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Artículo de método

Un Marco Metodológico Unificado para la Investigación de Schwannoma Vestibular

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DOI:

10.3791/55827

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20 de junio de 2017

 ,  ,  ,  ,  , 
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

El objetivo de este protocolo es describir la recolección y el procesamiento de muestras quirúrgicas humanas para múltiples aplicaciones de aguas abajo en schwannoma vestibular y la investigación con células de Schwann.

Resumen

Los schwannomas vestibulares son las neoplasias más comunes del ángulo cerebelopontino, constituyendo un 6-8% de todos los crecimientos intracraneales. Aunque estos tumores causan pérdida auditiva neurosensorial en hasta el 95% de los individuos afectados, los mecanismos moleculares subyacentes a esta pérdida auditiva siguen siendo esquivos. Este artículo describe los pasos establecidos en nuestro laboratorio para facilitar la recolección y procesamiento de varias muestras de tejido humano primario para aplicaciones de investigación en aguas abajo integrantes del estudio de schwannomas vestibulares. Específicamente, este trabajo describe un marco metodológico unificado para la recolección, procesamiento y cultivo de células de Schwann y schwannoma de muestras quirúrgicas. Esto se integra con los pasos de procesamiento paralelos ahora considerados esenciales para la investigación actual: la recolección de secreciones tumorales y nerviosas, la preservación del ARN y la extracción de proteínas de tejidos recolectados, la fijación de tejido para la preparación de secciones,D la exposición de las células humanas primarias a los virus adeno-asociados para su aplicación a la terapia génica. Además, este trabajo destaca el enfoque quirúrgico translabyrinthine para recoger este tumor como una oportunidad única para obtener epitelio sensorial humano desde el oído interno y perilymph. Se proporcionan consejos para mejorar la calidad experimental y se destacan las trampas comunes.

Introducción

Los schwannomas vestibulares (SV) son los neoplasmas más comunes del ángulo cerebelopontino, diagnosticados en 1 de cada 100.000 individuos. Aunque no metastásicos, estos tumores afectan gravemente la calidad de vida del paciente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Los individuos afectados comúnmente viven con pérdida de audición, tinnitus, y una sensación de plenitud auditiva. Los síntomas se vuelven cada vez más debilitantes a medida que el tumor crece, causando problemas de equilibrio, parálisis facial y deterioro de otras funciones del nervio craneal. Complicaciones potencialmente mortales debido a la compresión del tronco encefálico también puede resultar 7 .

Las opciones de manejo para VS se limitan esencialmente a la espera vigilante de tumores estáticos y radioterapia estereotáctica o resección quirúrgica de tumores en crecimiento 8. La extirpación quirúrgica de estos tumores en los hospitales afiliados a la investigación presenta la oportunidad de adquirir y analizar el tejido tumoral fresco recogido durante las cirugías del paciente. Una aproximación quirúrgica específica a la VS, la resección translabyrinthine, puede incluso ofrecer el acceso al epitelio sensorial humano valioso del oído interno y del perilymph.

Debido a que los VSs surgen de un nervio sensorial periférico ( es decir, el nervio vestibular), es importante comparar las observaciones asociadas con VS con las derivadas de un nervio control adecuado, como el gran nervio auricular humano (GAN). Los GAN sanos se sacrifican regularmente durante las parotidectomías o disecciones del cuello y pueden utilizarse como modelos robustos para la fisiología sana de las células de Schwann 9 .

Debido a que no hay fármacos aprobados por la FDA para el tratamiento o la prevención de VS esporádicos, es imperativo que los investigadores elucidar el mecanismo molecular subyacenteDe la enfermedad para identificar objetivos terapéuticos. Las proteínas que se ha demostrado que juegan un papel en la patogenia VS incluyen merlin, factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF), ciclooxigenasa 2 (COX-2), factor nuclear kappa B (NF-κ B), factor de necrosis tumoral alfa (TNF-alfa) , Receptor del factor de crecimiento epidérmico (EGFR), y moléculas de señalización relacionadas 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Recientes avances han ampliado y mejorado los protocolos para la recolección, procesamiento, cultivo, y la investigación posterior de primaria schwannomas vestibulares humanos y tejidos nerviosos saludables [ 18 , 19] . Sin embargo, la mayoría de los protocolos existentes están diseñados paraDe dichos tejidos para una única solicitud de investigación posterior ( es decir, cultivo celular solo). Este artículo presenta un marco metodológico unificado para el procesamiento simultáneo de una única muestra primaria VS o GAN humana para múltiples aplicaciones aguas abajo: cultivo específico de tipo celular, extracción de proteínas, preservación de ARN, recolección de secreción tumoral y fijación de tejido. Este trabajo también detalla la colección quirúrgica y el procesamiento de líquido cefalorraquídeo humano (LCR) y perilinfa durante la resección translaviríntica VS, ya que estos tejidos estrechamente relacionados pueden servir como fuentes importantes de biomarcadores para VS. Finalmente, este protocolo presenta pasos para la transducción viral de células VS humanas primarias en cultivo como una aplicación novedosa de este tejido para uso en terapia génica.

