Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Cancer Research
Click here for the English version

Cancer Research

Et enhetlig metodologisk rammeverk for Vestibular Schwannoma Research

Published: June 20, 2017 doi: 10.3791/55827
Automatic Translation
*1,2,3, *1,4, 1,4, 1,2, 1,2, 1,2,4
1Eaton Peabody Laboratories, Department of Otolaryngology, Massachusetts Eye and Ear, 2Department of Otolaryngology, Harvard Medical School, 3Department of Otolaryngology, Vienna General Hospital, Medical University of Vienna, 4Program in Speech and Hearing Bioscience and Technology, Harvard Medical School
* These authors contributed equally

Summary

Målet med denne protokollen er å skissere samlingen og behandlingen av menneskelige kirurgiske prøver for flere nedstrømsapplikasjoner i vestibulær schwannom og Schwann-cellforskning.

Abstract

Vestibulære schwannomer er de vanligste neoplasmaene i cerebellopontinvinkelen, og utgjør 6-8% av alle intrakranielle vekst. Selv om disse svulstene forårsaker sensorineuralt hørselstap i opptil 95% av de berørte individer, forblir de molekylære mekanismene som ligger til grunn for dette hørselstapet unnvikende. Denne artikkelen skisserer trinnene etablert i vårt laboratorium for å lette oppsamlingen og behandlingen av forskjellige primære humane vevsprøver for nedstrøms forskningsapplikasjoner integrert i studiet av vestibulære schwannomer. Spesielt beskriver dette arbeidet et enhetlig metodologisk rammeverk for innsamling, behandling og kultur av Schwann- og schwannomaceller fra kirurgiske prøver. Dette er integrert med parallelle behandlingsstrinn som nå anses som essensielt for dagens forskning: innsamling av svulst- og nervesekresjoner, bevaring av RNA og ekstraksjon av protein fra oppsamlede vev, fiksering av vev for fremstilling av seksjoner, enD eksponering av primære humane celler til adeno-assosierte virus for anvendelse på genterapi. I tillegg fremhever dette arbeidet den translabyrintiske kirurgiske tilnærmingen for å samle denne svulsten som en unik mulighet til å skaffe menneskelig sensorisk epitel fra indre øre og perilimf. Tips for å forbedre eksperimentell kvalitet er gitt og vanlige fallgruver uthevet.

Introduction

Vestibulære schwannomer (VS) er de vanligste neoplasmaene i cerebellopontinvinkelen, diagnostisert hos 1 av hver 100.000 individer. Selv om ikke-metastatisk, påvirker disse svulstene alvorlig pasientens livskvalitet 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Berørte personer lever vanligvis med hørselstap, tinnitus og en følelse av lydstyrke. Symptomene blir stadig svekkende som tumoren vokser, forårsaker balanseproblemer, ansiktslammelse og svekkelse av andre kraniale nervefunksjoner. Livstruende komplikasjoner på grunn av hjernestamkompresjon kan også følge 7 .

Administrasjonsmuligheter for VS er i hovedsak begrenset til vaktfull venter på statiske svulster og stereotaktisk strålebehandling eller kirurgisk reseksjon for voksende svulster

Fordi VS oppstår fra en perifer sensorisk nerve ( dvs. vestibulærnerven), er det viktig å sammenligne VS-assosierte observasjoner med de som er avledet fra en passende kontrollnerve, slik som den menneskelige store auricularnerven (GAN). Sunn GAN blir regelmessig ofret under parotidektomi eller nakke-disseksjoner og kan brukes som robuste modeller for sunn Schwann-cellefysiologi 9 .

Fordi det ikke finnes FDA-godkjente stoffer for behandling eller forebygging av sporadisk VS, er det avgjørende at forskere belyser den underliggende molekylære mechaNismer av sykdommen for å identifisere terapeutiske mål. Proteiner som har vist seg å spille en rolle i VS-patogenesen inkluderer merlin, vaskulær endotelvekstfaktor (VEGF), cyklooksygenase 2 (COX-2), nukleær faktor kappa B (NF-KB), tumornekrosefaktor alfa (TNF-alfa) , Epidermal vekstfaktorreseptor (EGFR) og tilhørende signalmolekyler 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .

Nylige fremskritt har utvidet og forbedret protokoller for innsamling, behandling, kultur og nedstrøms undersøkelse av primære humane vestibulære schwannomer og friske nervevev 18 , 19 . Imidlertid er de fleste eksisterende protokoller designet for å imøtekomme preparatetAtion av slike vev for en enkelt nedstrøms forskningsapplikasjon ( dvs. cellekultur alene). Denne artikkelen presenterer et enhetlig metodologisk rammeverk for samtidig behandling av en enkelt primær menneskelig VS- eller GAN-prøve for flere nedstrømsapplikasjoner: celletypespesifikk kultur, proteinutvinning, RNA-bevaring, svulstsekresjonsoppsamling og vevfiksering. Dette arbeidet beskriver også kirurgisk innsamling og behandling av human cerebrospinalvæske (CSF) og perilimf under translabyrint VS-reseksjon, da disse nært besluttede vevene kan tjene som viktige kilder til biomarkører for VS. Endelig presenterer denne protokollen trinn for viral transduksjon av primære humane VS-celler i kultur som en ny anvendelse av dette vevet for bruk i genterapi.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Skriftlig informert samtykke til innsamling av alle prøver ble oppnådd før operasjonen, og forsøkene ble utført i henhold til etikkloven fra Verdens medisinske forening (Helsinki-erklæringen). Alle deler av studieprotokollen ble godkjent av den institusjonelle gjennomgangskomiteen i Massachusetts Eye and Ear og Massachusetts General Hospital.

