Summary
O objetivo deste protocolo é descrever a coleta e processamento de amostras cirúrgicas humanas para múltiplas aplicações a jusante no schwannoma vestibular e na pesquisa de células de Schwann.
Abstract
Os schwannomas vestibulares são as neoplasias mais comuns do ângulo cerebelopontino, constituindo 6-8% de todos os crescimentos intracranianos. Embora esses tumores causem perda auditiva neurossensorial em até 95% dos indivíduos afetados, os mecanismos moleculares subjacentes a essa perda auditiva permanecem indescritíveis. Este artigo descreve as etapas estabelecidas em nosso laboratório para facilitar a coleta e processamento de várias amostras primárias de tecido humano para aplicações de pesquisa a jusante integrantes ao estudo de schwannomas vestibulares. Especificamente, este trabalho descreve um quadro metodológico unificado para a coleta, processamento e cultura de células de Schwann e Schwannoma a partir de amostras cirúrgicas. Isso é integrado a etapas de processamento paralelo, agora consideradas essenciais para a pesquisa atual: a coleta de secreções tumorais e nervosas, a preservação do RNA e a extração de proteínas dos tecidos coletados, a fixação do tecido para a preparação de seções, umaD a exposição de células humanas primárias a vírus adeno-associados para aplicação na terapia genética. Além disso, este trabalho destaca a abordagem cirúrgica translocrítica para colecionar este tumor como uma oportunidade única para obter o epitélio sensorial humano da orelha interna e perilimia. São fornecidas dicas para melhorar a qualidade experimental e destacadas armadilhas comuns.
Introduction
Os schwannomas vestibulares (VSs) são as neoplasias mais comuns do ângulo cerebelopontino, diagnosticadas em 1 em cada 100.000 indivíduos. Embora não metastáticos, esses tumores afetam gravemente a qualidade de vida de um paciente 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Indivíduos afetados geralmente vivem com perda auditiva, zumbido e um sentimento de plenitude auditiva. Os sintomas tornam-se cada vez mais debilitantes à medida que o tumor cresce, causando problemas de equilíbrio, paralisia facial e comprometimento de outras funções do nervo craniano. Complicações potencialmente fatais devido à compressão do tronco encefálico também podem ocorrer 7 .
As opções de gerenciamento de VS são essencialmente limitadas à espera atenta de tumores estáticos e terapia de radiação estereotáxica ou ressecção cirúrgica para tumores em crescimento Como os VS provêm de um nervo sensorial periférico ( ou seja, o nervo vestibular), é importante comparar as observações associadas ao VS com as derivadas de um nervo de controle apropriado, como o grande nervo auricular humano (GAN). GANs saudáveis são regularmente sacrificados durante a parotidectomia ou dissecção do pescoço e podem ser usados como modelos robustos para a fisiologia das células de Schwann saudáveis 9 . Como não há medicamentos aprovados pela FDA para o tratamento ou prevenção de VS esporádicos, é imperativo que os pesquisadores elucidem o mecanismo molecular subjacenteNismos da doença para identificar alvos terapêuticos. As proteínas que demonstraram desempenhar um papel na patogênese VS incluem merlin, fator de crescimento endotelial vascular (VEGF), ciclooxigenase 2 (COX-2), fator nuclear kappa B (NF-kB), fator de necrose tumoral alfa (TNF-alfa) , Receptor do factor de crescimento epidérmico (EGFR) e moléculas de sinalização relacionadas 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 . Avanços recentes expandiram e melhoraram os protocolos para a coleta, processamento, cultura e investigação a jusante de schwannomas vestibulares humanos primários e tecidos nervosos saudáveis 18 , 19 . No entanto, a maioria dos protocolos existentes são projetados para acomodar a preparaçãoDe tais tecidos para um único pedido de pesquisa a jusante ( isto é, cultura celular sozinho). Este artigo apresenta um quadro metodológico unificado para o processamento simultâneo de uma única amostra humana primária VS ou GAN para múltiplas aplicações a jusante: cultura específica do tipo celular, extração de proteínas, preservação de ARN, coleta de secreção de tumor e fixação de tecido. Este trabalho também detalha a coleta e processamento cirúrgico do líquido cefalorraquidiano (CSF) humano e perilymph durante a ressecção VS translabyrintin, uma vez que estes tecidos intimamente relacionados podem servir como fontes importantes de biomarcadores para VS. Finalmente, este protocolo apresenta etapas para a transdução viral de células VS humanas primárias em cultura como uma nova aplicação deste tecido para uso na terapia de genes.
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Protocol
O consentimento informado escrito para a coleta de todas as amostras foi obtido antes da cirurgia e os experimentos foram realizados de acordo com o Código de Ética da Associação Médica Mundial (Declaração de Helsinque). Todas as seções do protocolo de estudo foram aprovadas pelo Conselho de Revisão Institucional do Massachusetts Eye Hospital e Hospital Geral de Massachusetts.
NOTA: As seções 1-7 abaixo são projetadas para serem realizadas sequencialmente após o recebimento de uma amostra VS ou GAN humana primária da sala de operação. O processamento deve sempre começar com a seção 1. Em seguida, como regra, o RNA deve ser preservado primeiro (seção 2), seguido da preparação de tecido para a coleta de secreções (seção 3) e extração de proteína (seção 4). O tecido a ser cultivado (seção 5 para VS, seção 6 para GAN) pode se sentar em meio de cultura suplementado enquanto as seções 2, 3 e 4 são realizadas. A fixação do tecido para seção (seção 7) é muito curta e cUm ser realizado durante qualquer passo de centrifugação. A seção 8 (processamento de perilimitação) e a seção 9 (processamento CSF) podem ser realizadas após o recebimento de perilymph ou CSF da sala de operação durante uma ressecção VS translabyrinthine. A seção 10 (transdução viral) pode ser realizada em células VS ou Schwann em cultura.