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Protocolo

El consentimiento informado por escrito para la recogida de todas las muestras se obtuvo antes de la cirugía, y los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con el Código de Ética de la Asociación Médica Mundial (Declaración de Helsinki). Todas las secciones del protocolo del estudio fueron aprobadas por la Junta de Revisión Institucional de Massachusetts Eye and Ear y Massachusetts General Hospital.

NOTA: Las Secciones 1-7 a continuación están diseñadas para ser ejecutadas secuencialmente al recibir una muestra primaria de VS o GAN humana de la sala de operaciones. El tratamiento debe comenzar siempre con la sección 1. Luego, por regla general, se debe preservar primero el ARN (sección 2), seguido de la preparación de tejido para la recolección de secreciones (sección 3) y la extracción de proteínas (sección 4). El tejido a cultivar (sección 5 para VS, sección 6 para GAN) puede permanecer en medio de cultivo suplementado mientras se realizan las secciones 2, 3 y 4. La fijación del tejido para la sección (sección 7) es muy corta y cA realizarse durante cualquier paso de centrifugación. La sección 8 (procesamiento del perilinismo) y la sección 9 (procesamiento del LCR) se pueden llevar a cabo al recibir el perilinfa o el LCR del quirófano durante una resección translaviríntica VS. La sección 10 (transducción viral) se puede realizar en cultivo de células VS o Schwann en cultivo.

1. Preparación y recepción de una muestra quirúrgica

NOTA: Los siguientes pasos se deben realizar en un ambiente estéril, tal como una campana de cultivo de tejidos o una campana de flujo laminar. Se espera una familiaridad con la técnica estéril básica.

  1. Preparación de medio para cultivo de células VS o Schwann humano primario
    1. Descongele una alícuota de 50 ml de suero fetal bovino congelado (FBS) en un baño de agua a 37 ° C.
    2. Añadir 5 mL de mezcla de penicilina / estreptomicina a una botella de 500 mL de DMEM / F-12, dando como resultado una dilución final de 1: 100.
    3. Añadir los 50 mL de FBS descongelado a la botella de 500 mL de DMEM / F-12,Dando como resultado una dilución final de 1:10.
    4. Escriba la fecha, las iniciales del investigador y la información suplementaria ( por ejemplo, P / S al 1%, FBS al 10%) en la botella.
    5. Coloque el nuevo medio de cultivo en el refrigerador (4 ° C).
  2. Recepción y limpieza de la muestra VS o GAN
    1. En el quirófano, coloque la muestra recién cosechada VS o GAN en solución salina estéril en un recipiente de muestra. Transporte la muestra en hielo de la sala de operaciones a una campana de flujo laminar en el laboratorio.
      NOTA: Los tamaños y pesos de las muestras varían significativamente entre los pacientes basándose en el tamaño del tumor relevante o la cantidad de nervio extirpado.
    2. Eliminar al congelador las alícuotas de solución de hialuronidasa (25.000 U / ml) y colagenasa (3.200 U / ml) y dejar que las enzimas se descongelen a temperatura ambiente (requeridas para la etapa 5.1.4 o 6.1.6, dependiendo de si la muestra es Un VS o un GAN).
      NOTA: La resuspensión de las enzimas liofilizadas iS descritas en detalle en las hojas de información del producto. La colagenasa puede resuspenderse en cualquier solución de sal equilibrada libre de calcio e hialuronidasa en una solución de tampón fosfato 0,02 M (pH 7,0), NaCl 77 mM y 0,01% de 1 mg / ml de albúmina de suero bovino. La actividad específica para cada enzima liofilizada varía con el lote y debe ser verificada antes de la resuspensión.
    3. Usando una serie de tres tubos de 1,5 ml llenos con 1,4 ml de PBS estéril 1x, lave la muestra VS o GAN tres veces. Con cuidado, transfiera el espécimen de tubo a tubo con pinzas estériles. Cierre cada tubo una vez que contiene la muestra, y agite suavemente para lavar.
      NOTA: Para evitar la inundación de los tubos de 1,5 mL, se puede usar menos de 1,4 mL de PBS por tubo si la pieza del tumor es grande.
    4. Coloque la muestra en una placa de Petri seca de 60 mm y utilice una pinza para extraer todo el tejido muerto ( es decir, porciones cauterizadas, que suelen ser de color blanco u opaco) y áreas con vasos sanguíneos prominentes.
    5. Uso fOrceps o una hoja de bisturí para dividir la muestra en piezas separadas para la preservación del ARN, la extracción de proteínas, la recolección de secreciones, la fijación y el cultivo celular (ver las secciones 2 - 6, más adelante).
    6. Transferir la pieza del espécimen designado para cultivo celular (sección 5/6) a un nuevo plato de cultivo de 60 mm que contiene 5-8 ml de medio DMEM / F-12 suplementado en frío (alternativamente, la tapa del primer plato de cultivo puede ser Utilizado para este paso).
      NOTA: La cantidad de medio DMEM / F-12 necesaria (del paso 1.1) dependerá del tamaño del tumor o nervio, pero debe caer entre 5 y 8 ml. Esta pieza puede sentarse en medio de cultivo mientras se realizan las etapas subsiguientes.