MERK: Seksjonene 1-7 nedenfor er konstruert for å bli utført i rekkefølge ved mottak av en primær human VS eller GAN-prøve fra operasjonen. Behandlingen bør alltid begynne med avsnitt 1. Da bør RNA som regel opprettholdes først (seksjon 2), etterfulgt av preparering av vev for samling av sekresjoner (seksjon 3) og proteinutvinning (avsnitt 4). Vev som skal dyrkes (seksjon 5 for VS, seksjon 6 for GAN) kan sitte i supplert dyrkningsmedium mens seksjoner 2, 3 og 4 utføres. Fiksering av vev for snitting (seksjon 7) er veldig kort og cEn utføres under et sentrifugeringstrinn. Seksjon 8 (behandling av perilimf) og avsnitt 9 (CSF-behandling) kan utføres ved mottak av perilymf eller CSF fra operasjonsrommet under en translabyrintisk VS reseksjon. Seksjon 10 (viral transduksjon) kan utføres på voksende VS eller Schwann celler i kultur.

1. Forberedelse og mottak av en kirurgisk prøve

MERK: Følgende trinn skal utføres i et sterilt miljø, for eksempel en vevskulturhette eller laminarflytende hette. Kjennskap til grunnleggende steril teknikk forventes.

  1. Fremstilling av medium for primær human VS eller Schwann cellekultur
    1. Tør en 50 ml alikvot av frosset føtalt bovint serum (FBS) i et 37 ° C vannbad.
    2. Tilsett 5 ml penicillin / streptomycinblanding til en 500 ml flaske DMEM / F-12, noe som resulterer i en endelig fortynning på 1: 100.
    3. Tilsett 50 ml opptining FBS til 500 ml flaske DMEM / F-12,Resulterende i en endelig fortynning på 1:10.
    4. Skriv datoen, forskerens initialer og tilleggsinformasjon ( f.eks. 1% P / S, 10% FBS) på flasken.
    5. Sett det nye kulturmediet i kjøleskapet (4 ° C).
  2. Kvittering og rensing av VS eller GAN-prøven
    1. I operasjonsrommet, plasser den nyoppsamlede VS- eller GAN-prøven i steril saltløsning i en prøvebeholder. Transport prøven på is fra operasjonsrommet til en laminær hette i laboratoriet.
      MERK: Prøvestørrelser og vekter varierer vesentlig mellom pasientene basert på størrelsen på den aktuelle svulsten eller mengden av utskåret nerve.
    2. Fjern alikvoter av hyaluronidase (25 000 U / mL) og kollagenase (3 200 U / ml) fra fryseren og la enzymene tine ved romtemperatur (kreves for trinn 5.1.4 eller 6.1.6, avhengig av om prøven er En VS eller en GAN).
      MERK: Resuspenningen av lyofiliserte enzymer iS beskrevet i detalj på produktdatabladene. Kollagenase kan resuspenderes i en hvilken som helst kalsiumfri balansert saltløsning og hyaluronidase i en oppløsning av 0,02 M fosfatbuffer (pH 7,0), 77 mM NaCl og 0,01% 1 mg / ml bovint serumalbumin. Den spesifikke aktiviteten for hvert lyofilisert enzym varierer med partiet og bør verifiseres før resuspensjon.
    3. Ved å bruke en serie på tre 1,5 ml rør fylt med 1,4 ml 1x sterilt PBS, vask VS eller GAN-prøven tre ganger. Forsiktig overfør prøven fra rør til rør med sterile tang. Lukk hvert rør når det inneholder prøven, og rist forsiktig for å vaske.
      MERK: For å unngå oversvømmelse av 1,5 ml rør, kan mindre enn 1,4 ml PBS brukes per rør hvis svulstestykket er stort.
    4. Sett prøven i en tørr 60 mm petriskål og bruk tetninger for å fjerne alt dødt vev ( dvs. kauteriserte porsjoner, som vanligvis er hvite eller ugjennomsiktige i fargen) og områder med fremtredende blodkar.
    5. Bruk fOrceps eller et skalpellblad for å dele prøven i separate stykker for RNA-konservering, proteinutvinning, sekresjonsoppsamling, fiksering og cellekultur (se avsnitt 2 - 6 nedenfor).
    6. Overfør stykket av prøven angitt for cellekultur (seksjon 5/6) til en ny 60 mm kultiveringsskål inneholdende 5-8 ml kaldt, supplert DMEM / F-12 medium (alternativt kan lokket til den første dyrkningsskålen være Brukt til dette trinnet).
      MERK: Mengden DMEM / F-12-medium som trengs (fra trinn 1.1) vil avhenge av størrelsen på svulsten eller nerven, men den skal falle mellom 5 og 8 ml. Dette stykket kan sitte i kulturmedium mens de etterfølgende trinnene utføres.

2. RNA-bevaring av VS og GAN-væv (også gyldig for menneskelig sensorisk epitel)

  1. Under laminarstrømshetten overfør 1-1,2 ml RNA-stabiliseringsløsning til et nytt 1,5 ml rør.
  2. Etter å vaske prøven med PBS (trinn 1.2.3), dypp kort den lille kakenCe av vev utpekt for RNA-bevaring (ca. 3 mm3 VS eller en 5 mm lengde av GAN) i RNA-stabiliseringsoppløsningen. Kontroller at prøven er helt nedsenket i løsningen.
  3. Klargjør og merk et nytt 1,5 ml rør. Hent prøven fra RNA-stabiliseringsløsningen, overfør den til det nye røret og lagre det i en -80 ° C fryser.

