Summary
이 프로토콜의 목표는 vestibular schwannoma 및 Schwann 세포 연구에서 여러 하류 응용 프로그램에 대한 인간의 수술 샘플 수집 및 처리를 설명하는 것입니다.
Abstract
전정 신경초종은 cerebellopontine 각의 가장 흔한 신 생물이며 모든 두개 내 성장의 6-8 %를 차지합니다. 이 종양은 영향받은 개체의 최대 95 %에서 감각 신경성 청력 손실을 일으키지 만,이 청력 손실의 근간을 이루는 분자 메커니즘은 아직 파악하기 어렵습니다. 이 기사는 전정 신경초종 연구에 필수적인 다운 스트림 연구 응용을위한 다양한 1 차 인간 조직 샘플의 수집과 처리를 용이하게하기 위해 연구실에서 수립 된 단계를 설명합니다. 특히,이 연구는 외과 표본에서 Schwann과 schwannoma 세포의 수집, 가공 및 배양에 대한 통일 된 방법 론적 틀을 설명합니다. 이것은 종양과 신경 분비물의 수집, RNA의 보존과 수집 된 조직에서의 단백질 추출, 절편 준비를위한 조직 고정, 현재의 연구에 필수적인 것으로 간주되는 병행 처리 단계와 통합되어 있습니다.유전자 치료에 응용하기 위해 아데노 관련 바이러스에 일차 인간 세포를 노출시키는 것. 또한,이 연구는이 종양을 내이 및 외음부에서 인간의 감각 상피를 얻을 수있는 독특한 기회로 수집하는 외과 적 접근법을 강조합니다. 실험적인 품질을 향상시키기위한 팁이 제공되고 일반적인 함정이 강조 표시됩니다.
Introduction
Vestibular schwannomas (VSs)는 10 만명당 1 명꼴로 진단되는 소뇌 뼈의 각도에서 가장 흔한 신 생물입니다. 비 전이성이더라도이 종양은 환자의 삶의 질 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6에 심각한 영향을 미칩니다. 영향을받는 개인은 일반적으로 난청, 이명 및 청각 충만감을 느낍니다. 종양이 성장함에 따라 증상이 점점 쇠약하게되어 균형 문제, 안면 마비 및 다른 뇌 기능의 손상을 초래합니다. 뇌간 압박으로 인한 생명을 위협하는 합병증 또한 발생할 수 있습니다.
대장 증후군의 관리 옵션은 근본적으로 정적 종양 및 확립 된 방사선 요법 또는 성장하는 종양의 외과 적 절제를 기다리는 것에주의해야합니다 VS는 말초 감각 신경 ( 즉, 전정 신경)에서 발생하기 때문에 VS 관련 관찰을 인간의 위장 신경 (GAN)과 같은 적절한 제어 신경에서 유도 된 것과 비교하는 것이 중요합니다. 건강한 GAN은 뇌하수체 제거 또는 목구멍 파열시 정기적으로 희생되며 건강한 Schwann 세포 생리학을위한 견고한 모델로 사용될 수 있습니다. Sporadic VS의 치료 나 예방을위한 FDA 승인 의약품이 없기 때문에 연구원들이 근본적인 분자 메커니즘을 명료하게 밝혀야합니다치료 목표를 밝힐 질병의 진전. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 시클로 옥 시게나 제 2 (COX-2), 핵 인자 카파 B (NF-κB), 종양 괴사 인자 알파 (TNF-α) , 표피 성장 인자 수용체 (EGFR) 및 관련 신호 분자 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17을 포함한다 . 최근의 진보는 일차 인간 전정 신경초와 건강한 신경 조직의 수집, 처리, 배양 및 하류 조사를위한 프로토콜을 확장하고 개선했습니다 18 , 19 . 그러나, 대부분의 기존의 프로토콜은 준비를 수용하도록 설계되었습니다단일 하류 연구 응용 ( 즉, 세포 배양 만)에 대한 그러한 조직의 배양. 이 기사는 세포 유형 특이 적 배양, 단백질 추출, RNA 보존, 종양 분비 수집 및 조직 고정과 같은 다중 다운 스트림 응용 분야에 대한 단일 기본 인간 VS 또는 GAN 시료의 동시 처리를위한 통일 된 방법 론적 틀을 제시합니다. 이 작품은 translabyrinthine VS 절제술 동안 인간 뇌척수액 (CSF)과 외음근의 외과 수집 및 가공에 대해 자세히 설명합니다.이 밀접한 관련 조직은 VS에 대한 중요한 바이오 마커의 역할을 할 수 있습니다. 마지막으로,이 프로토콜은 유전자 치료에 사용하기 위해이 조직의 새로운 응용 프로그램으로 문화에서 기본 인간 VS 세포의 바이러스 성 전달을위한 단계를 제공합니다.
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Protocol
모든 샘플 채취에 대한 서면 동의 동의서는 수술 전에 얻었으며 실험은 세계 의학 협회 (헬싱키 선언)의 윤리 강령에 따라 수행되었습니다. 연구 프로토콜의 모든 섹션은 매사추세츠 안과 / 기관 및 매사추세츠 종합 병원의 기관 검토위원회 (Institutional Review Board)의 승인을 받았습니다.