2. Preservación del ARN del tejido VS y GAN (también válido para el epitelio sensorial humano)

  1. Bajo la campana de flujo laminar, transfiera 1-1,2 ml de solución de estabilización de ARN a un nuevo tubo de 1,5 ml.
  2. Después de lavar la muestra con PBS (paso 1.2.3), sumerja brevemente la pequeña tartaCe de tejido designado para la preservación de ARN (aproximadamente 3 mm3 de VS o una longitud de 5 mm de GAN) en la solución de estabilización de ARN. Asegúrese de que la muestra esté completamente sumergida en la solución.
  3. Preparar y etiquetar un nuevo tubo de 1,5 ml. Recuperar la muestra de la solución de estabilización de ARN, transferirla al nuevo tubo y almacenarla en un congelador de -80 ° C.

3. Recolección de las Secreciones VS y GAN

  1. Día 1
    1. Después de lavar la muestra con PBS (paso 1.2.3), coloque la pieza de VS o GAN designada para la recogida de secreciones en un tubo vacío de 1,5 ml.
    2. Preparar dos tubos adicionales de 1,5 ml y pipetear 500 μL de DMEM (no suplementado con FBS) en cada tubo.
      NOTA: El primer tubo de DMEM se utilizará para recoger las secreciones tumorales, y el segundo tubo de DMEM servirá como un control emparejado. Las secreciones pueden recogerse en DMEM, cualquier otro medio de cultivoSuplementado con suero, o PBS.
    3. Coloque uno de los tubos que contienen DMEM en una escala digital calibrada. Tara la escala, de modo que cuando el tubo se sienta encima de la escala, se lea 0 mg.
    4. Quitar el tubo de DMEM de la balanza, colocar el trozo de espécimen designado para la recogida de secreciones en el tubo, y pesarlo. Observe el resultado, que representará el peso del tejido solo.
    5. Bajo una campana de flujo laminar, ajustar el volumen de DMEM en el tubo a 100 μL por 10 mg de muestra.
    6. Colocar el tubo que contiene la muestra de tejido y su control emparejado (DMEM solo) en la incubadora (37 ° C, 5% CO 2 ) durante un período compatible con los planes para este experimento. Incubar el tejido durante al menos 72 h para recoger cantidades biológicamente útiles de tumor o secreciones nerviosas [ 15] .
  2. Día 4
    1. Después de la incubación durante 72 h, eliminar el medio que contiene secreción de laEspécimen ( es decir, medio acondicionado de tejido) usando una pipeta de 1 ml. Para prevenir ciclos repetidos de congelación-descongelación, alícuote el medio en tubos nuevos de acuerdo con los análisis de aguas abajo planificados ( por ejemplo, para realizar un ELISA con 4 pocillos que requieren 50 μl cada uno, pueden prepararse alícuotas de 210 μl).
    2. Si es necesario, congelar la pieza de tejido que queda en el tubo original (ya marcada el día 1) a -80 ° C para análisis adicionales, como la extracción de ADN, en una fecha posterior.
    3. Almacenar el tejido, las secreciones y el DMEM de control en un congelador de -80 ° C hasta que se inicien las aplicaciones aguas abajo ( por ejemplo, ELISAs, LC-MS / MS, matrices de citoquinas, etc. ).

