aumentata espressione di BCRP 1 E1U mRNA, e un aumento della BCRP 1 proteine così come l'attività della BCRP 1 E1U promotore in un saggio giornalista. Infine, questi studi hanno fornito prove del fatto che nei testicoli da specifici topi knockout per adulti Sertoli-cell SF-1, le espressioni di BCRP 1 E1U mRNA, proteine totali BCRP 1 mRNA, e Bcrp1 sono stati notevolmente diminuite 5. Lo stesso lavoro anche riferito i pattern di espressione di isoforme Bcrp1 mRNA in una varietà di tessuti murini, tra cui rene, fegato, testicolo, cervello, cuore, polmoni, muscoli, e la milza 5.
I protocolli descritti qui - con regolazione tessuto-specifica di BCRP 1 come un modello - forniscono un quadro sperimentale facile per svelare la complessità trascrizionale di un gene a determinare il suo differenzialeespressione in vari tessuti o sottotipi cellulari. Si deve sottolineare che i risultati ottenuti dai gradini protocollo descritto per le valutazioni in-silico può essere dipendente dal tempo in quanto i vari siti web che ospitano il software e database utilizzati possono essere soggette a modifiche. La metodologia in-silico qui presentata utilizza la ricerca nel database EST (dbEST) come riportato in precedenza 29, che ha stimato che circa il 18% di tutti i geni umani nel set di dati EST impiegano promotori alternativi. Cercando il dbEST può sottovalutare primi esoni alternativi, perché altri ricercatori - utilizzando un metodo di "oligo-capping" per la produzione di 1,8 milioni di sequenze 5'-end di cDNA da molti tessuti umani - sono stati in grado di identificare putativi siti di inizio della trascrizione per geni umani e stima che il 52% dei geni umani RefSeq studiati sono stati probabilmente regolata da promotori alternativi 1. È interessante notare che il secondo studio ha rilevato che latessuti che utilizzavano i promotori alternativi putativi del testicolo sono più e il cervello; Inoltre, hanno scoperto che i geni che codificano per proteine correlate per segnalare le vie di trasduzione erano più in grado di utilizzare promotori alternativi tessuto-specifici 1. Nonostante gli inconvenienti citati, dbEST analizza fornire un quadro di massima di 5 'UTR utilizzo di un particolare gene in diversi tessuti con il minimo sforzo.
Sebbene l'analisi dbEST fornisce uno sguardo facile in alternativa primo utilizzo esone, si consiglia vivamente di eseguire 5 'rapida amplificazione del cDNA estremità (5'-RACE) analisi per verificare primo utilizzo esone in una linea di tessuti o cellule sotto inchiesta. kit commerciali sono disponibili per 5'-RACE, con procedure dettagliate e semplici fornite dal produttore (vedi elenco dei materiali e attrezzature). Anche se un po richiede tempo, studi 5'-RACE forniscono stime attuali della presenza e la sequenza alternativa primi exons nel mRNA di interesse; Inoltre, la presenza di diversi siti di inizio della trascrizione può essere rilevato anche 13. Per assicurare la rappresentazione sufficiente, è necessaria sequenziamento di almeno 15 a 25 cloni. Prima di sequenziamento, è essenziale per rimuovere contaminanti sequenze vettoriali da prodotti RACE 5 '. Se questo non avviene, analisi BLAST può riuscire completamente a rilevare un allineamento di sequenza con il genoma mouse. Una volta primo utilizzo esone è stabilito, i risultati 5'-RACE possono essere utilizzati per convalidare le successive analisi quantitative RT-PCR per primi esoni alternativi. In generale, il lavoro precedente 'Gli autori hanno scoperto che vi è una buona correlazione tra la percentuale di primi cloni di mRNA esone recuperati dalla 5'RACE e la percentuale di prodotto di PCR recuperato per un determinato primo esone alternativa dalla stessa tessuti o cellule linea 5. Inoltre, buona correlazione è stata trovata tra le attività di costrutti luciferasi promotore di alternative Bcrp1 promotori di unnd l'espressione del corrispondente primo esone alternativo in una particolare linea cellulare 5.
Nella ricerca di utilizzo promotore alternativa tessuto-specifica, se vengono utilizzati organi interi, si deve essere consapevoli del fatto che i promotori / primi esoni alternativo non trovato rifletteranno l'eterogeneità del tessuto dell'organo, come elementi ghiandolari, vasi sanguigni, stroma, ecc Per ad esempio, il testicolo è un mix di somatica (Leydig, Sertoli, myoid, e endoteliale), le cellule e le cellule germinali (aploidi), così come vascolare. Per sondare per l'espressione primo esone tessuto-specifico, sarà necessario isolare specifici tessuti dagli organi.