1. Preparação e recebimento de uma amostra cirúrgica
NOTA: As seguintes etapas devem ser realizadas em um ambiente estéril, como um capuz de cultura de tecidos ou capa de fluxo laminar. É esperada familiaridade com a técnica estéril básica.
- Preparação de meio para VS humano primário ou cultura de células de Schwann
- Destilar uma alíquota de 50 mL de soro de bovino fetal congelado (FBS) em um banho de água a 37 ° C.
- Adicione 5 mL de mistura de penicilina / estreptomicina a um frasco de 500 mL de DMEM / F-12, resultando em uma diluição final de 1: 100.
- Adicione os 50 mL de FBS descongelado ao frasco de 500 mL de DMEM / F-12,Resultando em uma diluição final de 1:10.
- Escreva a data, as iniciais do pesquisador e informações suplementares ( por exemplo, 1% P / S, 10% FBS) no frasco.
- Coloque o novo meio de cultura na geladeira (4 ° C).
- Recebimento e limpeza da amostra VS ou GAN
- Na sala de operação, coloque a amostra VS ou GAN recentemente colhida em solução salina estéril em um recipiente de amostra. Transporte a amostra no gelo da sala de operação para um capô de fluxo laminar no laboratório.
NOTA: Os tamanhos e pesos das amostras variam significativamente entre os pacientes com base no tamanho do tumor relevante ou na quantidade de nervo excisado. - Remova as alíquotas de solução-estoque de hialuronidase (25 000 U / mL) e colagenase (3.200 U / mL) do congelador e deixe descongelar as enzimas à temperatura ambiente (necessário para as etapas 5.1.4 ou 6.1.6, dependendo da amostra Um VS ou um GAN).
NOTA: A ressuspensão de enzimas liofilizadas iS descritos em detalhes nas folhas de informações do produto. A colagenase pode ser ressuspensa em qualquer solução de sal equilibrada isenta de cálcio e hialuronidase numa solução de tampão de fosfato 0,02 M (pH 7,0), NaCl 77 mM e 0,01% de 1 mg / mL de albumina de soro bovino. A atividade específica para cada enzima liofilizada varia com o lote e deve ser verificada antes da ressuspensão. - Usando uma série de três tubos de 1,5 mL preenchidos com 1,4 mL de 1x PBS estéril, lave a amostra VS ou GAN três vezes. Transmita cuidadosamente o espécime de tubo a tubo com pinça estéril. Feche cada tubo uma vez que contém o espécime e agite suavemente para lavar.
NOTA: Para evitar inundações nos tubos de 1,5 mL, pode usar-se menos de 1,4 mL de PBS por tubo se a peça do tumor for grande. - Coloque a amostra em uma placa seca de Petri de 60 mm e use fórceps para remover todo o tecido morto (por exemplo , porções cauterizadas, que geralmente são de cor branca ou opaca) e áreas com vasos sanguíneos proeminentes.
- Use fOrceps ou uma lâmina de bisturis para dividir a amostra em peças separadas para preservação de ARN, extração de proteínas, coleta de secreção, fixação e cultura de células (ver seções 2 a 6 abaixo).
- Transfira a peça do espécime designada para cultura celular (seção 5/6) para um novo prato de cultura de 60 mm que contenha 5-8 mL de meio DMEM / F-12 frio e suplementado (em alternativa, a tampa do primeiro prato de cultura pode ser Usado para este passo).
NOTA: A quantidade de meio DMEM / F-12 necessário (a partir do passo 1.1) dependerá do tamanho do tumor ou nervo, mas deve cair entre 5 e 8 mL. Esta peça pode se sentar em meio de cultura enquanto as etapas subseqüentes são realizadas.
- Na sala de operação, coloque a amostra VS ou GAN recentemente colhida em solução salina estéril em um recipiente de amostra. Transporte a amostra no gelo da sala de operação para um capô de fluxo laminar no laboratório.
2. Preservação de RNA de tecido VS e GAN (também válido para o epitélio sensorial humano)
- Sob o capô de fluxo laminar, transfira 1-1,2 mL de solução de estabilização de ARN para um novo tubo de 1,5 mL.
- Depois de lavar o espécime com PBS (passo 1.2.3), mergulhe brevemente a torta pequenaCe do tecido designado para a preservação de RNA (aproximadamente 3 mm 3 de VS ou um comprimento de 5 mm de GAN) na solução de estabilização de ARN. Certifique-se de que o espécime está completamente imerso na solução.
- Prepare e rotule um novo tubo de 1,5 mL. Recupere o espécime da solução de estabilização de ARN, transfira-o para o novo tubo e guarde-o em um congelador de -80 ° C.
3. Coleção das secreções VS e GAN
- Dia 1
- Depois de lavar o espécime com PBS (passo 1.2.3), coloque o pedaço de VS ou GAN designado para a coleta de secreções em um tubo vazio de 1,5 mL.
- Prepare dois tubos adicionais de 1,5 mL e pipette 500 μL de DMEM (não suplementado com FBS) em cada tubo.
NOTA: O primeiro tubo de DMEM será usado para coletar as secreções tumorais e o segundo tubo de DMEM servirá como controle combinado. As secreções podem ser coletadas no DMEM, qualquer outro meio de cultura típico nãoSuplementado com soro, ou PBS. - Coloque um dos tubos contendo DMEM em uma escala digital calibrada. Tare a escala, de modo que quando o tubo se encaixa no topo da escala, ele lê 0 mg.