참고 : 아래 1 ~ 7 절은 수술실에서 1 차 인간 VS 또는 GAN 샘플을 받으면 순차적으로 수행하도록 고안되었습니다. 처리는 항상 섹션 1부터 시작해야합니다. 그런 다음 원칙적으로 RNA를 먼저 보존하고 (섹션 2),이어서 분비물 수집 (섹션 3) 및 단백질 추출 (섹션 4)을위한 조직을 준비해야합니다. 배양 될 조직 (VS에 대한 섹션 5, GAN에 대한 섹션 6)은 보충 된 배양 배지에 놓일 수 있고, 섹션 2, 3 및 4는 수행 될 수있다. 절개를위한 조직의 고정 (7 절)은 매우 짧고 c임의의 원심 분리 단계에서 수행 될 수있다. translavrinthine 대 절제술을 시행하는 동안 수술실에서 외 림프 또는 뇌척수액을 받으면 제 8 절 (외음부 처리) 및 제 9 절 (CSF 처리)을 수행 할 수 있습니다. 섹션 10 (바이러스 형질 도입)은 배양중인 성장하는 VS 또는 Schwann 세포에서 수행 할 수 있습니다.
1. 외과 용 샘플 준비 및 수령
참고 : 다음 단계는 조직 배양 후드 또는 층류 후드와 같은 살균 환경에서 수행해야합니다. 기본적인 멸균 기술에 익숙해야합니다.
- 일차 인간 VS 또는 슈반 세포 배양 용 배지의 제조
- 37 ° C 수 욕조에서 냉동 태아 소 혈청 (FBS)의 50 ML 나누어지는을 해동.
- DMEM / F - 12 500 ML 병에 페니실린 / 스트렙토 마이신 믹스 5 ML을 추가, 결과 최종 희석 1시 100 분.
- 해동 한 FBS 50 mL를 DMEM / F-12 500 mL 병에 넣고,1:10의 최종 희석이 발생한다.
- 연구원의 이니셜 및 보충 정보 ( 예 : 1 % P / S, 10 % FBS)를 병에 적습니다.
- 새로운 배지를 냉장고에 넣으십시오 (4 ° C).
- VS 또는 GAN 샘플의 수령 및 세척
- 수술실에서 새로 채취 한 VS 또는 GAN 시료를 검체 용기에 넣은 멸균 생리 식염수에 넣으십시오. 실험실의 시료를 실험실의 층류 두건으로 수술실에서 얼음으로 옮깁니다.
참고 : 샘플 크기와 무게는 관련 종양의 크기 또는 절제 된 신경의 양에 따라 환자간에 크게 다릅니다. - 냉동고에서 hyaluronidase (25,000 U / mL)와 콜라게나 제 (3,200 U / mL)의 재고 용액 분취 량을 제거하고 실온에서 효소를 해동 시키십시오 (5.1.4 또는 6.1.6 단계에서 필요합니다. VS 또는 GAN).
참고 : 동결 건조 된 효소 i의 재현 탁제품 정보 시트에 자세히 설명되어 있습니다. 콜라게나 제는 0.02M 인산 완충액 (pH 7.0), 77mM NaCl 및 1mg / mL 소 혈청 알부민 0.01 % 용액에 칼슘이없는 균형 잡힌 소금 용액과 히알루로니다 제에 재현 탁할 수 있습니다. 각 동결 건조 효소의 특정 활성은 로트에 따라 다르며 재현 탁 전에 확인해야합니다. - 1.4 ML 1x 멸균 PBS로 가득한 일련의 3 1.5 ML 튜브를 사용하여 VS 또는 GAN 표본 세 번 씻으십시오. 조심스럽게 멸균 겸자로 튜브에서 튜브로 표본을 전송합니다. 검체가 들어있는 각 튜브를 닫고 부드럽게 씻어서 씻으십시오.
참고 : 1.5 mL 튜브에 범람을 피하기 위해 종양 절편이 큰 경우 튜브 당 1.4 mL 미만의 PBS를 사용할 수 있습니다. - 샘플을 건조한 60mm 페트리 접시에 넣고 집게를 사용하여 모든 죽은 조직 ( 즉, 흰색 또는 불투명 한 소작 된 부분)과 눈에 띄는 혈관이있는 부분을 제거합니다.
- f 사용orceps 또는 메스를 RNA 보존, 단백질 추출, 분비 수집, 고정 및 세포 배양을 위해 별도의 조각으로 나누기위한 것입니다 (아래 2 ~ 6 절 참조).
- 차가운 보충 DMEM / F-12 배지 5 ~ 8 mL가 들어있는 새로운 60 mm 배양 접시에 세포 배양을 위해 지정된 표본 조각 (5/6 절)을 옮깁니다 (또는 첫 번째 배양 접시의 뚜껑을 이 단계에서 사용됨).
참고 : (1.1 단계에서) 필요로하는 DMEM / F-12 배지의 양은 종양 또는 신경의 크기에 따라 다르나 5 ~ 8 mL가되어야합니다. 이 조각은 후속 단계를 수행하는 동안 문화 매체에 앉을 수 있습니다.
- 수술실에서 새로 채취 한 VS 또는 GAN 시료를 검체 용기에 넣은 멸균 생리 식염수에 넣으십시오. 실험실의 시료를 실험실의 층류 두건으로 수술실에서 얼음으로 옮깁니다.
2. VS 및 GAN 조직의 RNA 보존 (인간 감각 상피에도 유효 함)
- 층류 후드 아래에서 1.5mL 튜브에 RNA 안정화 용액 1-1.2mL를 옮긴다.