Altri metodi sono stati riportati per identificare l'utilizzo promotore alternativa e regolazione; tuttavia, questi richiedono sequenziamento di prossima generazione e bioinformatica di calcolo in grado di analizzare la grande quantità di dati prodotti. Questi metodi includono il sequenziamento dell'intero trascrittoma (RNA-Seq), e Chip-Seq diistoni quali H3K4me3, che si lega preferenzialmente ai promotori 30. Anche se questi metodi possono essere costosi per effettuare de-novo, quando l'attenzione è rivolta l'espressione di alcuni geni e tessuti specifici, estrazione dei dati esistenti può essere un approccio più pratico.
I saggi di stima promotore attività qui presentata impiegano il vettore pGL3-basic, che contiene una regione di clonaggio multiplo a monte del gene della luciferasi di lucciola. attività di Promotore si misura con la produzione di luciferasi di lucciola, che è facilmente quantificabile, dopo l'aggiunta di cofattori e un substrato luminescenti, per la misura di luminescenza in un luminometro commerciale (vedi elenco dei materiali e attrezzature). Il vettore pGL4 correlato può essere fatto per contenere marcatori selezionabili (ad esempio, neomicina, Hygromycin, puromicina), consentendo la produzione di cellule stabilmente trasfettate. I protocolli riportate in questo documento utilizzano trasfezione transiente. Tipicamente, saggi giornalista per promotattività di ER sono fatte usando co-trasfezione con un vettore che esprime costitutivamente Renilla (Sea Pansy) luciferasi (PRL-TK), per controllare le variazioni di numero di cellulare e l'efficienza della trasfezione. Un passo fondamentale per stabilire un saggio promotore per un dato gene è per essere sicuri che il gene di interesse è espressa nella linea cellulare che è trasfettate con il costrutto giornalista. In secondo luogo, quando l'utilizzo promoter alternativa è presente, è importante utilizzare il costrutto promotore che corrisponde al primo esone alternativa espressa nella linea cellulare trasfettata. Ad esempio, non si aspettano di vedere luminescenza per il costrutto promotore E1U che viene trasfettato in cellule che esprimono Bcrp1 esclusivamente sotto il controllo del promotore E1B. In alternativa, come controllo negativo, trasfezione del reporter costruire in una linea di cellule che non esprimono il gene o mRNA isoforme di interesse deve tradursi in una produzione di luciferasi di lucciola.
la cONSEGUENZE di utilizzo promotore alternative includono la produzione della stessa proteina, produzione di proteine con differenti N-terminali, o la produzione di proteine diverse 29. Nel caso di Bcrp1 / BCRP, multiple (tipo-specifici tessuto- o cellulari) promotori controllano la produzione della stessa proteina. Esiste un modello simile per il CYP19 (aromatasi) gene 29, 31. I protocolli qui presentati forniscono i passaggi fondamentali si possono utilizzare per decifrare in una linea di tessuto o cellule i complessi meccanismi di controllo trascrizionale di una proteina di interesse.
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Disclosures
Douglas D. Ross e l'Università del Maryland, Baltimora titolari di diritti di brevetto per BCRP umana.
Acknowledgments
Questo lavoro è stato sostenuto da Merit Review Awards per Douglas D. Ross e per Arif Hussain dal Department of Veterans Affairs.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| COMMERCIAL BIOLOGIC MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE kit | Ambion Inc., Austin, TX, currently available through Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit |
| TOPO TA cloning kit | Life Technologies | K450001 | This kit contains the TOP10 chemically competent E. coli bacteria. |
| T4 DNA ligase quick ligation kit | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart high-fidelity Taq- DNA polymerase | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contains a high-fidelity Taq polymerase enzyme blend |
| XtremeGENE HP DNA transfection reagent | Roche | 6366236001 | |
| Dual-luciferase reporter assay kit | Promega | E1910 | Includes the pGL3-basic empty reporter vector (firefly luciferase), pRLTK renilla luciferase expressing vector, and other control vectors. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | For plasmid miniprep - isolation and purification of plasmid DNA from bacterial colonies |
| pCR2.1 vector | part of the TOPO TA cloning kit | ||
| pGL3-basic luciferase containing vector | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Renilla luciferase expressing vector | Promega | E2241 | |
| Bacterial artificial chromosome | BACPAC Resources Center, Children’s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 and RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REAGENTS/CHEMICALS/MEDIA/SUPPLIES | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® SV Gel and PCR Clean-Up System | Promega | A9281 | Useful for purifying PCR products following digestion with restriction endonucleases |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Ensembl project | http://Ensembl.org | The Ensembl project produces genome databases for vertebrates and other eukaryotic species, and makes this information freely available online. |
| Blast software | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web&PAGE_TYPE=BlastHome |
|
| Primer 3 software | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Useful for designing primers for 5'-RACE PCR |
| NCBI Nucleotide database | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 murine Sertoli cells | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminometer | Turner Biosystems | TD-20/20 | This is a relatively inexpensive, manually operated luminometer. Automated systems are also available from the same manufacturer that utilize 96 well plates. |
| NanoDrop spectrophotometers | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | Spectrophotometer can use very small quantities of sample |
| DU 800 UV/VIS spectrophotometer and Nucleic Acid Analysis II software | BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 | |
References
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