- Remova o tubo de DMEM da escala, coloque o pedaço de amostra designado para a coleta de secreções no tubo e pesá-lo. Observe o resultado, que representará o peso do tecido sozinho.
- Sob um capô de fluxo laminar, ajuste o volume de DMEM no tubo para 100 μL por 10 mg de espécime.
- Coloque o tubo contendo a amostra de tecido e seu controle combinado (DMEM sozinho) na incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 ) por um período consistente com os planos para esta experiência. Incube o tecido por pelo menos 72 h para coletar quantidades biologicamente úteis de secreções tumorais ou nervosas 15 .
- Dia 4
- Após a incubação por 72 h, remova o meio contendo secreção doEspécime ( ou seja, meio condicionado com tecido) usando uma pipeta de 1 mL. Para evitar ciclos repetidos de congelamento-descongelamento, aliquote o meio em novos tubos de acordo com as análises a jusante previstas ( por exemplo, para executar um ELISA com 4 poços que requerem 50 μL cada, podem ser preparadas alíquotas de 210 μL).
- Se necessário, congele a peça de tecido restante no tubo original (já rotulada no Dia 1) a -80 ° C para análises adicionais, como a extração de DNA, em uma data posterior.
- Armazene o tecido, as secreções e controle o DMEM em um congelador de -80 ° C até as aplicações a jusante serem iniciadas ( por exemplo, ELISAs, LC-MS / MS, matrizes de citocinas, etc. ).
4. Extração de proteínas de tecido VS ou GAN
- Preparação do tampão RIPA fortificado
- Adicione um comprimido de inibidor de fosfatase e um comprimido de inibidor de protease a 10 mL de tampão RIPA em um tubo de 15 mL; Isso é fortificadoTampão RIPA.
NOTA: Armazene o buffer RIPA a 4 ° C e adicione os comprimidos imediatamente antes da utilização.
- Adicione um comprimido de inibidor de fosfatase e um comprimido de inibidor de protease a 10 mL de tampão RIPA em um tubo de 15 mL; Isso é fortificadoTampão RIPA.
- Extração de proteínas
- Transfira 210 μL de tampão RIPA fortificado (passo 4.1.1) para um novo tubo de 1,5 mL.
- Depois de lavar o espécime com PBS (passo 1.2.3), transfira o pequeno pedaço de tecido designado para extração de proteína (aproximadamente 3 mm3 de VS ou 5 mm de comprimento de GAN) para o tubo contendo tampão RIPA e coloque-o sobre gelo Durante pelo menos 10 min. Se estiver estudando formas de proteínas fosforiladas, complete o tampão RIPA com inibidores da protease e da fosfatase 14 . Entretanto, podem ser realizadas etapas para outros componentes do processamento de tecidos, como a fixação (seção 7).
- Pré-esfriar a centrífuga para 4 ° C.
- Usando um pilão plástico, homogeneize o tecido no tubo contendo tampão RIPA. Sonicate o tecido por 10-15 s com uma amplitude de 20%. Certifique-se de que o espécimePermanece no gelo, mesmo durante a sonicação.
- Centrifugar durante 10 min a 15,000 xg e 4 ° C.
- Alíquota o sobrenadante em incrementos de 50 μL em novos tubos de 0,5 mL (dependendo das aplicações a jusante pretendidas, qualquer tamanho de incremento pode ser escolhido).
- Armazene as alíquotas do lisado de proteína em um congelador de -80 ° C até que as aplicações a jusante sejam iniciadas ( por exemplo, ELISA ou Western blots) 20 , 21 .
5. Cultura humana primária
- Dia 1
- Separe o tecido VS designado para a cultura de células (que está sentado no meio de cultura, como descrito no passo 1.2.6) em aproximadamente 1 mm 3 de peça usando um par de fórceps em cada mão.
- Aspirar o meio contendo um tumor com uma pipeta sorológica de 10 mL e transferir todos os teores para um tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugar por 3 min a1000 xg e 25 ° C.
- Prepare o meio de desintegração em um novo prato de cultura de 60 mm, combinando 4,7 mL de meio DMEM / F-12 suplementado com 250 μL de colagenase (concentração final: 160 U / mL) e 50 μL de hialuronidase (concentração final: 250 U / mL) , Para um volume final de 5 mL.
NOTA: ambas as enzimas devem ser armazenadas em um congelador de -20 ° C, mas descongeladas antes da preparação deste meio (passo 1.2.2). - Após a centrifugação, os pedaços de tumor formarão uma pelota no fundo do tubo cônico. Deixe uma pipeta com cuidado e descarte o sobrenadante.
- Adicionar 2 mL do meio de desintegração contendo enzima recém-fabricado (passo 5.1.4) ao sedimento do tumor. Pipete para cima e para baixo várias vezes para mobilizar o tecido e transferir a peça de tumor contendo meio para o prato de cultura de 60 mm.
- Coloque o prato de cultura na incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 ) durante 18 h.
- Dia 2
- D quenteMeio MEM / F-12 suplementado com 10% de FBS e 1% de penicilina / estreptomicina (preparado no passo 1.1) num banho de água a 37 ° C.
- Remova a placa de Petri contendo a cultura VS da incubadora (passo 5.1.7). Usando uma agulha de 22 G anexada a uma seringa de 6 mL, aspirar o meio contendo cultura e transferi-lo para um novo tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 37 ° C.
- Entretanto, use fórceps estéreis para colocar o número necessário de lamelas de vidro revestidas de poli-D-lisina e laminina em uma placa de cultura de 24 poços.