3. Samling av VS- og GAN-sekreteringene

  1. Dag 1
    1. Etter vask av prøven med PBS (trinn 1.2.3), plasser stykket VS eller GAN utpekt for oppsamling av sekresjoner i et tomt 1,5 ml rør.
    2. Forbered to ytterligere 1,5 ml rør og pipett 500 μL DMEM (ikke supplert med FBS) i hvert rør.
      MERK: Det første røret med DMEM vil bli brukt til å samle svulstekretsen, og det andre røret av DMEM vil fungere som en kontrollert kontroll. Sekretisjoner kan samles inn i DMEM, noe annet typisk kulturmedium ikkeSupplert med serum eller PBS.
    3. Plasser et av DMEM-holdige rør på en kalibrert digital skala. Tør skalaen slik at når røret sitter på skalaen, leser det 0 mg.
    4. Fjern rør av DMEM fra skalaen, plasser prøven som er angitt for innsamling av sekresjoner i røret, og veie den. Legg merke til resultatet, som vil representere vekten av vevet alene.
    5. Juster volumet av DMEM i røret under en laminarstrømshett til 100 μl per 10 mg prøve.
    6. Plasser røret som inneholder vevsprøven og dens matchende kontroll (DMEM alene) i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2) i en periode som er i overensstemmelse med planene for dette eksperimentet. Inkuber vevet i minst 72 timer for å samle biologisk nyttige mengder av svulster eller nervesekresjoner 15 .
  2. Dag 4
    1. Etter inkubering i 72 timer, fjern det sekresjonsholdige mediet fraPrøve ( dvs. væskekondensert medium) ved hjelp av en 1 ml pipette. For å hindre gjentatte fryse-tine-sykluser, alikvote mediet inn i nye rør i henhold til planlagte nedstrømsanalyser (for eksempel å kjøre en ELISA med 4 brønner som krever 50 μL hver, kan alikvoter på 210 μl fremstilles).
    2. Hvis nødvendig, frys det gjenværende vevstykket i originalrøret (allerede merket på dag 1) ved -80 ° C for ytterligere analyser, slik som DNA-ekstraksjon, på et senere tidspunkt.
    3. Oppbevar vev, sekreter og kontroll DMEM i en -80 ° C fryser inntil nedstrømsapplikasjoner startes ( f.eks. ELISA, LC-MS / MS, cytokin-arrays, etc. ).

4. Proteinekstraksjon fra VS eller GAN Tissue

  1. Fremstilling av forsterket RIPA buffer
    1. Legg til en tablett av fosfataseinhibitor og en tablett proteaseinhibitor til 10 ml RIPA-buffer i et 15 ml rør; Dette er styrketRIPA buffer.
      MERK: Oppbevar RIPA-bufferen ved 4 ° C og legg til nettbrettene rett før bruk.
  2. Proteinekstraksjon
    1. Overfør 210 μl forsterket RIPA buffer (trinn 4.1.1) til et nytt 1,5 ml rør.
    2. Etter vasking av prøven med PBS (trinn 1.2.3), overfør det lille stykket vev utpekt for proteinutvinning (ca. 3 mm3 VS eller en 5 mm lengde av GAN) til RIPA-bufferholdig rør og legg den på is I minst 10 min. Hvis du studerer fosforylerte former av proteiner, fyll RIPA-bufferen med protease- og fosfataseinhibitorer 14 . I mellomtiden kan trinn for andre komponenter i vevsbehandlingen, slik som fiksering (seksjon 7), utføres.
    3. Forkjøl sentrifugen til 4 ° C.
    4. Bruk en plastpestel, homogeniser vevet i RIPA-bufferholdig rør. Sonikere vevet i 10-15 s ved 20% amplitude. Kontroller at prøvenForbli på is, selv under sonikering.
    5. Sentrifuger i 10 minutter ved 15.000 xg og 4 ° C.
    6. Aliquot supernatanten i trinn på 50 μl i nye 0,5 ml rør (avhengig av de tilsiktede nedstrømsapplikasjoner, kan en hvilken som helst inkrementstørrelse velges).
    7. Oppbevar alikvoter av proteinlysat i en -80 ° C fryser til nedstrømsapplikasjonene er initiert ( f.eks. ELISA eller Western blots) 20 , 21 .