- PBS로 표본을 세척 한 후 (1.2.3 단계), 작은 파이(약 3 mm 3 VS 또는 5 mm 길이의 GAN)를 RNA 안정화 용액에 넣었다. 시험편이 용액에 완전히 담겨 있는지 확인하십시오.
- 새 1.5 mL 튜브를 준비하고 레이블을 붙이십시오. RNA 안정화 용액에서 검체를 꺼내어 새 튜브로 옮기고 -80 ° C의 냉동고에 보관하십시오.
3. VS 및 GAN 분비물 수집
- 1 일째
- PBS로 검체를 세척 한 후 (1.2.3 절) 분비물 수집을 위해 지정된 VS 또는 GAN의 조각을 빈 1.5 mL 튜브에 넣으십시오.
- 두 개의 추가 1.5 ML 튜브와 각 튜브에 DMEM (FBS로 보충되지 않음) 500 μL 피펫 준비합니다.
참고 : DMEM의 첫 번째 튜브는 종양 분비물을 수집하는 데 사용되며 DMEM의 두 번째 튜브는 일치 된 컨트롤 역할을합니다. 분비물은 DMEM, 다른 전형적인 배양 배지에서 채취 할 수 있습니다.혈청, 또는 PBS로 보충. - DMEM 포함 튜브 중 하나를 교정 된 디지털 스케일에 놓습니다. 튜브가 눈금 위에 올 때 눈금이 0 mg가되도록 눈금을 잽니다.
- 눈금에서 DMEM의 튜브를 제거하고 분비물 수집을 위해 지정된 표본 조각을 튜브에 넣고 무게를 둡니다. 그 결과는 조직의 무게만을 나타냅니다.
- 층류 후드 (laminar flow hood)에서 시험관 10 mg 당 100 μL로 튜브의 DMEM 부피를 조정합니다.
- 이 실험 계획과 일치하는 기간 동안 조직 샘플과 그 일치 컨트롤 (DMEM 혼자)을 포함하는 튜브를 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2 )에 넣으십시오. 적어도 72 시간 동안 조직을 배양하여 생물학적으로 유용한 양의 종양 또는 신경 분비물을 수집합니다 15 .
- 4 일째
- 72 시간 동안 배양 후, 분비물 함유 배지를1 mL 피펫을 사용하여 시험편 ( 즉, 조직 조절 배지)에 넣었다. 반복되는 동결 - 해동 사이클을 방지하기 위해 계획된 하류 분석 ( 예 : 각 50 μL를 필요로하는 4 개의 웰이있는 ELISA를 실행하기 위해 210 μL의 분량을 준비 할 수 있음)에 따라 새로운 튜브에 분주합니다.
- 필요하다면 나중에 DNA 추출과 같은 추가 분석을 위해 -80 ° C에서 원래 튜브 (이미 1 일째에 표시)에 남아있는 조직 조각을 동결하십시오.
- 조직, 분비물 및 제어 DMEM을 다운 스트림 응용 프로그램 ( 예 : ELISA, LC-MS / MS, 사이토 카인 어레이 등 )이 시작될 때까지 -80 ° C의 냉동고에 보관하십시오.
4. VS 또는 GAN 조직에서 단백질 추출
- 강화 된 RIPA 완충액의 제조
- 포스파타제 억제제 1 정 및 프로 테아 제 억제제 1 정을 RIPA 완충액 10 mL에 15 mL 튜브에 넣습니다. 이것은 강화되었다.RIPA 버퍼.
참고 : RIPA 버퍼를 4 ° C에 보관하고 사용 직전에 정제를 첨가하십시오.
- 포스파타제 억제제 1 정 및 프로 테아 제 억제제 1 정을 RIPA 완충액 10 mL에 15 mL 튜브에 넣습니다. 이것은 강화되었다.RIPA 버퍼.
- 단백질 추출
- 요새화 된 RIPA 버퍼 (단계 4.1.1) 210 μL를 새로운 1.5 mL 튜브로 옮긴다.
- PBS로 검체를 세척 한 후 (1.2.3 절), RIPA 완충액 함유 튜브에 단백질 추출을 위해 지정된 작은 조직 조각 (VS의 약 3 mm 3 또는 GAN의 5 mm 길이)을 옮기고 얼음 위에 놓습니다 적어도 10 분. 인산화 된 단백질을 연구하는 경우 RIPA 완충액에 프로테아제 및 포스 파타 아제 억제제를 보충하십시오 14 . 그 동안, 고정 (제 7 항)과 같은 조직 처리의 다른 구성 요소에 대한 단계가 수행 될 수 있습니다.
- 원심 분리기를 4 ° C까지 미리 냉각하십시오.
- 플라스틱 유봉을 사용하여 RIPA 완충액 함유 튜브에서 조직을 균질화합니다. 20 % 진폭으로 10-15 초 동안 조직을 초음파 처리하십시오. 시험편초음파 처리 도중에도 얼음 위에 남아 있습니다.
- 15,000 xg 및 4 ° C에서 10 분간 원심 분리하십시오.
- 새 0.5 mL 튜브에 50 μL 단위로 분취하십시오 (의도 한 다운 스트림 응용 프로그램에 따라 증분 크기를 선택할 수 있음).
- 하류 응용 프로그램 ( 예 : ELISA 또는 웨스턴 블 롯)이 시작될 때까지 -80 ° C의 냉동고에 단백질 용 해물의 분액을 보관하십시오 20 , 21 .