NOTA: O número de poços a serem cultivados depende do tamanho da amostra; Aproximadamente 24-32 poços podem ser cultivados a partir de um tumor de 1 cm 3 , portanto, para a maioria dos tumores menores, o planejamento de 8-16 poços de células cultivadas é apropriado. - Após a centrifugação, descarte o sobrenadante ( ou seja, meio enriquecido em enzima) e ressuspenda o sedimento celular residual em meio DMEM / F-12 fresco, suplementado, pré-aquecidoEd no passo 5.2.1.
NOTA: O volume para ressuspender o sedimento é determinado pelo número de poços planejado no passo 5.2.4, estimando 1 mL de meio por poço planejado. - Aspirar 2 mL do meio celular ressuspenso (passo 5.2.5) usando uma pipeta sorológica de 5 mL. Deposite 1 mL do meio contendo células tumorais em cada poço preparado da placa de 24 poços.
- Continue aspirando e depositando o meio contendo células tumorais (aspirando em incrementos de 2 mL, dos quais 1 mL é depositado em cada poço planejado) até a suspensão das células tumorais ser dividida igualmente entre todos os poços preparados.
- Coloque a placa de 24 poços na incubadora a 37 ° C durante a noite.
- Dia 3
- Se os restos significativos forem observados na parte inferior dos poços, altere cuidadosamente o meio em cada poço para o novo meio de cultura de DMEM / F-12 suplementado, tomando cuidado para não desalojar as células aderentes. Caso contrário, devolva a placa à incubadora e altere-a.E médio pela primeira vez no dia 5.
- Dias 5-7 e depois
- Mude o meio a cada 3 dias.
NOTA: As células primárias VS e GAN humanas são geralmente mantidas em cultura até seu uso em aplicações a jusante, em ou cerca de 14 dias de idade. A pureza da cultura diminui depois disso 19 .
- Mude o meio a cada 3 dias.
6. Cultura GAN humana primária
- Dia 1
- Sob um microscópio de dissecação, isolar fascículos do tecido designado para a cultura GAN (que foi sentado em meio de cultura, como descrito no passo 1.2.6).
- Isolar os fascículos do epineuro e bainha fibrosa, puxando o perineuro usando o nº. 5 pinças enquanto se agarra o epineuro com o n. 3 fórceps.
- Uma vez que os fascículos estão suficientemente isolados do epineuário circundante, transfira-os para um novo prato de cultura contendo 2 mL de suco frescoMeio médio.
- Corte os fascículos em segmentos de 1 a 2 mm usando a lâmina do bisturi.
- Pipetar os pequenos pedaços de fascículo e o meio circundante em um tubo de 15 mL contendo 3 mL de meio de cultura suplementado fresco, de modo que o volume total no tubo de 15 mL se torne 5 mL.
- Centrifugue o espécime por 3 min a 1000 xg e 25 ° C.
- Enquanto isso, faça um meio de cultura de células de Schwann em uma nova placa de Petri de 60 mm combinando 4,7 mL de meio DMEM / F-12 suplementado, 250 μL de colagenase e 50 μL de hialuronidase, para um volume final de 5 mL.
NOTA: Armazene ambas as enzimas a -20 ° C; Descongelá-los à temperatura ambiente antes de preparar este meio (passo 1.2.2). - Após a centrifugação do espécime, os fascículos se condensarão em um pequeno grânulo no tubo cônico. Descarte o sobrenadante.
- Adicionar 2 mL do meio de desintegração contendo enzima recém-fabricado (passo 6.1.6) ao sedimento do nervo. Pipetar e dVárias vezes para mobilizar o tecido e transferi-lo para um novo prato de cultura de 60 mm.
- Coloque o prato na incubadora (37 ° C, 5% de CO 2 ) durante 20-22 h.
NOTA: Esta é uma incubação mais longa do que é necessário para amostras VS (passo 5.1.7).
- Sob um microscópio de dissecação, isolar fascículos do tecido designado para a cultura GAN (que foi sentado em meio de cultura, como descrito no passo 1.2.6).
- Dia 2
- Meio DMEM / F-12 suplementado quente em banho-maria a 37 ° C.
- Usando uma agulha de 22 G anexada a uma seringa de 6 mL, aspirar o meio contendo a cultura de células e transferi-lo para um novo tubo cônico de 15 mL.
- Centrifugar durante 5 min a 1000 xg e 37 ° C.
- Descarte o sobrenadante e ressuspenda a amostra em meio de cultura DMEM / F-12 novo, pré-aquecido, suplementado.
- Use pinças estéreis para colocar o número necessário de lamínulas revestidas nos poços de uma placa de cultura de 24 poços.
NOTA: O cálculo de dois poços de células cultivadas por amostra de nervo de 1 cm promove o crescimento robusto da cultura. - Adicione 1 mL do meio contendo cultura a cadaBem designado na placa de 24 poços.
- Coloque a placa de 24 poços na incubadora a 37 ° C e 5% de CO 2 .
- Dia 3
- Se forem detectados detritos significativos nos poços, substitua cuidadosamente o meio com novo meio de cultura de DMEM / F-12 suplementado, tomando cuidado para não desalojar as células aderentes. Caso contrário, devolva a placa à incubadora e mude o meio pela primeira vez no dia 5.
- Dias 5-7 e depois
- Mude o meio a cada 3 dias.
7. VS & GAN Tissue Fixation
- Pipetar 1-1.2 mL de paraformaldeído a 4% (PFA, CUIDADO) em um novo tubo de 1,5 mL.