4. Extracción de proteínas de tejido VS o GAN

  1. Preparación de tampón RIPA fortificado
    1. Añadir un comprimido de inhibidor de fosfatasa y un comprimido de inhibidor de proteasa a 10 ml de tampón RIPA en un tubo de 15 ml; Esto está fortalecidoRIPA.
      NOTA: Guarde el tampón RIPA a 4 ° C y añada los comprimidos justo antes de su uso.
  2. Extracción de proteínas
    1. Transferir 210 μl de tampón RIPA fortificado (paso 4.1.1) a un nuevo tubo de 1,5 ml.
    2. Después de lavar el espécimen con PBS (paso 1.2.3), transfiera el trozo pequeño de tejido designado para la extracción de proteínas (aproximadamente 3 mm3 de VS o 5 mm de longitud de GAN) al tubo que contiene tampón RIPA y colóquelo sobre hielo Durante al menos 10 min. Si el estudio de las formas fosforiladas de las proteínas, complementar el buffer RIPA con proteasa y fosfatasa inhibidores [ 14] . Entretanto, pueden llevarse a cabo etapas para otros componentes del procesamiento de tejidos, tales como la fijación (sección 7).
    3. Pre-enfriar la centrífuga a 4 ° C.
    4. Usando un mazo de plástico, homogeneice el tejido en el tubo que contiene el tampón RIPA. Sonicar el tejido durante 10-15 s al 20% de amplitud. Asegúrese de que la muestraPermanece sobre hielo, incluso durante la sonicación.
    5. Centrifugar durante 10 minutos a 15.000 xg y 4 ° C.
    6. Alícuota del sobrenadante en incrementos de 50 μL en nuevos tubos de 0,5 ml (dependiendo de las aplicaciones de aguas abajo previstas, se puede elegir cualquier tamaño de incremento).
    7. Almacenar las alícuotas de lisado de proteína en un congelador de -80 ° C hasta que se inicien las aplicaciones aguas abajo ( por ejemplo, ELISA o Western blots) 20 , 21 .

5. Cultura VS Humana Primaria

  1. Día 1
    1. Separar el tejido VS designado para cultivo celular (que ha estado sentado en medio de cultivo, como se describe en el paso 1.2.6) en aproximadamente 1 mm 3 piezas usando un par de pinzas en cada mano.
    2. Aspirar el medio que contiene la pieza del tumor con una pipeta serológica de 10 ml y transferir todo el contenido a un tubo cónico de 15 ml.
    3. Centrifugar durante 3 min a1.000 xg y 25 ° C.
    4. Preparar el medio de desintegración en un nuevo plato de cultivo de 60 mm combinando 4,7 ml de medio DMEM / F-12 suplementado con 250 μl de colagenasa (concentración final: 160 U / ml) y 50 μl de hialuronidasa (concentración final: 250 U / ml) , Para un volumen final de 5 ml.
      NOTA: Ambas enzimas deben ser almacenadas en un congelador de -20 ° C pero descongeladas antes de la preparación de este medio (paso 1.2.2).
    5. Después de la centrifugación, las piezas tumorales formarán un gránulo en el fondo del tubo cónico. Con cuidado, pipetear y desechar el sobrenadante.
    6. Añadir 2 ml del medio de desintegración que contiene enzima recién hecho (paso 5.1.4) al sedimento tumoral. Pipeta hacia arriba y hacia abajo varias veces para movilizar el tejido y transferir el tumor que contiene el medio a la placa de cultivo de 60 mm.
    7. Colocar el plato de cultivo en la incubadora (37 ° C, 5% CO 2 ) durante 18 h.
  2. Dia 2
    1. CálidoMEM / F - 12 suplementado con FBS al 10% y penicilina / estreptomicina al 1% (preparado en el paso 1.1) en un baño de agua a 37ºC.
    2. Quitar la placa de Petri que contiene el cultivo VS de la incubadora (paso 5.1.7). Utilizando una aguja de 22 G unida a una jeringa de 6 ml, aspirar el medio que contiene el cultivo y transferirlo a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
    3. Centrifugar durante 5 min a 1.000 xg y 37 ° C.
    4. Mientras tanto, use fórceps estériles para colocar el número requerido de cubreobjetos de vidrio revestidos con poli-D-lisina y laminina en una placa de cultivo de 24 pocillos.
      NOTA: El número de pozos a cultivar depende del tamaño de la muestra; Aproximadamente 24-32 pocillos pueden cultivarse a partir de un tumor de 1 cm3, por lo que para la mayoría de los tumores más pequeños, la planificación para 8-16 pocillos de células cultivadas es apropiada.
    5. Después de la centrifugación, desechar el sobrenadante ( es decir, el medio enriquecido en enzimas) y resuspender el sedimento celular residual en medio DMEM / F-12 suplementado, precalentadoEn el paso 5.2.1.
      NOTA: El volumen en el que resuspender el gránulo está determinado por el número de pozos previsto en el paso 5.2.4, estimando 1 mL de medio por pozo planificado.
    6. Aspirar 2 ml del medio celular resuspendido (paso 5.2.5) usando una pipeta serológica de 5 ml. Depositar 1 ml del medio que contiene células tumorales en cada pocillo preparado de la placa de 24 pocillos.
    7. Continuar aspirando y depositando el medio que contiene células tumorales (aspirando en incrementos de 2 mL, de los cuales se deposita 1 mL en cada pocillo planificado) hasta que la suspensión de células tumorales se divida por igual entre todos los pocillos preparados.
    8. Colocar la placa de 24 pocillos en la incubadora a 37ºC durante la noche.
  3. Día 3
    1. Si se observan desechos significativos en el fondo de los pozos, cambie cuidadosamente el medio en cada pocillo a un nuevo medio de cultivo DMEM / F-12 suplementado, teniendo cuidado de no desalojar las células adherentes. Si no, devuelva la placa a la incubadora y cambie laE media por primera vez el día 5.
  4. Días 5-7 y después
    1. Cambie el medio cada 3 días.
      NOTA: Las células VS y GAN humanas primarias se mantienen generalmente en cultivo hasta su uso en aplicaciones aguas abajo, aproximadamente a los 14 días de edad. La pureza del cultivo disminuye después de este 19 .