5. 일차 인간 VS 문화
- 1 일째
- 각 손에 한 쌍의 집게를 사용하여 약 1mm 3 조각으로 세포 배양 (단계 1.2.6에서 설명한대로 문화 매체에 앉아되었습니다)에 지정된 VS 조직을 분리합니다.
- 10 ML 혈청 피펫으로 종양 조각 함유 매체를 대기음 15 ML 원뿔 튜브에 모든 내용을 전송할 수 있습니다.
- 3 분 동안 원심 분리기에서1,000 xg 및 25 ° C.
- 콜라게나 아제 (최종 농도 : 160 U / mL) 250 μL와 hyaluronidase (최종 농도 : 250 U / ML) 50 μL와 보충 DMEM / F - 12 매체 4.7 ML을 결합하여 새로운 60mm 문화 요리에 붕괴 매체를 준비 , 최종 용적은 5 mL이다.
참고 : 두 효소는 모두 -20 ° C의 냉동고에 보관해야하지만이 배지를 준비하기 전에 해동해야합니다 (1.2.2 단계). - 원심 분리 후, 종양 조각은 원추형 튜브의 바닥에 펠렛을 형성합니다. 조심스럽게 꺼내어 상등액을 버린다.
- 종양 펠렛에 새로 만든 화학 효소 함유 붕괴 배지 (단계 5.1.4) 2 mL를 첨가한다. 피펫을 위아래로 여러 번 조직을 동원하고 60mm 문화 요리 종양 조각을 포함하는 매체를 전송합니다.
- 18 시간 동안 배양 접시 (37 ° C, 5 % CO 2 )에 문화 요리를 놓으십시오.
- 둘째 날
- 따뜻한 D37 ° C 수조에서 10 % FBS 및 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 (단계 1.1에서 제조 됨)을 보충 한 MEM / F-12 배지.
- 인큐베이터 (단계 5.1.7)에서 VS 문화를 포함하는 페트리 접시를 제거합니다. 6 ML 주사기에 첨부 된 22 G 바늘을 사용하여 문화 - 함유 매체를 대기음하고 새로운 15 ML 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다.
- 1,000 xg 및 37 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오.
- 그 동안 멸균 포 셉을 사용하여 24-well 배양 플레이트에 필요한 수의 폴리 -D- 라이신 및 라미닌 코팅 유리 커버 슬립을 배치하십시오.
참고 : 배양되는 우물의 수는 표본의 크기에 달려 있습니다. 1cm 3 종양에서 약 24-32 개의 우물을 배양 할 수 있으므로 대부분의 작은 종양에서는 배양 된 세포 8 ~ 16 개를 계획하는 것이 적절합니다. - 원심 분리 후, 뜨는 물 ( 즉, 효소가 풍부한 배지)을 버리고 새로운 보충 된 DMEM / F-12 배지에 잔류 세포 펠렛을 재현 탁하여 미리 예열단계 5.2.1.
참고 : 펠렛을 resuspend하는 볼륨은 계획 우물 당 매체 1 ML을 추정, 단계 5.2.4에서 계획 웰의 수에 의해 결정됩니다. - 5 ML 혈청 피펫을 사용하여 resuspended 세포 매체 (단계 5.2.5) 2 ML을 대기음. 24 잘 접시의 준비 각 우물에 종양 세포 함유 매체 1 ML을 입금.
- 종양 세포 현탁액이 준비된 모든 웰 사이에서 균등하게 나누어 질 때까지 종양 세포 함유 배지 (1 mL가 각 웰에 침적되는 2 mL 씩 증량하여 흡입)를 계속해서 침전시킨다.
- 하룻밤 동안 37 ° C 배양기에 24 - 웰 플레이트를 놓습니다.
- 3 일째
- 중요한 잔해가 우물 바닥에 표시되면 각 웰의 배지를 새로운 보충 DMEM / F-12 배양 배지로 조심스럽게 바꾸고 접착 세포를 제거하지 않도록주의하십시오. 그렇지 않다면, 접시를 인큐베이터로 되돌려 놓고 th를 바꿉니다.5 일째에 처음으로 배양 하였다.
- 5-7 일 이후
- 매 3 일마다 매체를 교체하십시오.
참고 : 일차 인간 VS 및 GAN 세포는 일반적으로 14 일 또는 그 이하의 하류 응용 프로그램에서 사용하기 전까지는 배양 물에서 유지됩니다. 이 후 문화 순도가 감소합니다 19 .
- 매 3 일마다 매체를 교체하십시오.
6. 1 차 인간 GAN 문화
- 1 일째
- 해부 현미경, GAN 문화 (단계 1.2.6에서 설명한대로 문화 매체에 앉아되었습니다)에 대한 지정된 조직에서 fascicles를 분리.
- epineurium과 섬유 sheath에서 fascicles를 분리하여 회음부를 당겨 no. 5 번 집게를 사용하여 상완을 붙잡고. 3 집게.
- 일단 fascicles가 주변 epineurium에서 충분히 분리되면, 2 mL의 신선한 sup가 함유 된 새로운 배양 접시로 옮깁니다.보완 된 매체.
- 메스 블레이드를 사용하여 1에서 2mm 세그먼트로 fascicles를 잘라 버릴거야.