- Após a lavagem do tumor ou nervo com PBS (passo 1.2.3), transfira um pequeno pedaço de tecido (aproximadamente 3 mm3 de VS ou um comprimento de 5 mm de GAN) em 4% de PFA e coloque o tubo em um agitador a 4 ° C. Certifique-se de que o espécime está completamente imerso em tEle solução.
- Após pelo menos 2 h de fixação, retire o tubo do agitador e proceda ao processamento posterior ( por exemplo, incorporação em parafina ou composto de temperatura de corte ideal (OCT) para imuno-histoquímica ou imunofluorescência subsequente 22 , 23 , 24 . Alternativamente, o tecido pode ser congelado instantaneamente, como descrito anteriormente 25 , 26 .
8. Coleta e Armazenamento de Perilymph Humano durante o Resecção de Translavértina VS
- Coloque três tubos esterilizados de 1,5 mL em gelo.
NOTA: Um tubo será mantido como um backup em caso de contaminação. - Encha um tubo de 1,5 mL com aproximadamente 1,2 mL de solução de PBS que foi filtrada duas vezes usando um filtro de 0,22 μm.
NOTA: Para coletar perilymph durante uma ressecção VS translabyrinthine, o cirurgião deve primeiro garantir que o surgiO campo cal está livre de poeira do osso, sangue ou solução salina. O cirurgião pode usar um tubo de aspiração Schuknecht 21 ou 24 G na mão não dominante para esse propósito.
Um local típico para extrair perilymph é o canal semicircular lateral (no entanto, o canal semicircular posterior ou a membrana da janela redonda também podem ser acessados, dependendo da preferência do cirurgião). O cirurgião deve remover cuidadosamente o osso labiríntico com uma broca de diamante (ao usar irrigação por sucção contínua) para identificar a linha azul ( ou seja, o labirinto membranoso) do canal semicircular. O canal semicircular é penetrado através da linha azul usando uma agulha longa de 27 G anexada a uma seringa de tuberculina de 1 mL. - Peça ao cirurgião para suavemente aspirar uma pequena quantidade de perilymph e, em seguida, passar a seringa e anexar a agulha à enfermeira cirúrgica.
NOTA: Normalmente, uma gota de perilymph ou menos é coletada. Se o volume observado for maior, a amostra provavelmente será contaminada com outra fLuid. - Abra o tubo vazio de 1,5 mL preparado e o tubo cheio com PBS diretamente antes de usar. Tenha cuidado para não tocar no interior das tampas do tubo enquanto as abre.
- Receba a seringa e a agulha anexada da enfermeira cirúrgica e purgue o líquido completamente no tubo vazio, tomando cuidado para não tocar o próprio tubo com a agulha.
- Desconecte cuidadosamente a agulha da seringa. Não contamine a ponta da agulha e continue a segurá-la em uma mão.
NOTA: Um volume muito pequeno de perilymph foi coletado, portanto, algum líquido pode permanecer na ponta longa da agulha. - Por outro lado, use a própria seringa (sem a agulha) para sugar 0,2 mL de solução de PBS filtrada do tubo preparado no corpo da seringa.
- Volte a colocar a agulha na seringa. Evacue completamente a seringa no tubo que contém perilymph, usando o PBS estéril para liberar a ponta da agulha.
- Feche o tubo que contém perilymph e PBS e coloque No gelo.
- Descarte a agulha em um recipiente cortante.
- Coloque o tubo contendo perilymph no congelador -80 ° C o mais rápido possível.
9. Coleta e Armazenamento de LCR Humano
- Coloque três (ou mais) tubos esterilizados de 1,5 mL em gelo.
NOTA: Um tubo será um backup em caso de contaminação ou um volume de amostra maior que o esperado. - Depois de abrir a dura-máter, pergunte ao cirurgião para coletar CSF com uma seringa de 3 mL (sem uma agulha em anexo).
NOTA: Para evitar a contaminação, a coleta do LCR deve ocorrer imediatamente após a abertura da dura-máter. - Peça ao cirurgião que entregue a seringa à enfermeira cirúrgica.
- Receba a seringa da enfermeira cirúrgica e evacue completamente o volume necessário de LCR no (s) tubo (s).
- Feche o (s) tubo (s) e coloque-os sobre gelo.
- Coloque o (s) tubo (s) no congelador -80 ° C o mais rápido possível.
- Usando a concentração de estoque viral como referência, calcular o número desejado de contagem de genoma (gc) e a multiplicidade de infecção (MOI) necessárias para o experimento de transdução proposto; O estoque de vírus pode ser diluído diretamente no meio de cultura suplementado.
NOTA: Qualquer vector viral adequado para a transdução de células primárias pode ser usado; Ver Landegger et al. (2017) para uma comparação detalhada de seis sorotipos de vírus adeno-associados diferentes 27 . Além disso, ao cultivar células primárias humanas, as contagens de células não são tipicamente determinadas antes do revestimento em lamínulas. As células VS primárias não respondem bem à tripsinização e ao passando, portanto, para um cálculo MOI confiável, o número de células aderentes por poço pode ser estimado usando um microscópio de contraste de fase. Alternativamente, se as células estão próximas da confluência, seus números podem ser estimados de forma confiável usando valores de densidade celular padrão paraUma placa de 24 poços ( por exemplo, 5 x 10 4 células por poço). - Sob uma camada de fluxo laminar, prepare um meio suplementado contendo a quantidade desejada de vírus em um tubo de laboratório cônico de 15 mL, de modo que seja preparado 1 mL de meio contendo vírus para cada poço de células a serem transduzidas. Pipetar o meio contendo vírus para cima e para baixo para misturar suavemente, mas completamente.