6. Cultura primaria del GAN ​​humano

  1. Día 1
    1. Bajo un microscopio de disección, aislar los fascículos del tejido designado para el cultivo de GAN (que ha estado sentado en medio de cultivo, como se describe en el paso 1.2.6).
      1. Aísle los fascículos del epineuro y la vaina fibrosa tirando del perineuro usando el n. 5 mientras pinzas el epineuro con el n. 3 pinzas.
    2. Una vez que los fascículos están suficientemente aislados del epineuro circundante, transferirlos a un nuevo plato de cultivo que contenga 2 ml de nuevo supPlementado.
    3. Cortar los fascículos en segmentos de 1 a 2 mm usando la cuchilla de bisturí.
    4. Pipetear las pequeñas piezas del fascículo y el medio circundante en un tubo de 15 mL que contenga 3 mL de medio de cultivo suplementado fresco, de manera que el volumen total en el tubo de 15 mL sea de 5 mL.
    5. Centrifugar la muestra durante 3 min a 1.000 xg y 25 ° C.
    6. Mientras tanto, preparar un medio de cultivo de células de Schwann en una nueva placa de Petri de 60 mm combinando 4,7 ml de medio DMEM / F-12 suplementado, 250 μl de colagenasa y 50 μl de hialuronidasa, para un volumen final de 5 ml.
      NOTA: Guarde las dos enzimas a -20 ° C; Descongelarlos a temperatura ambiente antes de preparar este medio (paso 1.2.2).
    7. Después de la centrifugación de la muestra, los fascículos se condensarán en un pequeño gránulo en el tubo cónico. Deseche el sobrenadante.
    8. Añadir 2 ml del medio de desintegración enzimática recién hecho (paso 6.1.6) a la pastilla de nervio. Pipeta hacia arriba y dVarias veces para movilizar el tejido y transferirlo a un nuevo plato de cultivo de 60 mm.
    9. Colocar el plato en la incubadora (37 ° C, 5% CO 2 ) durante 20-22 h.
      NOTA: Esta es una incubación más larga de la que se necesita para muestras VS (paso 5.1.7).
  2. Dia 2
    1. Medio DMEM / F-12 suplementado con calor en un baño de agua a 37 ° C.
    2. Utilizando una aguja de 22 G unida a una jeringa de 6 ml, aspirar el medio que contiene el cultivo celular y transferirlo a un nuevo tubo cónico de 15 ml.
    3. Centrifugar durante 5 min a 1.000 xg y 37 ° C.
    4. Deseche el sobrenadante y resuspenda la muestra en medio de cultivo DMEM / F-12 suplementado, previamente calentado y suplementado.
    5. Utilice fórceps estériles para colocar el número requerido de cubreobjetos recubiertos en los pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos.
      NOTA: El cálculo de dos pocillos de células cultivadas por espécimen del nervio de 1 cm promueve un crecimiento robusto del cultivo.
    6. Añadir 1 ml del medio que contiene el cultivo a cadaDesignado bien en la placa de 24 pocillos.
    7. Colocar la placa de 24 pocillos en la incubadora a 37 ° C y 5% de CO 2 .
  3. Día 3
    1. Si se observan restos significativos en los pozos, sustituir cuidadosamente el medio con nuevo medio de cultivo DMEM / F-12 suplementado, teniendo cuidado de no desalojar las células adherentes. Si no es así, devuelva la placa a la incubadora y cambie el medio por primera vez el día 5.
  4. Días 5-7 y después
    1. Cambie el medio cada 3 días.