5. Primær menneskelig VS-kultur

  1. Dag 1
    1. Separat VS-vevet betegnet for cellekultur (som har sittet i dyrkningsmedium, som beskrevet i trinn 1.2.6) i ca. 1 mm 3 stykker ved å bruke et par tang i hver hånd.
    2. Aspirer det svulststykkeholdige mediet med en 10 ml serologisk pipette og overfør alt innhold til et 15 ml konisk rør.
    3. Sentrifuger i 3 min på1000 xg og 25 ° C.
    4. Tilbered desintegreringsmedium i en ny 60 mm kultiveringsskål ved å kombinere 4,7 ml supplert DMEM / F-12 medium med 250 μl kollagenase (sluttkonsentrasjon: 160 U / ml) og 50 μl hyaluronidase (sluttkonsentrasjon: 250 U / ml) , For et sluttvolum på 5 ml.
      MERK: Begge enzymer skal lagres i en -20 ° C fryser, men opptining før preparering av dette mediet (trinn 1.2.2).
    5. Etter sentrifugering vil svulstykkene danne en pelleter i bunnen av det koniske rør. Pipett forsiktig og kast supernatanten.
    6. Tilsett 2 ml det nyopprettede enzymholdige desintegreringsmediet (trinn 5.1.4) til tumorpellet. Pipetter opp og ned flere ganger for å mobilisere vevet og overføre svulstestykket som inneholder medium til 60 mm kulturretten.
    7. Plasser kulturretten i inkubatoren (37 ° C, 5% CO2) i 18 timer.
  2. Dag 2
    1. Varm DMEM / F-12 medium tilsatt 10% FBS og 1% penicillin / streptomycin (fremstilt i trinn 1.1) i et 37 ° C vannbad.
    2. Fjern petriskålen som inneholder VS-kulturen fra inkubatoren (trinn 5.1.7). Bruk en 22 G-nål festet til en 6 ml sprøyte, aspirer det kulturholdige mediet og overfør det til et nytt 15 ml konisk rør.
    3. Sentrifuger i 5 minutter ved 1000 xg og 37 ° C.
    4. I mellomtiden bruk sterile pincett til å plassere det nødvendige antall poly-D-lysin- og lamininbelagte glassdeksler i en 24-brønn kulturplate.
      MERK: Antall brønner som skal dyrkes, avhenger av størrelsen på prøven; Omtrent 24-32 brønner kan dyrkes fra en 1 cm 3 tumor, så for de fleste mindre svulster er planlegging for 8-16 brønner av dyrkede celler passende.
    5. Etter sentrifugering kasseres supernatanten ( dvs. enzymberiket medium) og resuspender gjenværende cellepellet i fersk, supplerende DMEM / F-12 medium, forvarmeEd i trinn 5.2.1.
      MERK: Volumet for å resuspendere pelleten bestemmes av antall brønner planlagt i trinn 5.2.4, estimering av 1 ml medium per planlagt brønn.
    6. Aspirer 2 ml resuspendert cellemedium (trinn 5.2.5) ved bruk av en 5 ml serologisk pipette. Innsett 1 ml av tumorcelleholdig medium i hver preparert brønn i 24-brønnplaten.
    7. Fortsett aspirering og avsetting av tumorcelleholdig medium (aspirering i trinn på 2 ml, hvorav 1 ml avsettes i hver planlagt brønn) til svulstcellesuspensjonen er like delt mellom alle preparerte brønner.
    8. Plasser 24-brønnsplaten i 37 ° C inkubatoren over natten.
  3. Dag 3
    1. Hvis det oppdages vesentlig rusk på bunnen av brønnene, bytt forsiktig mediet i hver brønn til nytt, tilsatt DMEM / F-12 dyrkningsmedium, og vær forsiktig så du ikke løsner adherente celler. Hvis ikke, returner platen til inkubatoren og bytt denE medium for første gang på dag 5.
  4. Dager 5-7 og etterpå
    1. Bytt mediet hver tredje dag.
      MERK: Primær menneskelige VS- og GAN-celler holdes generelt i kultur til bruk i nedstrømsapplikasjoner, ved eller rundt 14 dager. Kulturrenheten minker etter dette 19 .

6. Primær human GAN-kultur

  1. Dag 1
    1. Under et disseksjonsmikroskop isolerer fascikler fra vevet som er utpekt for GAN-kulturen (som har sittet i kulturmedium, som beskrevet i trinn 1.2.6).
      1. Isoler fasciklene fra epineurium og fibrøs skjede ved å trekke på perineurium ved å bruke nr. 5 pincet mens clasping epineurium med nr. 3 tanger.
    2. Når fasciklene er tilstrekkelig isolert fra det omkringliggende epineurium, overfør dem til en ny kulturrett som inneholder 2 ml frisk suppPlemented medium.
    3. Klipp fargene i 1 til 2 mm segmenter ved hjelp av skalpellbladet.
    4. Pipett de små fiksjonsstykkene og omgivende medium inn i et 15 ml rør som inneholder 3 ml frisk tilsatt dyrkningsmedium, slik at totalvolumet i 15 ml rør blir 5 ml.
    5. Sentrifuger prøven i 3 minutter ved 1000 xg og 25 ° C.
    6. I mellomtiden lager du et Schwann-celledyrkningsmedium i en ny 60 mm petriskål ved å kombinere 4,7 ml supplert DMEM / F-12 medium, 250 μl kollagenase og 50 μl hyaluronidase, for et sluttvolum på 5 ml.
      MERK: Oppbevar begge enzymer ved -20 ° C; Tine dem ved romtemperatur før du preparerer dette mediet (trinn 1.2.2).
    7. Etter sentrifugering av prøven vil kondensene kondensere til en liten pellet i det koniske rør. Kast supernatanten.
    8. Tilsett 2 ml av det nyopprettede enzymholdige desintegreringsmediet (trinn 6.1.6) til nervepellet. Pipetter opp og dEier flere ganger for å mobilisere vevet og overføre det til en ny 60 mm kulturrett.
    9. Plasser parabolen i inkubatoren (37 ° C, 5% CO 2 ) i 20-22 timer.
      MERK: Dette er en lengre inkubasjon enn det er nødvendig for VS-prøver (trinn 5.1.7).
  2. Dag 2
    1. Varmt tilsatt DMEM / F-12 medium i et 37 ° C vannbad.
    2. Ved hjelp av en 22 G-nål festet til en 6 ml sprøyte, aspirere det cellekulturholdige mediet og overfør det til et nytt 15 ml konisk rør.
    3. Sentrifuger i 5 minutter ved 1000 xg og 37 ° C.
    4. Kast supernatanten og resuspender prøven i nytt, forvarmet, supplert DMEM / F-12 dyrkningsmedium.
    5. Bruk sterile pincett til å plassere det nødvendige antall belagte dekselplater inn i brønnene på en 24-brønn kulturplate.
      MERK: Beregning av to brønner av dyrkede celler pr. 1 cm nerveprøve fremmer robust kulturvekst.
    6. Tilsett 1 ml av det kulturholdige mediet til hverUtpekt godt i 24-brønnsplaten.
    7. Plasser 24-brønnsplaten i inkubatoren ved 37 ° C og 5% CO2.
  3. Dag 3
    1. Hvis det oppdages vesentlig rusk i brønnene, bytt forsiktig mediet med nytt tilsatt DMEM / F-12 dyrkningsmedium, pass på å ikke løsne adherente celler. Hvis ikke, returner platen til inkubatoren og bytt mediet for første gang på dag 5.
  4. Dager 5-7 og etterpå
    1. Bytt mediet hver tredje dag.