- Usando fórceps estéril, transfira os lamínulas contendo células VS primárias (passo 5.2.8) da placa original de 24 poços para uma nova placa de 24 poços. Após a transferência de cada lamínula individual, adicione 1 mL de meio contendo vírus. Reduzir a placa cada vez que o meio é adicionado para garantir que as células estejam revestidas uniformemente com o vírus.
- Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante a duração do experimento planejado.
NOTA: Incubações variando de 48-120 h apresentaram resultados de transdução promissores 27 .
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Representative Results
As células VS humanas primárias em cultura, conforme estabelecido na seção 5, podem ser tratadas como modelos informativos para processos associados a doenças em muitos aplicativos de pesquisa a jusante ( Figura 1 ). As células saudáveis de Schwann cultivadas na seção 6 fornecem um ponto de comparação direto e instrutivo. Conforme descrito abaixo, dados extensivos de VSs e GANs processados de acordo com este quadro metodológico unificado estão disponíveis em vários artigos publicados anteriormente 12 , 13 , 14 , 15 , 27 .
A transdução bem sucedida de células VS primárias com vírus adeno-associados para terapia gênica é apresentada aqui pela primeira vez ( Figura 2 ). As células VS primárias foram transduzidas em cultura w Ith GFP-expressing Anc80, um antepassado predito de vírus adeno-associados 28 . Anc80 demonstrou ser um vetor eficientemente eficiente para a transferência de genes em tecidos cocleares murinos in vitro e in vivo 27 . A transdução efetiva de células humanas primárias com este vetor traz implicações importantes para futuros incêndios na terapia de genes para VS.
Figura 1: Imagens de campo brilhante de culturas primárias de Schwannoma vestibular humano.
Padrões típicos na organização de células VS em cultura podem ser identificados. Barra de escala = 200 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Figura 2: Imagem imunofluorescente representativa de culturas primárias de Schwannoma vestibular humano após exposição ao Anc80 que expressa GFP por 48 h em uma Multiplicidade de Infecção (MOI) de 250,000.
Verde = GFP; Vermelho = faloidina / F-actina (mancha o citoesqueleto); Azul = DAPI (mancha o núcleo). Barras de escala = 50 μm (A) e 100 μm (B). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Este manuscrito descreve um quadro metodológico unificado para pesquisas VS, descrevendo o processamento simultâneo de espécimes humanos VS e GAN para aplicações de pesquisa a jusante. À medida que a pesquisa VS entra na idade da medicina de precisão, preparar a mesma amostra em formas capazes de responder a inúmeras questões de pesquisa possibilitará a descoberta de informações moleculares, celulares, genéticas e proteômicas específicas para pacientes individuais.
A pureza das células humanas de Schwann e das culturas VS foi cuidadosamente avaliada ao longo do tempo por meio de imunocitoquímica, usando a proporção de células positivas para o marcador S100 para as positivas para a mancha nuclear DAPI 19 . Consequentemente, recomenda-se a realização de experimentos em culturas de células Schwann humanas primárias nas primeiras duas semanas após o revestimento das células, uma vez que a pureza dessas células é a mais elevada durante este período; Depois, as células tipo fibroblasto começam a predominar. TuAs culturas de células gh VS também são maximamente puras em duas semanas de cultura, as células VS não possuem inibição mediada por contato e continuarão a proliferar em estágios posteriores. Além disso, uma comparação direta de microarray da expressão da proteína do tecido VS (seção 4) e das células VS em cultura dos mesmos tumores (seção 5) mostrou com sucesso que as culturas VS demonstram um alto nível de similaridade biológica satisfatório aos seus respectivos tumores parentes 19 . A quantificação bem sucedida de proteínas de interesse pode ser realizada por meio de Western blot de lisados de proteínas gerados na seção 4 e a quantificação de transcritos de RNA via qRT-PCR de RNA extraído de tecidos preservados com solução de estabilização de ARN (seção 2) 12 , 13 , 14 .
As células VS e GAN em cultura podem ser expostas a substâncias quimicamente ativas, como fármacos anti-inflamatórios não esteróides, smalI ARNs interferentes (siRNAs) ou compostos orgânicos naturais para elucidar mecanismos moleculares específicos da doença ou para testar um alvo terapêutico 13 , 14 , 29 . Os compostos de interesse podem ser adicionados diretamente às células em cultura após diluições apropriadas em meio de cultura suplementado. Para avaliar o efeito de tais substâncias em aspectos importantes da fisiologia celular, rotulagem de bromodeoxiuridina (BrdU) para proliferação, rotulação terminal de desoxinucleotidil transferase dUTP (TUNEL) para apoptose e 3- (4,5-dimetiltiazol-2-ilo) A redução do brometo de 2,5-difeniltetrazólio (MTT) para a viabilidade metabólica são ensaios confiáveis que podem ser usados com confiança nessas células 19 . O meio de cultura das células tratadas também pode ser cuidadosamente aspirado, armazenado a -20 ° C e testado para quantificar níveis relativos de substâncias segregadas, como a prostaglandina E2, cuja secreção é cUm afetado pelo tratamento medicamentoso 13 . Além disso, a fixação do tecido (seção 7) e subseqüente incorporação em OCT ou parafina fornece um substrato robusto para ensaios de imunofluorescência 13 , 14 .