7. Fijación de tejidos VS & GAN

  1. Pipetear 1-1,2 ml de paraformaldehído al 4% (PFA, PRECAUCIÓN) en un nuevo tubo de 1,5 ml.
  2. Después de lavar el tumor o el nervio con PBS (paso 1.2.3), transferir un trozo pequeño de tejido (aproximadamente 3 mm3 de VS o 5 mm de longitud de GAN) en PFA al 4% y colocar el tubo en un agitador a 4 ° DO. Asegúrese de que la muestra esté completamente sumergida en tLa solución.
  3. Después de al menos 2 h de fijación, extraer el tubo del agitador y continuar con el procesamiento posterior ( por ejemplo, incrustación en parafina o compuesto óptimo de temperatura de corte (OCT) para inmunohistoquímica o inmunofluorescencia subsiguiente) 22 , 23 , 24 . Alternativamente, el tejido puede ser congelado instantáneamente, como se ha descrito previamente 25 , 26 .

8. Recolección y almacenamiento de perilinfa humana durante la resección de Translabyrinthine VS

  1. Coloque tres tubos estériles de 1,5 ml en hielo.
    NOTA: Un tubo será guardado como respaldo en caso de contaminación.
  2. Llenar un tubo de 1,5 ml con aproximadamente 1,2 ml de solución de PBS que se ha filtrado dos veces con un filtro de 0,22 μm.
    NOTA: Para recolectar perilinfa durante una resección translabiríntica VS, el cirujano debe primero asegurarse de que el surgiEl campo calórico está libre de polvo óseo, sangre o solución salina. El cirujano puede usar un tubo de succión Schuknecht 21 ó 24 G en la mano no dominante para este propósito.
    Un lugar típico desde el cual extraer el perilinfo es el canal semicircular lateral (sin embargo, también se puede acceder al canal semicircular posterior oa la membrana de la ventana redonda, dependiendo de la preferencia del cirujano). El cirujano debe retirar cuidadosamente el hueso laberíntico con una fresa de diamante (mientras usa irrigación continua por succión) para identificar la línea azul ( es decir, el laberinto membranoso) del canal semicircular. El canal semicircular se penetra a través de la línea azul usando una aguja larga de 27 G unida a una jeringuilla de tuberculina de 1 ml.
  3. Pida al cirujano que aspire suavemente una pequeña cantidad de perilinfa y luego pase la jeringa y la aguja adjunta a la enfermera quirúrgica.
    NOTA: Normalmente, se recoge una gota de perilinf o menos. Si el volumen observado es mayor, es probable que la muestra se contamine con otros fLuis
  4. Abra el tubo vacío de 1,5 ml preparado y el tubo lleno de PBS directamente antes de su uso. Tenga cuidado de no tocar el interior de las tapas del tubo mientras las abre.
  5. Recibir la jeringa y la aguja adjunta de la enfermera quirúrgica y purgar el líquido completamente en el tubo vacío, teniendo cuidado de no tocar el tubo con la aguja.
  6. Desprenda cuidadosamente la aguja de la jeringa. No contamine la punta de la aguja, y continúe sosteniéndola en una mano.
    NOTA: Se ha recolectado un volumen muy pequeño de perilinfa, por lo que puede quedar algún líquido en la punta larga de la aguja.
  7. Con la otra mano, use la jeringa en sí (sin la aguja) para succionar 0,2 ml de solución de PBS filtrada desde el tubo preparado en el cuerpo de la jeringa.
  8. Vuelva a colocar la aguja en la jeringa. Evacuar completamente la jeringa dentro del tubo que contiene perilinfa, usando el PBS estéril para limpiar la punta de la aguja.
  9. Cierre el tubo que contiene perilimina y PBS y coloque En hielo
  10. Deseche la aguja en un contenedor de objetos punzocortantes.
  11. Coloque el tubo que contiene perilymph en el congelador de -80 ° C tan pronto como sea posible.

