El objetivo de este protocolo es describir la recolección y el procesamiento de muestras quirúrgicas humanas para múltiples aplicaciones de aguas abajo en schwannoma vestibular y la investigación con células de Schwann.
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Artículo de método
Un Marco Metodológico Unificado para la Investigación de Schwannoma Vestibular
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
Los schwannomas vestibulares son las neoplasias más comunes del ángulo cerebelopontino, constituyendo un 6-8% de todos los crecimientos intracraneales. Aunque estos tumores causan pérdida auditiva neurosensorial en hasta el 95% de los individuos afectados, los mecanismos moleculares subyacentes a esta pérdida auditiva siguen siendo esquivos. Este artículo describe los pasos establecidos en nuestro laboratorio para facilitar la recolección y procesamiento de varias muestras de tejido humano primario para aplicaciones de investigación en aguas abajo integrantes del estudio de schwannomas vestibulares. Específicamente, este trabajo describe un marco metodológico unificado para la recolección, procesamiento y cultivo de células de Schwann y schwannoma de muestras quirúrgicas. Esto se integra con los pasos de procesamiento paralelos ahora considerados esenciales para la investigación actual: la recolección de secreciones tumorales y nerviosas, la preservación del ARN y la extracción de proteínas de tejidos recolectados, la fijación de tejido para la preparación de secciones,D la exposición de las células humanas primarias a los virus adeno-asociados para su aplicación a la terapia génica. Además, este trabajo destaca el enfoque quirúrgico translabyrinthine para recoger este tumor como una oportunidad única para obtener epitelio sensorial humano desde el oído interno y perilymph. Se proporcionan consejos para mejorar la calidad experimental y se destacan las trampas comunes.
Introducción
Los schwannomas vestibulares (SV) son los neoplasmas más comunes del ángulo cerebelopontino, diagnosticados en 1 de cada 100.000 individuos. Aunque no metastásicos, estos tumores afectan gravemente la calidad de vida del paciente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Los individuos afectados comúnmente viven con pérdida de audición, tinnitus, y una sensación de plenitud auditiva. Los síntomas se vuelven cada vez más debilitantes a medida que el tumor crece, causando problemas de equili....
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Protocolo
El consentimiento informado por escrito para la recogida de todas las muestras se obtuvo antes de la cirugía, y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki). Todas las secciones del protocolo del estudio fueron aprobadas por la Junta de Revisión Institucional de Massachusetts Eye and Ear y Massachusetts General Hospital.
NOTA: Las Secciones 1-7 a continuación están diseñadas para ser ejecutadas secuencialmente al recibir una muestra primaria de VS o GAN humana de la sala de operaciones. El tratamiento debe comenzar siempre con la sección 1. Luego, por regla....
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Resultados
Las células VS humanas primarias en cultivo, como se establece en la sección 5, pueden tratarse como modelos informativos para procesos asociados a enfermedades en muchas aplicaciones de investigación posteriores ( Figura 1 ). Las células sanas de Schwann cultivadas en la sección 6 proporcionan un punto de comparación directo e instructivo. Como se describe a continuación, los datos extensos de VSs y GANs procesados de acuerdo con este marco metodológico u.......
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Discusión
Este manuscrito describe un marco metodológico unificado para la investigación VS, que describe el procesamiento simultáneo de especímenes humanos VS y GAN para aplicaciones de investigación aguas abajo. A medida que la investigación VS entra en la era de la medicina de precisión, la preparación de la misma muestra en formas capaces de responder a numerosas preguntas de investigación permitirá el descubrimiento de los conocimientos moleculares, celulares, genéticos y proteómicos específicos de cada paciente.
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Sordera y otros trastornos de la comunicación subvenciones R01DC015824 (KMS) y T32DC00038 (apoyo JES y SD), el Departamento de Defensa W81XWH-14-1-0091 (KMS), la Fundación Bertarelli (KMS) , La Fundación Nancy Sayles Day (KMS), el Lauer Tinnitus Research Center (KMS) y la Fundación Barnes (KMS).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| BioCoat Poly-D-Lisina/Laminina 12 mm #1 Cubreobjetos de vidrio alemán | Corning | 354087 | O prepare cubreobjetos con Corning Laminin (CB-40232) y Cultrex Poly-L-Lisine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 mL Tubos de Centrífuga, Fondo Cónico, Graduación, Greiner Estéril | Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 mL Tubos de Centrífuga, Fondo Cónico, Graduación, Estéril | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Placa de cultivo celular, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Colagenasa de Clostridium histolyticum, | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 pocillos transparentes Placas de pocillos múltiples tratadas con TC, estériles | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, glucosa alta, piruvato, sin glutamina, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Pinzas Dumont #3, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave antes de usar |
| Pinzas Dumont #5, punta estándar, autoclave Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | antes de usar |
| Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDA, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Alícuota en tubos de 50 mL y almacenamiento en -20 grados; C congelador |
| Hialuronidasa de Testículos Bovinos, Tipo I-S, Polvo Liofilizado | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Unidad de Filtro de Jeringa, 0.22 µ m, polietersulfona, 33 mm, estéril | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehído, grado reactivo, cristalino | Sigma-Aldrich | P6148 | Antes de usar: Establecer Procedimientos Operativos Estándar basados en protocolos disponibles en línea |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave antes de usar |
| Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Tabletas Inhibidoras de la Fosfatasa | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Tabletas Inhibidoras de la Proteasa Thermo | Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipetas y puntas de pipeta, 5/10/25 mL | Variable | Variable | |
| Triturador de homogeneización de plástico para microtubos de 1,5/2,0 mL E | & K Scientific | EK-10539 | |
| Agujas PrecisionGlide, 27 G x 1 1/2 pulgadas | BD | 301629 | |
| Tampón RIPA | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (solución de estabilización de ARN) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Tubos de microcentrífuga con cierre seguro, polipropileno, 0,5 ml | Autoclave de 022363719 Eppendorf | antes de usar | |
| Tubos de microcentrífuga Safe-Lock, polipropileno, 1,5 mL | Autoclave Eppendorf | 022363204 antes de usar | |
| solución salina - Inyección de cloruro de sodio al 0,9%, bacteriostático, 20 mL | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Hojas de bisturí - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Tubo de succión calibre 24 | Bausch + Lomb | N1698 42 | Útil para el abordaje quirúrgico (además de los instrumentos quirúrgicos otológicos comunes) y p. ej. un marcador quirúrgico azul |
| Contenedor de muestras, OR estéril, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Microscopio estereoscópico | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Combinación de jeringa/aguja, punta Luer-Lok, 5 mL, 22 g x 1 pulg. | BD | 309630 | |
| Jeringa de tuberculina solamente, punta deslizante, 1 mL | BD | 309659 | |
| Jeringa de tuberculina solamente, punta deslizante, 3 mL | BD | 309656 | |
| Homogeneizador ultrasónico, serie 4710, sonda CV18 | Cole-Parmer | CP25013 |
Referencias
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and manage....
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Reimpresiones y permisos