- 작은 fascicle 조각과 주변 매체를 15 ML 튜브의 총 볼륨이 5 ML되도록 신선한 보충 문화 매체 3 ML을 포함하는 15 ML 튜브에 피펫.
- 1000 xg 및 25 ° C에서 3 분 동안 표본을 원심 분리하십시오.
- 그 동안 보충 된 DMEM / F-12 배지 4.7 mL, 콜라게나 아제 250 μL 및 히알루로니다 제 50 μL를 최종 용적 5 mL에 혼합하여 새로운 60 mm 페트리 접시에 Schwann 세포 배양 배지를 만듭니다.
참고 : 두 효소를 모두 -20 ° C에서 보관하십시오. 이 매체를 준비하기 전에 실온에서 해빙하십시오 (1.2.2 단계). - 시험편의 원심 분리 후, 매질은 원뿔형 튜브의 작은 펠렛으로 응축됩니다. 뜨는 물을 버린다.
- 갓 만든 효소 함유 붕괴 배지 (6.1.6) 2 mL를 신경 펠렛에 넣는다. 피펫 업과 d조직을 동원하여 새로운 60mm 문화 요리로 옮기기 위해 여러 번 소유하십시오.
- 인큐베이터 (37 ° C, 5 % CO 2 )에 20-22 시간 동안 접시를 놓습니다.
참고 : 이것은 VS 샘플 (단계 5.1.7)에 필요한 것보다 더 긴 인큐베이션입니다.
- 해부 현미경, GAN 문화 (단계 1.2.6에서 설명한대로 문화 매체에 앉아되었습니다)에 대한 지정된 조직에서 fascicles를 분리.
- 둘째 날
- 37 ° C 수조에서 보충 DMEM / F-12 배지를 따뜻하게합니다.
- 6 ML 주사기에 부착 된 22 G 바늘을 사용하여 세포 배양 - 함유 매체를 대기음 새 15 ML 원뿔 튜브로 전송.
- 1,000 xg 및 37 ° C에서 5 분간 원심 분리하십시오.
- 뜨는 부분을 버리고 샘플을 새로운 예열 DMEM / F-12 보충 배지에 다시 넣으십시오.
- 24 웰 문화 접시의 우물에 코팅 coverslips의 필요한 숫자를 배치 멸균 포 셉을 사용합니다.
참고 : 1cm 신경 표본 당 배양 세포의 두 우물을 계산하면 강력한 문화 성장을 촉진합니다. - 배양액 1 mL를 각각에 넣는다.24- 웰 플레이트에서 잘 지정되었다.
- 37 ° C와 5 % CO 2 에서 인큐베이터에 24 잘 접시를 놓습니다.
- 3 일째
- 웰에 상당한 잔해가있는 경우 신중하게 DMEM / F-12 보충 배지로 교체하고 접착 세포를 제거하지 않도록주의하십시오. 그렇지 않은 경우 배양기로 플레이트를 돌려 주며 5 일째 처음으로 배지를 교환하십시오.
- 5-7 일 이후
- 매 3 일마다 매체를 교체하십시오.
7. VS & GAN 조직 고정
- 새로운 1.5 mL 튜브에 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA; CAUTION) 1-1.2 mL를 피펫에 넣으십시오.
- PBS (종단 1.2.3)로 종양이나 신경을 씻은 후 작은 조직 (VS 3 mm 3 또는 GAN 5 mm 길이)을 4 % PFA에 옮기고 4 ℃의 진탕기에 놓습니다 기음. 시험편이 t에 완전히 잠겨 있는지 확인하십시오.그 해결책.
- 최소 2 시간 동안 고정시킨 후, 쉐이커에서 튜브를 꺼내어 추가 가공 ( 예 : 파라핀 또는 최적의 절삭 온도 화합물 (OCT)을 후속 면역 조직 화학 검사 또는 면역 형광 검사에 삽입) 22 , 23 , 24 . 또는 이전에 설명한대로 조직을 급속 동결시킬 수 있습니다 ( 25 , 26) .
8. Translabyrinthine 대 절제술 동안의 인간의 외 릴신의 수집 및 저장
- 얼음에 3 개의 멸균 1.5 ML 튜브를 놓으십시오.
참고 : 하나의 튜브는 오염 된 경우 백업으로 보관됩니다. - 0.22 μm의 필터를 사용하여 두 번 필터링되었습니다 PBS 솔루션 약 1.2 ML로 1.5 ML 튜브를 채우십시오.
참고 : translabyrinthine 대 절제술 동안 외음부를 수집하려면 외과 의사는 먼저 수술을 보장해야합니다칼 필드에는 뼈 먼지, 혈액 또는 염분이 없습니다. 외과의 사는이 목적으로 비 지배적 인 손에 Schuknecht 21 또는 24 G 흡입 튜브를 사용할 수 있습니다.
외음부를 뽑을 수있는 전형적인 장소는 외측 반원형 운하입니다 (그러나 외과 의사의 선호도에 따라 후부 반원형 또는 원형 창막에도 접근 할 수 있습니다). 의사는 반원형 운하의 청색 선 ( 즉, 멤브레인 래비 린스)을 식별하기 위해 다이아몬드 버 (미끄럼 식 관개를 계속하는 동안)을 사용하여 미로 뼈를 조심스럽게 제거해야합니다. 반원형 운하는 1mL 투베르쿨린 주사기에 부착 된 긴 27G 바늘을 사용하여 파란색 선을 통과합니다. - 외과 의사에게 부드럽게 약간의 외음부를 기음 한 다음 주사기와 부착 된 바늘을 수술 간호사에게 전달하십시오.