O meio condicionado por tumor ou nervo gerado na seção 3 fornece uma maneira simples e eficaz de avaliar as moléculas solúveis segregadas com VS e extrair vesículas extracelulares. Arrays de citoquinas ou ELISAs podem ser realizados nessas secreções, conforme indicado nos protocolos dos fabricantes, delineados em dois estudos publicados 9 , 12 . As vesículas extracelulares podem ser purificadas a partir dessas secreções usando ultracentrifugação, conforme detalhado em uma publicação anterior 30 . Alternativamente, as próprias secreções podem ser usadas como reagentes específicos do paciente para aplicações de pesquisa a jusante. Por exemplo, em um experimento que revelaUm novo mecanismo subjacente à perda auditiva neurossensorial associada ao VS, as secreções foram coletadas do tecido VS de pacientes com audição insuficiente e pacientes com VS com boa audição após incubação em DMEM por 72 h (seção 3). Estas secreções tumorais foram então aplicadas a explantes cocleares murinos, e foi revelado que as secreções tumorais de pacientes com VS com má audição causaram mais danos aos explantes cocleares do que as secreções de pacientes com VS com boa audição 15 . Importante, as secreções coletadas em pontos de tempo antes das 72 h não resultaram em danos substanciais.
O perilymph humano coletado de pacientes submetidos à ressecção VS de translabyrinthine (seção 8) representa uma nova e excitante avenida para a descoberta de biomarcadores VS. Os espécimes coletados de acordo com a seção 8 foram analisados através de cromatografia líquida - espectrometria de massa em tandem (LC-MS / MS) para mapear o proteoma de perilymph humano e 15 biomarcadores candidatos de VS foram exitosamente iIdentificado 31 . Uma análise semelhante poderia ser possível usando CSF humano coletado de pacientes com VS (seção 9).
Uma consideração significativa na pesquisa VS é a seleção de tecido de controle apropriado. Estudos anteriores usaram o nervo coclear, o nervo vestibular e os nervos periféricos não relacionados (como o nervo ciático), com efeito variável 22 , 32 . No entanto, várias razões levaram ao suporte do uso de GANs como controles de máxima importância 15 . Semelhante ao nervo vestibular, o GAN é um nervo periférico e sensorial com axônios ensurdecedores de células de Schwann. Importante, uma pesquisa na literatura revela que os schwannomas nunca foram encontrados para se desenvolver a partir do GAN, tornando as mudanças neoplásicas neste tecido improváveis. Além disso, os GANs são sacrificados regularmente ao acessar estruturas do pescoço mais profundo, oferecendo aos pesquisadores baseados em hospitais acesso fácil à saúdeE espécimes durante as dissecações rotineiras do pescoço e as parotidectomias. Embora o nervo coclear seja frequentemente sacrificado durante a cirurgia VS e possa estar prontamente disponível, sua proximidade com os nervos vestibulares corre o risco de compartilhar o mesmo microambiente, o que pode demonstrar mudanças moleculares pré-tumorais 33 . Outros laboratórios também utilizaram com sucesso os GANs como um controle adequado para a pesquisa de VS, e recomenda-se continuar esta prática 20 , 21 , 22 , 34 .
Um passo crítico, mas muitas vezes negligenciado, dentro dos protocolos de cultura específicos do tipo celular (seções 5 e 6) é a remoção adequada de tecido e vasos sanguíneos não viáveis. A remoção desses tecidos não tumorais é crucial para gerar culturas robustas de pureza máxima. Além disso, ao colocar o meio de cultura contendo células nas lamínulas, é importantePreste muita atenção à quantidade de tecido transferido para cada poço. Conseguir uma distribuição uniforme, suavemente densa, de células contendo alguns "pedaços" de tecido mais denso em cada poço é particularmente importante para as células de Schwann, que requerem um número suficiente de células aderentes para prosperar. Revestir os lamínulas com poli-D-lisina e laminina também permite o crescimento eficiente das células. As células proliferam de forma mais robusta quando os lamínulas são revestidas no laboratório, em comparação com produtos pré-revestidos comercialmente disponíveis.
Para garantir uma extração de proteína e ARN de alta qualidade, verifique se o tecido permanece a temperaturas inferiores a 4 ° C ao longo das seções 2 e 4. Além disso, uma vez que a literatura sobre a análise das secreções de VS é escassa (seção 3), novos projetos podem exigir Novas inovações e diferentes comprimentos de incubação.
À medida que os métodos para abordar VS pathobiology continuam a avançar, o uso desse strA combinação direta de técnicas fundamentais permitirá que a quantidade máxima de informações seja obtida de uma única amostra humana. O processamento simultâneo informado de tecidos VS e GAN será parte integrante da geração de terapias farmacológicas e genéticas efetivas contra esse tumor debilitante.
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Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado pelo RIEDC015824 (KMS) e T32DC00038 (apoiando JES e SD), o Departamento de Defesa concede W81XWH-14-1-0091 (KMS), a Fundação Bertarelli (KMS) , A Fundação Nancy Sayles Day (KMS), o Centro de Pesquisa Lauer Tinnitus (KMS) e a Fundação Barnes (KMS).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 mL | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0 mL Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline - 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 mL | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mL | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mL | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
References
- Babu, R., et al. Vestibular schwannomas in the modern era: epidemiology, treatment trends, and disparities in management. J Neurosurg. 119 (1), 121-130 (2013).
- Gal, T. J., Shinn, J., Huang, B. Current epidemiology and management trends in acoustic neuroma. Otolaryngol Head Neck Surg. 142 (5), 677-681 (2010).
- Propp, J. M., McCarthy, B. J., Davis, F. G., Preston-Martin, S.
- Stangerup, S. E., Tos, M., Thomsen, J., Caye-Thomasen, P.
- Tos, M., Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P., Tos, T., Thomsen, J. What is the real incidence of vestibular schwannoma? Arch Otolaryngol Head Neck Surg. 130 (2), 216-220 (2004).
- Stangerup, S. E., Caye-Thomasen, P. Epidemiology and natural history of vestibular schwannomas. Otolaryngol Clin North Am. 45 (2), 257-268 (2012).