9. Recolección y almacenamiento de CSF humano

  1. Coloque tres (o más) tubos estériles de 1,5 ml en hielo.
    NOTA: Un tubo será una copia de seguridad en caso de contaminación o un volumen de muestra que es mayor de lo esperado.
  2. Después de abrir la duramadre, pídale al cirujano que recoja el LCR con una jeringa de 3 ml (sin una aguja adjunta).
    NOTA: Para prevenir la contaminación, la recolección de LCR debe realizarse inmediatamente después de la apertura de la duramadre.
  3. Pida al cirujano que entregue la jeringa a la enfermera quirúrgica.
  4. Recibir la jeringa de la enfermera quirúrgica y evacuar completamente el volumen requerido de LCR en el (los) tubo (s).
  5. Cierre el (los) tubo (s) y colóquelos en hielo.
  6. Coloque el (los) tubo (s) en el congelador de -80 ° C tan pronto como sea posible.
E "> 10. Experimentos de transducción viral para células VS primarias

  1. Utilizando la concentración del stock viral como referencia, calcule el número de recuento del genoma (gc) y la multiplicidad de infección (MOI) necesarios para el experimento de transducción propuesto; Virus se puede diluir directamente en medio de cultivo suplementado.
    NOTA: Se puede usar cualquier vector viral adecuado para la transducción de células primarias; Véase Landegger et al. (2017) para una comparación detallada de seis diferentes serotipos de virus adeno-asociados [ 27] . Además, cuando se cultivan células humanas primarias, los recuentos de células no se determinan típicamente antes de depositarlas sobre cubreobjetos. Las células VS primarias no responden bien a tripsinización y pasaje, por lo que para un cálculo fiable de MOI, el número de células adherentes por pocillo puede estimarse usando un microscopio de contraste de fase. Alternativamente, si las células están cerca de la confluencia, sus números pueden estimarse de forma fiable utilizando valores de densidad de células estándares paraUna placa de 24 pocillos ( por ejemplo, 5 x 104 células por pocillo).
  2. Bajo una campana de flujo laminar, se prepara un medio suplementado que contiene la cantidad deseada de virus en un tubo de laboratorio cónico de 15 ml, de manera que se prepara 1 ml de medio que contiene virus para cada pocillo de células a transducir. Pipetee el medio que contiene el virus hacia arriba y hacia abajo para mezclar suavemente pero a fondo.
  3. Usando fórceps estériles, transfiera los cubreobjetos que contienen las células VS primarias (paso 5.2.8) de la placa original de 24 pocillos a una nueva placa de 24 pocillos. Después de la transferencia de cada cubreobjetos, agregue 1 mL de medio que contenga virus. Remueva la placa cada vez que se añade medio para asegurar que las células estén recubiertas uniformemente con el virus.
  4. Incubar a 37 ° C y 5% de CO 2 durante la duración del experimento previsto.
    NOTA: Las incubaciones que van desde 48-120 h han mostrado resultados prometedores de transducción [ 27] .

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Resultados

Las células VS humanas primarias en cultivo, como se establece en la sección 5, pueden tratarse como modelos informativos para procesos asociados a enfermedades en muchas aplicaciones de investigación posteriores ( Figura 1 ). Las células sanas de Schwann cultivadas en la sección 6 proporcionan un punto de comparación directo e instructivo. Como se describe a continuación, los datos extensos de VSs y GANs procesados ​​de acuerdo con este marco metodológico u...

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Discusión

Este manuscrito describe un marco metodológico unificado para la investigación VS, que describe el procesamiento simultáneo de especímenes humanos VS y GAN para aplicaciones de investigación aguas abajo. A medida que la investigación VS entra en la era de la medicina de precisión, la preparación de la misma muestra en formas capaces de responder a numerosas preguntas de investigación permitirá el descubrimiento de los conocimientos moleculares, celulares, genéticos y proteómicos específicos de cada paciente.

