Con el murino transportador ABC BCRP1 (Abcg2) como un ejemplo, en-silico protocolos se presentan para detectar el uso de promotor alternativo en los genes expresados en tejidos de ratón, y para evaluar la funcionalidad de los promotores alternativos identificados mediante los ensayos de reportero.
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Artículo de método
Métodos para descubrir uso promotor alternativo y la regulación transcripcional de murino BCRP1
En este artículo
Resumen
Resumen
La expresión de genes en diferentes tejidos es a menudo controlado por promotores alternativos que resultan en la síntesis de ARNm con únicas - por lo general no traducidas - primeros exones. BCRP1 (Abcg2), el ortólogo murino de la mama ABC transportador de proteína de resistencia al cáncer (BCRP, ABCG2), tiene por lo menos cuatro promotores alternativos que son designados por los correspondientes cuatro primeros exones alternativos producidos: E1U, E1A, E1B, y E1C. En este documento, en silico protocolos se presentan para predecir el uso promotor alternativo para BCRP1. Además, se describen métodos de ensayo reportero para producir construcciones de reportero de promotores alternativos y para determinar la funcionalidad de los promotores putativos aguas arriba de los primeros exones alternativos que se identifican.
Introducción
Más de la mitad de los genes humanos están regulados por promotores alternativos 1. Cada promotor alternativo puede contener elementos reguladores que pueden ser diferentes de los de otros promotores alternativos. El promotor (s) utilizado en un tejido puede diferir de los utilizados en otro tejido. Por ejemplo, es posible que la activación de una vía de señalización dado puede desencadenar el promotor alternativo para un gen utilizado en un tejido, sin embargo, no tienen efecto sobre o reprimir un promotor alternativo separado para el mismo gen que se utiliza en otro tejido.
La expresión del gen BCRP1 se rige por los promotore....
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Protocolo
1. predicción in silico de los primeros exones alternativos de BCRP1 Uso del análisis BLAST de la base de datos de EST de ratón
Nota: Este protocolo se describe cómo buscar la etiqueta de secuencia expresada ratón (EST) base de datos de EST con similitud de secuencia con el exón 2 de BCRP1 (que contiene el sitio de iniciación de la traducción) y luego la forma de alinear las secuencias EST que coinciden con las secuencias genómicas para determinar su ubicación en el gen BCRP1 ratón en relación con el extremo 5 'de BCRP1 exón 2.
- Obtener la secuencia de BCRP1 ratón exón 2 mediante la introducción del ARNm secuencia d....
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Resultados
1 Identificación de BCRP alternativa la utilización del promotor en los testículos del ratón mediante el análisis de los exones líder
Cuando se sondeó la base de datos de EST en NCBI (abril de 2015) siguiendo los pasos descritos en el Protocolo 1, la EST encontraron que eran contiguo con el extremo 5 'del exón 2 en BCRP 1 mRNA se muestran en la Ta.......
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Discusión
La mayoría de los métodos y resultados representativos presentados se describen en el trabajo anterior titulado "B CRP1 la transcripción en los testículos del ratón es controlado por un promotor aguas arriba de un nuevo primer exón (E1U) regulada por el factor 1 de esteroides, a la" que fue publicado en 2013 5 . Además de los resultados representativos representados aquí, en el documento anterior proporciona estimaciones de primera utilización exón alternativo utilizando 5'-RACE PCR y R.......
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Divulgaciones
Douglas D. Ross y la Universidad de Maryland, Baltimore tienen derechos de patente a BCRP humana.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por becas por mérito de revisión a Douglas D. Ross y a Arif Hussain, del Departamento de Asuntos de Veteranos.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| COMMERCIAL BIOLOGICAL MATERIALS AND KITS: | |||
| First Choice RLM-RACE | kit Ambion Inc., Austin, TX, actualmente disponible a través de Life Technologies | AM1700 | 5'-RACE PCR kit de |
| clonación TOPO TA | Life Technologies K450001 | Este kit contiene las bacterias TOP10 químicamente competentes E. coli. | |
| Kit de ligadura rápida de ADN ligasa T4 | New England Biolabs | M2200 | |
| Faststart de alta fidelidad Taq- ADN polimerasa | Sigma-Aldrich/Roche | 3553400001/RMB-4738284001 | Contiene una mezcla de enzimas polimerasa Taq de alta fidelidad |
| Reactivo de transfección de ADN XtremeGENE HP | Roche | 6366236001 | |
| Kit de ensayo reportero de luciferasa dual | Promega | E1910 | Incluye el vector reportero vacío básico pGL3 (luciferasa de luciérnaga de luciérnaga), el vector de expresión de luciferasa rRILLA rRLTK y otros vectores de control. |
| QIAprep | Qiagen | 27104 | Para miniprep de plásmidos: aislamiento y purificación de ADN plasmídico de colonias bacterianas |
| vector pCR2.1 | parte del kit | ||
| Vector que contiene luciferasa básica pGL3 | Promega | E1751 | |
| pRL-TK Vector expresor de luciferasa Renilla | Promega | E2241 | |
| Cromosoma artificial bacteriano | Centro de Recursos de BACPAC, Niños s Hospital Oakland Research Institute, Oakland, CA | RP23-285A12 y RP24-314E24 | http://bacpac.chori.org/clones.htm |
| REACTIVOS/PRODUCTOS QUÍMICOS/MEDIOS/SUMINISTROS | |||
| TRIzol | Life Technologies | 15596026 | |
| Wizard® Sistema de limpieza de gel y PCR SV | Promega | A9281 | Útil para purificar productos de PCR después de la digestión con endonucleasas de restricción |
| CRYOVIALS | Denville Scientific | V9012 | |
| SOFTWARE: | |||
| Ensembl software | Proyecto Ensembl | http://Ensembl.org | El proyecto Ensembl produce bases de datos genómicas de vertebrados y otras especies eucariotas, y pone esta información a disposición gratuita en línea. |
| Software de voladura | NCBI | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?CMD= Web& PAGE_TYPE=Software BlastHome | |
| Primer 3 | Simgene | http://simgene.com/Primer3 | Útil para diseñar cebadores para PCR de 5' RACE |
| Base de datos de nucleótidos | NCBI | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nucleotide/ | |
| CELL LINES: | |||
| TM4 células de Sertoli murinas | ATCC, Manassas, Virginia | CRL-1715™ | |
| INSTRUMENTS: | |||
| Luminómetro | Turner Biosystems | TD-20/20 | Este es un luminómetro relativamente barato, operado manualmente. Los sistemas automatizados también están disponibles del mismo fabricante que utilizan placas de 96 pocillos. |
| Espectrofotómetros NanoDrop | Thermo Scientific, Inc. | NanoDrop 2000 | puede utilizar cantidades muy pequeñas de muestra, |
| espectrofotómetro UV/VIS DU 800 y software de análisis de ácidos nucleicos II | , BeckmanCoulter Inc, Fullerton, CA | DU 800 |
Referencias
- Kimura, K., et al. Diversification of transcriptional modulation: large-scale identification and characterization of putative alternative promoters of human genes. Genome Res. 16 (1), 55-65 (2006).
- Doyle, L. A., et al.
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Reimpresiones y permisos