참고 : 일반적으로, 1 리터 또는 그 이하의 소량이 수집됩니다. 관찰 된 부피가 더 크다면, 샘플은 다른 f루이. - 준비, 빈 1.5 ML 튜브를 열고 사용하기 전에 직접 PBS로 가득 튜브. 열 때 튜브 뚜껑의 내부를 만지지 않도록주의하십시오.
- 외과 간호사에게서 주사기와 부착 된 바늘을 받고 바늘로 튜브 자체에 닿지 않도록 조심스럽게 빈 튜브에 유체를 퍼지합니다.
- 조심스럽게 바늘을 주사기에서 분리하십시오. 바늘 끝을 오염시키지 말고 한 손으로 계속 잡습니다.
참고 : 매우 적은 양의 외음부가 수집되어 일부 액체가 바늘의 긴 끝 부분에 남아있을 수 있습니다. - 다른 한편으로는 주사기 본체 (바늘없이)를 사용하여 준비된 튜브에서 0.2 mL의 여과 된 PBS 용액을 주사기의 몸체로 빨아들입니다.
- 바늘을 주사기에 다시 부착하십시오. 바늘 팁을 플러시하기 위해 멸균 PBS를 사용하여 외음부가 들어있는 튜브에 주사기를 완전히 비 웁니다.
- 외음근과 PBS를 함유 한 튜브와 장소를 닫습니다. 얼음 위에.
- 날카로운 물건에 바늘을 버리십시오.
- 가능한 한 빨리 외음부가 담긴 튜브를 -80 ° C의 냉동고에 넣으십시오.
9. 인간 CSF의 채취 및 보관
- 얼음 위에 3 개 (또는 그 이상)의 무균 1.5 mL 튜브를 놓습니다.
참고 : 오염이 있거나 샘플 볼륨이 예상보다 클 경우 하나의 튜브가 백업이됩니다. - 경 막을 연 후 3 ML 주사기 (바늘이없는)로 CSF를 수집하도록 외과 의사에게 요청하십시오.
참고 : 오염을 막기 위해 뇌경막이 열린 직후 CSF 채취가 이루어져야합니다. - 외과 의사에게 주사기를 수술 간호사에게 건네 주도록하십시오.
- 수술 간호사에게서 주사기를 받고 필요한 양의 CSF를 튜브에 완전히 비우십시오.
- 튜브를 닫고 얼음 위에 놓으십시오.
- 튜브를 가능한 한 빨리 -80 ° C의 냉동고에 넣으십시오.
- 바이러스 성 스톡 농도를 기준으로 제안 된 형질 도입 실험에 필요한 감염 게놈 수 (gc)와 감염 다중도 (MOI)를 계산하십시오. 바이러스 스톡은 보충 된 배양 배지로 직접 희석 될 수있다.
주 : 1 차 세포 형질 도입에 적합한 바이러스 벡터를 사용할 수있다. Landegger et al. (2017) 6 가지 다른 adeno- 관련 바이러스 혈청 형의 상세한 비교 27 . 또한, 일차 인간 세포를 배양 할 때, 세포 수는 일반적으로 coverslips에 도금하기 전에 결정되지 않습니다. 일차 VS 세포는 trypsinization과 passaging에 잘 반응하지 않으므로, 신뢰할 수있는 MOI 계산을 위해, 웰 당 부착 세포의 수는 위상차 현미경을 사용하여 추정 할 수 있습니다. 또는, 세포가 합류에 가까운 경우, 그 세포 수는 표준 세포 밀도 값을 사용하여 신뢰성있게 추정 할 수있다.24- 웰 플레이트 ( 예 : 웰 당 5 x 104 세포). - 층류 후드 아래, 15 ML 원뿔 실험실 튜브에서 바이러스의 원하는 금액을 포함하는 보충 매체를 준비, 1mL의 바이러스 함유 매체가 transduced 세포의 각 우물을 위해 준비되도록. 바이러스 함유 매질을 위 아래로 피펫 섞어 부드럽지만 철저히 섞는다.
- 멸균 포 셉을 사용하여 원래의 24 - 웰 플레이트에서 새로운 24 - 웰 플레이트로 기본 VS 세포 (단계 5.2.8)을 포함 coverslips을 전송할 수 있습니다. 각 coverslip의 전송 후, 바이러스 함유 매체 1 ML을 추가합니다. 세포가 바이러스에 고르게 코팅되도록 매체를 넣을 때마다 플레이트를 돌립니다.
- 계획된 실험 기간 동안 37 ° C와 5 % CO 2 에서 인큐베이션하십시오.
참고 : 48 시간에서 120 시간 사이의 인큐베이션은 모든 유망한 변환 결과를 보여줍니다.
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Representative Results
5 장에서 확립 된 것처럼 배양 된 1 차 인간 VS 세포는 많은 하류 연구 응용에서 질병 관련 과정에 대한 유익한 모델로 취급 될 수있다 ( 그림 1 ). 6 절에서 배양 된 건강한 Schwann 세포는 직접적이고 객관적인 비교 점을 제공합니다. 아래에 요약했듯이이 통일 된 방법론 프레임 워크에 따라 처리 된 VS 및 GAN의 광범위한 데이터는 이전에 12 , 13 , 14 , 15 , 27 에 게시 된 여러 기사에서 사용할 수 있습니다.