7. VS & GAN Tissue Fixation

  1. Pipette 1-1.2 ml 4% paraformaldehyd (PFA; CAUTION) i et nytt 1,5 ml rør.
  2. Etter vask av svulst eller nerve med PBS (trinn 1.2.3), overfør et lite stykke vev (ca. 3 mm 3 VS eller en 5 mm lengde av GAN) til 4% PFA og rør røret på en rister ved 4 ° C. Kontroller at prøven er helt nedsenket i tHan løsning.
  3. Etter minst 2 timers fiksering, hent røret fra risten og fortsett med videre behandling ( f.eks. Innfelling i paraffin eller optimal skjæringstemperaturforbindelse (OCT) for etterfølgende immunhistokjemi eller immunfluorescens) 22 , 23 , 24 . Alternativt kan vevet bli frosset, som tidligere beskrevet 25 , 26 .

8. Innsamling og lagring av human perilymph under translabyrintisk VS reseksjon

  1. Plasser tre sterile 1,5 ml rør på is.
    MERK: Ett rør holdes som sikkerhetskopi ved forurensning.
  2. Fyll ett 1,5 ml rør med ca. 1,2 ml PBS-oppløsning som har blitt filtrert to ganger ved hjelp av et 0,22 μm filter.
    MERK: For å samle perilimf under en transabsorbent VS-reseksjon, må kirurgen først sørge for at surgiCal-feltet er fri for benstøv, blod eller saltvann. Kirurgen kan bruke et Schuknecht 21 eller 24 G sugeslange i den ikke-dominerende hånden til dette formålet.
    Et typisk sted for å trekke ut perilimf er den laterale halvcirkelformede kanalen (det kan imidlertid også benyttes den bakre halvcirkelformede kanalen eller rundt vindumembranen, avhengig av kirurgens preferanse). Kirurgen bør nøye fjerne det labyrintiske beinet med en diamantbur (ved bruk av kontinuerlig suging vanning) for å identifisere den blå linjen ( dvs. den membranøse labyrinten) i halvcirkelformet kanal. Den halvcirkelformede kanalen trengs gjennom den blå linjen ved hjelp av en lang 27 G nål festet til en 1 ml tuberkulinsprøyte.
  3. Be kirurgen om å forsiktig aspirere en liten mengde perilimf og deretter passere sprøyten og påsatt nål til kirurgisk sykepleier.
    MERK: Vanligvis oppsamles en dråpe perilymph eller mindre. Hvis det observerte volumet er større, er prøven sannsynligvis forurenset med andre fluid.
  4. Åpne det preparerte, tomme 1,5 ml røret og røret fylt med PBS direkte før bruk. Vær forsiktig så du ikke berører innsiden av rørlokkene mens du åpner dem.
  5. Motta sprøyten og påsatt nål fra kirurgisk sykepleier og rens væsken helt inn i det tomme røret, pass på å ikke røre selve røret med nålen.
  6. Fjern forsiktig nålen fra sprøyten. Ikke forurens nålespissen, og fortsett å holde den i en hånd.
    MERK: Et meget lite volum perilymph er blitt samlet, slik at noe væske kan forbli i den lange spissen av nålen.
  7. På den annen side, bruk sprøyten selv (uten nålen) til å suge 0,2 ml filtrert PBS-løsning fra det tilberedte rør inn i sprøytekroppen.
  8. Fest nålen til sprøyten. Evakuer sprøyten helt inn i røret som inneholder perilymph, ved hjelp av det sterile PBS for å spyle nålespissen.
  9. Lukk perilymph- og PBS-holdig rør og plasser Det på is.
  10. Kast nålen i en skarp beholder.
  11. Plasser røret som inneholder perilymph i -80 ° C fryseren så snart som mulig.