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Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Instituto Nacional de Sordera y otros trastornos de la comunicación subvenciones R01DC015824 (KMS) y T32DC00038 (apoyo JES y SD), el Departamento de Defensa W81XWH-14-1-0091 (KMS), la Fundación Bertarelli (KMS) , La Fundación Nancy Sayles Day (KMS), el Lauer Tinnitus Research Center (KMS) y la Fundación Barnes (KMS).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
BioCoat Poly-D-Lisina/Laminina 12 mm #1 Cubreobjetos de vidrio alemánCorning354087O prepare cubreobjetos con Corning Laminin (CB-40232) y Cultrex Poly-L-Lisine (3438-100-01)
CELLSTAR 15 mL Tubos de Centrífuga, Fondo Cónico, Graduación, Greiner EstérilBio-One188161
CELLSTAR 50 mL Tubos de Centrífuga, Fondo Cónico, Graduación, EstérilGreiner Bio-One227261
CELLSTAR Placa de cultivo celular, 60 mmGreiner Bio-One628160
Colagenasa de Clostridium histolyticum,Sigma-AldrichC1639
Costar 24 pocillos transparentes Placas de pocillos múltiples tratadas con TC, estérilesCorning3526
DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol, diclorhidrato)Thermo Fisher ScientificD1306
DMEM, glucosa alta, piruvato, sin glutamina, 500 mLThermo Fisher Scientific10313-039
DMEM/F-12, 500 mLThermo Fisher Scientific11320-033
Pinzas Dumont #3, DumoxelFine Science Tools11231-30Autoclave antes de usar
Pinzas Dumont #5, punta estándar, autoclave InoxFine Science Tools11251-20antes de usar
Suero fetal bovino, calificado, regiones aprobadas por el USDA, 500 mLThermo Fisher Scientific10437-028Alícuota en tubos de 50 mL y almacenamiento en -20 grados; C congelador
Hialuronidasa de Testículos Bovinos, Tipo I-S, Polvo LiofilizadoSigma-AldrichH3506
Millex-GP Unidad de Filtro de Jeringa, 0.22 µ m, polietersulfona, 33 mm, estérilEMD MilliporeSLGP033RS
Paraformaldehído, grado reactivo, cristalinoSigma-AldrichP6148Antes de usar: Establecer Procedimientos Operativos Estándar basados en protocolos disponibles en línea
PBS, pH 7.4, 500 mLThermo Fisher Scientific10010-023Autoclave antes de usar
Penicilina-estreptomicina (10,000 U/mL), 100 mLThermo Fisher Scientific15140-122
PhosSTOP Tabletas Inhibidoras de la FosfatasaRoche04906845001
Pierce Tabletas Inhibidoras de la Proteasa ThermoFisher Scientific88666
Pipetas y puntas de pipeta, 5/10/25 mLVariableVariable
Triturador de homogeneización de plástico para microtubos de 1,5/2,0 mL E& K ScientificEK-10539
Agujas PrecisionGlide, 27 G x 1 1/2 pulgadasBD301629
Tampón RIPABoston BioProductsBP-115
RNAlater (solución de estabilización de ARN)Thermo Fisher ScientificAM7021
Tubos de microcentrífuga con cierre seguro, polipropileno, 0,5 mlAutoclave de 022363719 Eppendorfantes de usar
Tubos de microcentrífuga Safe-Lock, polipropileno, 1,5 mLAutoclave Eppendorf022363204 antes de usar
solución salina - Inyección de cloruro de sodio al 0,9%, bacteriostático, 20 mLHospira0409-1966-05
Hojas de bisturí - #15Fine Science Tools10015-00
Schuknecht Tubo de succión calibre 24Bausch + LombN1698 42Útil para el abordaje quirúrgico (además de los instrumentos quirúrgicos otológicos comunes) y p. ej. un marcador quirúrgico azul
Contenedor de muestras, OR estéril, 4OZMedlineDYND30331H
Stemi 2000-C Microscopio estereoscópicoZeiss000000-1106-133
Combinación de jeringa/aguja, punta Luer-Lok, 5 mL, 22 g x 1 pulg.BD309630
Jeringa de tuberculina solamente, punta deslizante, 1 mLBD309659
Jeringa de tuberculina solamente, punta deslizante, 3 mLBD309656
Homogeneizador ultrasónico, serie 4710, sonda CV18Cole-ParmerCP25013

Referencias

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