유전자 치료를위한 adeno 관련 바이러스로 1 차 VS 세포를 성공적으로 형질 도입 한 사례가 처음으로 발표되었습니다 ( 그림 2 ). 일차 VS 세포를 배양 물에서 형질 감염시켰다 GFP 발현 Anc80, 아데노 관련 바이러스의 예측 조상 인 28 . Anc80은 생체 내 및 생체 내 쥐 달팽이관 조직 에서 유전자 전달을위한 최대한의 효율적인 벡터로 밝혀졌습니다. 이 벡터로 일차 인간 세포의 효과적인 형질 도입은 VS에 대한 유전자 요법에 대한 미래의 침략에 중요한 영향을 미친다.
그림 1 : 일차 인간 전정 신경초종 문화의 명 시야 이미지.
문화에서 VS 세포의 조직에 전형적인 패턴을 확인할 수 있습니다. 스케일 바 = 200 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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그림 2 : 250,000의 감염 다중도 (MOI)에서 48 시간 동안 GFP- 발현 Anc80에 노출 된 후 일차 인간 전정 신경초종 배양 물의 대표적인 면역 형광 이미지.
녹색 = GFP; 적색 = phalloidin / F-actin (세포 골격을 얼룩지게 함); 파란색 = DAPI (핵 얼룩). 스케일 바 = 50 μm (A) 및 100 μm (B). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
이 원고는 VS 연구를위한 통일 된 방법 론적 틀을 설명하며, 하류 연구 응용을위한 인간 VS와 GAN 표본의 동시 처리를 개괄합니다. VS 연구가 정밀 의학의 시대에 접어 들면서 수많은 연구 질문에 답할 수있는 형태로 동일한 샘플을 준비하면 개별 환자에게 특유한 분자, 세포, 유전 및 proteomic 통찰력을 발견 할 수 있습니다.
인간 Schwann 세포와 VS 배양의 순도는 S100 마커에 양성인 세포와 DAPI 핵 염색체에 양성인 세포의 비율을 사용하여 면역 세포 화학 법으로 시간이 지남에 따라 철저히 평가되었습니다. 따라서,이 세포의 순도가이 기간 동안 가장 높기 때문에, 세포를 플레이 팅 한 후 처음 2 주 이내에 일차 인간 슈반 세포 배양에 대한 실험을 수행하는 것이 권장된다. 이후에 섬유 아세포와 같은 세포가 우세하기 시작한다. 천개gh VS 세포 배양 물은 또한 배양 2 주에서 최대로 순수하며, VS 세포는 접촉 매개 저해가 없으며 이후 단계에서 계속 증식 할 것이다. 또한 VS 조직 (섹션 4)과 동일한 종양 (섹션 5)에서 문화의 VS 세포에서 단백질 표현의 직접 microarray 비교는 VS 문화가 그들의 각각의 부모 종양 19 만족스럽게 높은 수준의 생물 학적 유사성을 보여 주 성공적으로 나타났다. 관심있는 단백질의 성공적인 정량은 RNA 안정화 용액 (섹션 2) 12 , 13 , 14로 보존 조직에서 추출한 RNA의 qRT-PCR을 통해 섹션 4에서 생성 된 단백질 lysates의 서양 얼룩과 RNA transcripts의 부량을 통해 수행 할 수 있습니다.
배양 된 VS 및 GAN 세포는 비 스테로이드 항염증제와 같은 화학적 활성 물질에 노출 될 수 있습니다.(siRNA) 또는 천연 유기 화합물을 사용하여 질병 특이 적 분자 메커니즘을 밝히거나 치료 목표 13 , 14 , 29 를 테스트 할 수 있습니다. 관심있는 화합물은 정기적으로 보충 된 배지에서 적절하게 희석 한 후 배양 된 세포에 직접 첨가 할 수 있습니다. 세포 생리학의 중요한 측면에 대한 이러한 물질의 영향을 평가하기 위해 세포 증식을위한 bromodeoxyuridine (BrdU) 표지, 세포 자멸에 대한 말단 deoxynucleotidyl tranferase dUTP 닉 말단 표지 (TUNEL) 및 3- (4,5- 디메틸 티아 졸 -2- 일) 대사 생존 능력에 대한 2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT) 감소는 이러한 세포 19 에 대한 신뢰와 함께 사용될 수있는 신뢰할만한 분석법입니다. 처리 된 세포의 배양 배지도주의 깊게 흡인하여 -20 ° C에서 보관하고 프로스타글란딘 E2와 같은 분비 된 물질의 상대적 수준을 정량적으로 측정하여 c약물 치료의 영향을받습니다 13 . 또한, 조직 고정 (섹션 7) 및 OCT 또는 파라핀에 후속 embedding은 immunofluorescence 분석 13 , 14에 대한 강력한 기판을 제공합니다.