9. Innsamling og lagring av human CSF

  1. Plasser tre (eller flere) sterile 1,5 ml rør på is.
    MERK: Ett rør vil være en sikkerhetskopi ved forurensning eller et prøvevolum som er større enn forventet.
  2. Etter å ha åpnet dura materen, spør kirurgen om å samle CSF med en 3 ml sprøyte (uten en nål).
    MERK: For å forhindre forurensning bør CSF-samlingen foregå umiddelbart etter åpningen av dura materen.
  3. Be kirurgen om å gi sprøyten til kirurgisk sykepleier.
  4. Motta sprøyten fra kirurgisk sykepleier og evakuere det nødvendige volumet av CSF i røret / rørene.
  5. Lukk rørene og legg dem på is.
  6. Plasser røret / rørene i -80 ° C fryseren så snart som mulig.
E "> 10. Viral transduksjonseksperimenter for primære VS-celler

  1. Ved å bruke den virale bestandskonsentrasjonen som referanse, beregne ønsket genometall (gc) -nummer og multiplikasjon av infeksjon (MOI) som er nødvendig for det foreslåtte transduksjonsforsøket; Viruslager kan fortynnes direkte i tilskudd med dyrkingsmedium.
    MERK: Enhver viral vektor som er egnet for primærcelletransduksjon kan brukes; Se Landegger et al. (2017) for en detaljert sammenligning av seks forskjellige adenoassosierte virus serotyper 27 . I tillegg, når man dyrker primære humane celler, blir celletallene ikke bestemt bestemt før plating på deksel. Primære VS-celler reagerer ikke godt på trypsinisering og passasje, så for en pålitelig MOI-beregning kan antall adherente celler per brønn estimeres ved hjelp av et fasekontrastmikroskop. Alternativt, hvis cellene er nær sammenløp, kan tallene deres pålitelig estimeres ved å bruke standard celletetthetsverdier forEn brønn med 24 brønner ( f.eks. 5 x 10 4 celler per brønn).
  2. Under en laminær strømningsdeksel lagre supplert medium som inneholder den ønskede mengden virus i et 15 ml konisk laboratorierør slik at 1 ml virusholdig medium fremstilles for hver brønn av celler som skal transduseres. Pipetter det virusholdige mediet opp og ned for å blande forsiktig, men grundig.
  3. Ved hjelp av sterile pincett, overfør dekselglassene som inneholder primære VS-celler (trinn 5.2.8) fra den originale 24-brønnsplaten til en ny 24-brønnplate. Etter overføringen av hver enkelt deksel, legg til 1 ml virusholdig medium. Vri platen hver gang medium er tilsatt for å sikre at cellene er belagt jevnt med viruset.
  4. Inkuber ved 37 ° C og 5% CO 2 i løpet av det planlagte forsøket.
    MERK: Inkubasjoner som strekker seg fra 48 til 120 timer har alle vist lovende transduksjonsresultater 27 .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Primære humane VS-celler i kultur, som etablert i avsnitt 5, kan behandles som informative modeller for sykdomsassosierte prosesser i mange nedstrøms forskningsapplikasjoner ( Figur 1 ). Sunn Schwann-celler dyrket i seksjon 6 gir et direkte og lærerikt sammenligningspunkt. Som beskrevet nedenfor, er omfattende data fra VS og GANer behandlet i henhold til dette enhetlige metodiske ramme tilgjengelig i flere artikler tidligere publisert 12 , 13 , 14 , 15 , 27 .

Den vellykkede transduksjonen av primære VS-celler med adenoassosierte virus for genterapi presenteres her for første gang ( figur 2 ). Primære VS-celler ble transdusert i kultur w Med GFP-uttrykkende Anc80, en spådd forfader av adeno-assosierte virus 28 . Anc80 har vist seg å være en maksimal effektiv vektor for genoverføring i murin cochleært vev in vitro og in vivo 27 . Effektiv transduksjon av primære humane celler med denne vektoren bærer viktige implikasjoner for fremtidige forays i genterapi for VS.

Figur 1
Figur 1: Lysbilder av primære humane vestibulære Schwannoma kulturer.
Typiske mønstre i organisasjonen av VS-celler i kultur kan identifiseres. Skalestang = 200 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2 "class =" xfigimg "src =" / files / ftp_upload / 55827 / 55827fig2.jpg "/>
Figur 2: Representativt immunfluorescerende bilde av primære humane vestibulære Schwannoma-kulturer etter eksponering for GFP-uttrykkende Anc80 i 48 timer ved en infeksjonsmultiplikasjon (MOI) på 250.000.
Grønn = GFP; Rødt = phalloidin / F-actin (flekker cytoskeletet); Blå = DAPI (flekker kjernen). Skalestenger = 50 μm (A) og 100 μm (B). Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Dette manuskriptet beskriver et enhetlig metodologisk rammeverk for VS-forskning, som beskriver samtidig behandling av menneskelige VS- og GAN-prøver for nedstrøms forskningsapplikasjoner. Som VS-forskning går inn i en alder av presisjonsmedisin, vil det bli mulig å oppdage molekylær, cellulær, genetisk og proteomisk innsikt som er spesifikke for individuelle pasienter, og forberede den samme prøven i skjemaer som kan svare på en rekke forskningsspørsmål.