- Mahaley, M. S., Mettlin, C., Natarajan, N., Laws, E. R., Peace, B. B. Analysis of patterns of care of brain tumor patients in the United States: a study of the Brain Tumor Section of the AANS and the CNS and the Commission on Cancer of the ACS. Clin Neurosurg. 36, 347-352 (1990).
- Carlson, M. L., Link, M. J., Wanna, G. B., Driscoll, C. L.
- Dilwali, S., et al. Sporadic vestibular schwannomas associated with good hearing secrete higher levels of fibroblast growth factor 2 than those associated with poor hearing irrespective of tumor size. Otol Neurotol. 34 (4), 748-754 (2013).
- Caye-Thomasen, P., et al. VEGF and VEGF receptor-1 concentration in vestibular schwannoma homogenates correlates to tumor growth rate. Otol Neurotol. 26 (1), 98-101 (2005).
- Koutsimpelas, D., et al. The VEGF/VEGF-R axis in sporadic vestibular schwannomas correlates with irradiation and disease recurrence. ORL J Otorhinolaryngol Relat Spec. 74 (6), 330-338 (2012).
- Dilwali, S., Roberts, D., Stankovic, K. M. Interplay between VEGF-A and cMET signaling in human vestibular schwannomas and schwann cells. Cancer Biol Ther. 16 (1), 170-175 (2015).
- Dilwali, S., Kao, S. Y., Fujita, T., Landegger, L. D., Stankovic, K. M. Nonsteroidal anti-inflammatory medications are cytostatic against human vestibular schwannomas. Transl Res. 166 (1), 1-11 (2015).
- Dilwali, S., et al. Preclinical validation of anti-nuclear factor-kappa B therapy to inhibit human vestibular schwannoma growth. Mol Oncol. 9 (7), 1359-1370 (2015).
- Dilwali, S., Landegger, L. D., Soares, V. Y., Deschler, D. G., Stankovic, K. M. Secreted Factors from Human Vestibular Schwannomas Can Cause Cochlear Damage. Sci Rep. 5, 18599 (2015).
- Blakeley, J. Development of drug treatments for neurofibromatosis type 2-associated vestibular schwannoma. Curr Opin Otolaryngol Head Neck Surg. 20 (5), 372-379 (2012).
- Schroeder, R. D., Angelo, L. S., Kurzrock, R. NF2/merlin in hereditary neurofibromatosis 2 versus cancer: biologic mechanisms and clinical associations. Oncotarget. 5 (1), 67-77 (2014).
- Schularick, N. M., Clark, J. J., Hansen, M. R. Primary culture of human vestibular schwannomas. J Vis Exp. (89), (2014).
- Dilwali, S., et al. Primary culture of human Schwann and schwannoma cells: improved and simplified protocol. Hear Res. , 25-33 (2014).
- Brown, C. M., Ahmad, Z. K., Ryan, A. F., Doherty, J. K. Estrogen receptor expression in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 32 (1), 158-162 (2011).
- Cioffi, J. A., et al. MicroRNA-21 overexpression contributes to vestibular schwannoma cell proliferation and survival. Otol Neurotol. 31 (9), 1455-1462 (2010).
- Doherty, J. K., Ongkeko, W., Crawley, B., Andalibi, A., Ryan, A. F. ErbB and Nrg: potential molecular targets for vestibular schwannoma pharmacotherapy. Otol Neurotol. 29 (1), 50-57 (2008).
- Aguiar, P. H., Tatagiba, M., Samii, M., Dankoweit-Timpe, E., Ostertag, H. The comparison between the growth fraction of bilateral vestibular schwannomas in neurofibromatosis 2 (NF2) and unilateral vestibular schwannomas using the monoclonal antibody MIB 1. Acta Neurochir (Wien). 134 (1-2), 40-45 (1995).
- Cattoretti, G., et al. Monoclonal antibodies against recombinant parts of the Ki-67 antigen (MIB 1 and MIB 3) detect proliferating cells in microwave-processed formalin-fixed paraffin sections. J Pathol. 168 (4), 357-363 (1992).
- Hung, G., et al. Immunohistochemistry study of human vestibular nerve schwannoma differentiation. Glia. 38 (4), 363-370 (2002).
- Archibald, D. J., et al.
- Landegger, L. D., et al. A synthetic AAV vector enables safe and efficient gene transfer to the mammalian inner ear. Nat Biotechnol. 35 (3), 280-284 (2017).
- Zinn, E., et al. In Silico Reconstruction of the Viral Evolutionary Lineage Yields a Potent Gene Therapy Vector. Cell Rep. 12 (6), 1056-1068 (2015).
- Kim, B. G., et al. Sulforaphane, a natural component of broccoli, inhibits vestibular schwannoma growth in vitro and in vivo. Sci Rep. 6, 36215 (2016).
- Soares, V. Y., et al. Extracellular vesicles derived from human vestibular schwannomas associated with poor hearing damage cochlear cells. Neuro Oncol. 18 (11), 1498-1507 (2016).
- Lysaght, A. C., et al.
- Caye-Thomasen, P., Borup, R., Stangerup, S. E., Thomsen, J., Nielsen, F. C. Deregulated genes in sporadic vestibular schwannomas. Otol Neurotol. 31 (2), 256-266 (2010).
- Schulz, A., et al. The importance of nerve microenvironment for schwannoma development. Acta Neuropathol. 132 (2), 289-307 (2016).
- Torres-Martin, M., et al. Global profiling in vestibular schwannomas shows critical deregulation of microRNAs and upregulation in those included in chromosomal region 14q32. PLoS One. 8 (6), e65868 (2013).