3 절에서 생성 된 종양 또는 신경 조절 배지는 VS 분비 된 가용성 분자를 평가하고 세포 외 소포를 추출하는 간단하고 효과적인 방법을 제공한다. Cytokine 어레이 또는 ELISA는 두 개의 발표 된 연구 9 , 12에 요약 된 제조업체의 프로토콜에 표시된대로 이러한 분비물에서 수행 할 수 있습니다. 세포 외 소포는 이전의 간행물 30 에서 설명 된 것처럼 초 원심 분리를 사용하여 이러한 분비물로부터 정제 할 수 있습니다. 대안으로, 분비물 자체는 하류 연구 응용을위한 환자 특정 시약으로서 사용될 수있다. 예를 들어,VS와 연관된 감각 신경성 난청의 근본적인 기전인데 청력이 약한 환자의 VS 조직과 72 시간 동안 DMEM에서 배양 한 후 좋은 청력을 보인 VS 환자에게서 분비물이 수집되었다. 이 종양 분비물을 생쥐 달팽이 해부 체에 적용한 결과, 청력이 약한 VS 환자의 종양 분비물이 청력이 좋은 VS 환자의 분비물보다 달팽이 체외 이식편에 더 많은 손상을 입혔다. 중요한 것은, 72 시간 이전의 시점에서 수집 된 분비물은 상당한 손상을 초래하지 않는다는 것이다.
translabyrinthine 대 절제술 (섹션 8)을 겪고 환자에서 수집 된 인간의 유행은 VS biomarkers의 발견에 대한 흥미 진진한 새로운 방법을 나타냅니다. 8 절에 따라 채취 한 검체를 LC-MS / MS (liquid chromatography-tandem mass-spectrometry)로 분석하여 사람의 외음부의 프로테옴을 분석하였고, VS의 후보 바이오 마커 15 개를 성공적으로 채취 하였다치명적인 31 . VS 환자로부터 수집 한 인간 CSF를 사용하여 유사한 분석이 가능할 수있다 (9 절).
VS 연구에서 중요한 고려 사항은 적절한 제어 조직의 선택입니다. 이전 연구에서는 달팽이관 신경, 전정 신경 및 관련되지 않은 말초 신경 (좌골 신경과 같은)을 다양한 효과 22 , 32에 사용했습니다 . 그러나 몇 가지 이유가 최대한의 관련 통제로 GAN을 사용하도록 지원합니다 15 . 전정 신경과 유사하게, GAN은 말초 감각 신경이며, 축삭은 Schwann 세포에 의해 감겨져 있습니다. 중요한 것은 문헌 조사에서 신경초종이 GAN에서 발견되지 않았으며,이 조직에서 종양의 변화가 발생하지 않는다는 것을 알 수 있었다. 또한 GAN은 깊은 목 구조에 액세스 할 때 정기적으로 희생되므로 병원 직원이 건강에 쉽게 액세스 할 수 있습니다.y 검체를 일상적인 목구멍 절개술과 방광샘 절제술시 사용합니다. 달팽이관 신경은 대동맥 수술 중에 종종 희생되고 쉽게 이용할 수 있지만 전정 신경과의 근접성은 동일한 미세 환경의 공유를 위험에 빠뜨릴 수 있습니다. 이는 전 종양의 분자 변화를 나타낼 수 있습니다 33 . 다른 연구소는 또한 VS 연구에 대한 적절한 통제로 GAN을 성공적으로 활용했으며, 20 , 21 , 22 , 34 실습을 계속하는 것이 좋습니다.
세포 유형별 문화 프로토콜 (섹션 5 및 6) 내에서 중요하지만 종종 간과 된 단계 중 하나는 비 생존 조직 및 혈관을 적절히 제거하는 것입니다. 이러한 비 종양 조직의 제거는 최대 순도의 강력한 배양 물을 생성하는 데 중요합니다. 또한, coverslips에 세포 함유 배양 배지를 도금 할 때,각 우물로 옮겨진 조직의 양에주의를 기울이십시오. 각 우물에서 밀도가 높은 조직의 "덩어리"몇 개가 들어있는 균일하고 조밀 한 세포 분포를 얻는 것이 Schwann 세포에서 특히 중요합니다. Schwann 세포는 번성하기 위해 충분한 수의 부착 세포가 필요합니다. 폴리 - D - 라이신과 laminin로 coverslips을 코팅도 세포의 효율적인 성장을 허용합니다. 상업적으로 입수 가능한 프리 코팅 제품에 비해 실험실에서 커버 슬립이 코팅 될 때 세포가보다 강력하게 증식합니다.
고품질 단백질 및 RNA 추출을 보장하려면 조직이 2 및 4 섹션에서 4 ℃ 이하의 온도로 유지되는지 확인하십시오. 또한 VS 분비물 분석에 관한 문헌이 부족하기 때문에 (섹션 3) 새 프로젝트에서는 혁신과 다양한 부화 기간.
VS 병리학을 다루는 방법이 계속 발전함에 따라이 str의 사용근본적인 기법의 결합으로 한 사람의 시료에서 최대한의 정보를 수집 할 수 있습니다. VS 및 GAN 조직의 정보 처리 된 동시 처리는이 쇠약하게하는 종양에 대한 효과적인 약리학 및 유전 요법의 생성에 필수적입니다.
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Disclosures
저자는 공개 할 것이 없습니다.
Acknowledgments
이 작품은 국방부 보조금 W81XWH-14-1-0091 (KMS), Bertarelli Foundation (KMS), 국방부 보조금 R01DC015824 (KMS) 및 T32DC00038 (JES 및 SD 지원) , Nancy Sayles Day Foundation (KMS), Lauer Tinnitus Research Center (KMS) 및 Barnes Foundation (KMS)이 포함됩니다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 mL | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0 mL Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline - 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 mL | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mL | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mL | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
References
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