Renheten av humane Schwann-celle- og VS-kulturer ble grundig vurdert over tid ved hjelp av immuncytokjemi, ved anvendelse av forholdet mellom celler positive for S100-markøren til de positive for DAPI-nukleare flekken 19 . Det anbefales derfor å utføre eksperimenter på primære humane Schwann-cellekulturer innen de første to ukene etter plating av cellene, da renheten av disse cellene er den høyeste i løpet av denne perioden; Etterpå begynner fibroblastlignende celler å dominere. duGh VS-cellekulturer er også maksimalt rene i to uker i kultur, VS-celler mangler kontaktmediert inhibering og vil fortsette å proliferere ved senere stadier. I tillegg viste en direkte mikroarray-sammenligning av proteinuttrykk fra VS-vev (seksjon 4) og VS-celler i kultur fra de samme svulstene (avsnitt 5) at VS-kulturer viser et tilfredsstillende høyt nivå av biologisk likhet med deres respektive foreldretumorer 19 . Den vellykkede kvantifisering av proteiner av interesse kan utføres via Western blot av proteinlysater generert i seksjon 4 og kvantifisering av RNA-transkripsjoner via qRT-PCR av RNA ekstrahert fra vev konservert med RNA-stabiliseringsoppløsning (seksjon 2) 12 , 13 , 14 .

VS- og GAN-celler i kulturen kan bli utsatt for kjemisk aktive substanser, som ikke-steroide antiinflammatoriske stoffer, smalL interfererende RNAer (siRNAer) eller naturlige organiske forbindelser for å belyse sykdomspesifikke molekylære mekanismer eller å teste et terapeutisk mål 13 , 14 , 29 . Forbindelser av interesse kan direkte tilsettes til celler i kultur etter passende fortyndinger i regelmessig tilført dyrkningsmedium. For å vurdere effekten av slike stoffer på viktige aspekter ved cellulær fysiologi, bromodeoksyuridin (BrdU) -merking for proliferasjon, terminal deoksynukleotidyltranferase-DUTP-nick-endemerking (TUNEL) for apoptose og 3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) - Reduksjon av 2,5-difenyltetrazoliumbromid (MTT) for metabolisk levedyktighet er pålitelige analyser som kan brukes med tillit på disse cellene 19 . Kulturmedium fra behandlede celler kan også forsiktig aspireres, lagres ved -20 ° C og testes for å kvantifisere relative nivåer av utsöndrede substanser, slik som prostaglandin E2, sekresjonen av hvilken cEn påvirkes av medisinbehandling 13 . I tillegg gir vevfiksering (seksjon 7) og påfølgende innebygning i OCT eller paraffin et robust substrat for immunofluorescensanalyser 13 , 14 .

Det svulst- eller nervekondenserte medium som er generert i avsnitt 3, gir en enkel og effektiv måte å vurdere VS-utskillede oppløselige molekyler og ekstrahere ekstracellulære vesikler. Cytokin-arrays eller ELISAs kan utføres på disse sekreter, som angitt i produsentens protokoller, som er omtalt i to publiserte studier 9 , 12 . Ekstracellulære vesikler kan renses fra disse sekreter ved hjelp av ultracentrifugering, som beskrevet i en tidligere publikasjon 30 . Alternativt kan sekresjonene selv brukes som pasientspesifikke reagenser for nedstrømsforskningsapplikasjoner. For eksempel, i et eksperiment som avslørerHevdet en ny mekanisme underliggende VS-assosiert sensorineuralt hørselstap, ble sekresjoner samlet fra VS-vev av pasienter med dårlige hørsels- og VS-pasienter med god hørsel etter inkubering i DMEM i 72 timer (seksjon 3). Disse svulstsekretiene ble deretter påført muse-cochleære eksplanterende stoffer, og det ble påvist at svulstsekretasjoner fra VS-pasienter med dårlig hørsel forårsaket mer skade på cochleære eksplanterende stoffer enn sekreter fra VS-pasienter med god hørsel 15 . Det er viktig at sekreter som er samlet på tidspunkter før 72 timer, ikke resulterte i betydelig skade.

Human perilymph samlet fra pasienter som gjennomgår translabyrintisk VS reseksjon (§ 8) representerer en spennende ny avenue for oppdagelsen av VS biomarkører. Prøver samlet inn i henhold til punkt 8 ble analysert via væskekromatografi-tandem massespektrometri (LC-MS / MS) for å kartlegge proteinet av humant perilymph, og 15 kandidat biomarkører av VS ble vellykket iDentified 31 . En lignende analyse kan være mulig ved bruk av human CSF samlet fra VS pasienter (§ 9).

Et vesentlig hensyn i VS-forskning er valget av passende kontrollvev. Tidligere studier har brukt cochlear nerve, vestibulær nerve og ikke-relaterte perifere nerver (for eksempel sciatic nerve), til variabel effekt 22 , 32 . Men flere grunner fører til støtte for bruken av GAN som maksimal relevante kontroller 15 . I likhet med vestibulær nerve er GAN en perifer, sensorisk nerve med axoner ensheathed av Schwann celler. Det er viktig at et litteratursøk avslører at schwannomer aldri har blitt funnet å utvikle seg fra GAN, noe som gjør neoplastiske endringer i dette vev usannsynlig. I tillegg blir GANs regelmessig ofret når de åpner strukturer av dypere nakke, noe som gir sykehusbaserte forskere lett tilgang til helseY prøver under rutinemessige nekdisseksjoner og parotidektomi. Selv om cochlear nerve ofte blir ofret under VS-operasjonen, og kan være lett tilgjengelig, risikerer nærheten til vestibulære nerver delingen av det samme mikro-miljøet, som kan demonstrere pre-tumor-molekylære endringer 33 . Andre laboratorier har også brukt GANs som en tilstrekkelig kontroll for VS-forskning, og det anbefales å fortsette denne øvelsen 20 , 21 , 22 , 34 .

Et kritisk, men ofte oversett trinn i celletypespesifikke kulturprotokoller (seksjoner 5 og 6) er riktig fjerning av ikke-levedyktig vev og blodkar. Fjerning av disse ikke-tumorvevene er avgjørende for å generere robuste kulturer med maksimal renhet. Videre, når plating av celleholdig kulturmedium på coverlips, er det viktig åVær nøye med mengden vev som overføres til hver brønn. Å oppnå en jevn, lett tett fordeling av celler som inneholder noen få "biter" av tettere vev i hver brønn er spesielt viktig for Schwann-celler, som krever et tilstrekkelig antall vedhengende celler til å trives. Coating dekselglassene med poly-D-lysin og laminin tillater også effektiv vekst av celler. Cellene sprer seg mer robust når dekselet er belagt i laboratoriet, sammenlignet med kommersielt tilgjengelige pre-belagte produkter.

For å sikre høy kvalitet på protein og RNA-ekstraksjon, kontroller at vevet forblir ved temperaturer under 4 ° C i seksjoner 2 og 4. I tillegg, siden litteraturen om analysen av VS-sekresjoner er mangel på (avsnitt 3), kan det hende at nye prosjekter krever Videre innovasjoner og forskjellige lengder av inkubasjon.

Som metoder for å adressere VS-patobiologi fortsetter å utvikle bruken av denne strEamlined kombinasjon av grunnleggende teknikker vil tillate maksimal mengde informasjon som skal hentes fra en enkelt menneskelig prøve. Den informerte samtidig behandling av VS- og GAN-vev vil være integrert i genereringen av effektive farmakologiske og genetiske terapier mot denne svekkende svulst.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingenting å avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av Nasjonalt institutt for døvhet og andre kommunikasjonsforstyrrelser som gir R01DC015824 (KMS) og T32DC00038 (støtte JES og SD), forsvarsministeriet W81XWH-14-1-0091 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS) , Nancy Sayles Day Foundation (KMS), Lauder Tinnitus Research Center (KMS), og Barnes Foundation (KMS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip Corning 354087 Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01)
CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 188161
CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile Greiner Bio-One 227261
CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm Greiner Bio-One 628160
Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered Sigma-Aldrich C1639
Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile Corning 3526
DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) Thermo Fisher Scientific D1306
DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10313-039
DMEM/F-12, 500 mL Thermo Fisher Scientific 11320-033
Dumont #3 Forceps, Dumoxel Fine Science Tools 11231-30 Autoclave prior to use
Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox Fine Science Tools 11251-20 Autoclave prior to use
Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10437-028 Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer
Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder Sigma-Aldrich H3506
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile EMD Millipore SLGP033RS
Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline Sigma-Aldrich P6148 Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online
PBS, pH 7.4, 500 mL Thermo Fisher Scientific 10010-023 Autoclave prior to use
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100 mL Thermo Fisher Scientific 15140-122
PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets Roche 04906845001
Pierce Protease Inhibitor Tablets Thermo Fisher Scientific 88666
Pipettes and pipette tips, 5/10/25 mL Variable Variable
Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0 mL Microtubes E&K Scientific EK-10539
PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in BD 301629
RIPA Buffer Boston BioProducts BP-115
RNAlater (RNA stabilization solution) Thermo Fisher Scientific AM7021
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL Eppendorf 022363719 Autoclave prior to use
Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL Eppendorf 022363204 Autoclave prior to use
Saline - 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 mL Hospira 0409-1966-05
Scalpel Blades - #15 Fine Science Tools 10015-00
Schuknecht Suction Tube 24 gauge Bausch + Lomb N1698 42 Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker
Specimen Container, OR sterile, 4OZ Medline DYND30331H
Stemi 2000-C Stereo Microscope Zeiss 000000-1106-133
Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in. BD 309630
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mL BD 309659
Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mL BD 309656
Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe Cole-Parmer CP25013

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
  2. Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
  3. Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S. Descriptive epidemiology of vestibular schwannomas. Neuro Oncol. 8 (1), 1-11 (2006).
  4. Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P. True incidence of vestibular schwannoma? Neurosurgery. 67 (5), 1335-1340 (2010).
  5. Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma? Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
  6. Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
  7. Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
  8. Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L. Management of sporadic vestibular schwannoma. Otolaryngol Clin North Am. 48 (3), 407-422 (2015).
  9. Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
  10. Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
  11. Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
  12. Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
  13. Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
  14. Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
  15. Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
  16. Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
  17. Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
  18. Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
  19. Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
  20. Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
  21. Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
  22. Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
  23. Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
  24. Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
  25. Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
  26. Archibald, D. J., et al. B7-H1 expression in vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (6), 991-997 (2010).
  27. Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
  28. Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
  29. Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215 (2016).
  30. Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
  31. Lysaght, A. C., et al. Proteome of human perilymph. J Proteome Res. 10 (9), 3845-3851 (2011).
  32. Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
  33. Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
  34. Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868 (2013).

Tags

Kreftforskning utgave 124 vestibulær schwannoma stor aurikulær nerve kirurgisk prøve primærcellekultur vevssekretjoner adenoassosiert virus perilimprøpling Schwann-celler
Et enhetlig metodologisk rammeverk for Vestibular Schwannoma Research
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Landegger, L. D., Sagers, J. E.,… More

Landegger, L. D., Sagers, J. E., Dilwali, S., Fujita, T., Sahin, M. I., Stankovic, K. M. A Unified Methodological Framework for Vestibular Schwannoma Research. J. Vis. Exp. (124), e55827, doi:10.3791/55827 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter