Summary
该方案的目标是概述人类外科手术样品在前庭神经鞘瘤和雪旺氏细胞研究中的多个下游应用的收集和处理。
Abstract
前庭神经鞘瘤是小脑桥角最常见的肿瘤，占所有颅内生长的6-8％。尽管这些肿瘤在高达95％的受影响个体中引起感觉神经性听力损失，但这种听力损失的分子机制仍然难以捉摸。本文概述了我们实验室中建立的步骤，以便于收集和处理各种原始人体组织样品用于前庭神经鞘瘤研究的下游研究应用。具体来说，这项工作描述了从手术样本收集，处理和培养Schwann和神经鞘细胞的统一方法框架。这与现在被认为对当前研究至关重要的并行处理步骤相结合：肿瘤和神经分泌物的收集，RNA的保存和从收集的组织中提取蛋白质，用于制备切片的组织固定，d将原代人细胞暴露于腺相关病毒以用于基因治疗。此外，这项工作突出显示了将这种肿瘤收集在一起的独立手术方法，作为从内耳和外淋巴获得人类感觉上皮的独特机会。提供提高实验质量的提示，并突出显示常见的陷阱。
Introduction
前庭神经鞘瘤（VSs）是小脑桥角最常见的肿瘤，诊断为每10万人1例。虽然非转移性，但这些肿瘤严重影响患者的生命质量1,2,3,4,5,6 。受影响的人通常生活在听力损失，耳鸣和听觉丰满的感觉之中。随着肿瘤生长，症状越来越虚弱，导致平衡问题，面部麻痹和其他颅神经功能受损。由于脑干压迫导致的危及生命的并发症也可能发生。
VS的管理选择本质上限于监视静脉肿瘤和立体定向放射治疗或用于生长肿瘤的手术切除 因为VSs来自外周感觉神经（ 即前庭神经），因此将VS相关观察与从适当的对照神经衍生的神经，如人类大耳神经（GAN）进行比较很重要。健康的GANs在腮腺切除术或颈部解剖中经常被牺牲，可用作健康雪旺氏细胞生理学的健壮模型。 因为没有FDA批准的用于治疗或预防散发性VS的药物，研究人员必须澄清潜在的分子机制确定治疗目标的疾病。已显示在VS发病机制中发挥作用的蛋白质包括merlin，血管内皮生长因子（VEGF），环氧合酶2（COX-2），核因子κB（NF-κB），肿瘤坏死因子α（TNF-α） ，表皮生长因子受体（EGFR）和相关信号分子10,11,12,13,14,15,16,17 。 最近的进展已经扩大和改进了原始人类前庭神经鞘瘤和健康神经组织的收集，处理，培养和下游调查方案18,19 。然而，大多数现有协议被设计为容纳准备这种组织用于单个下游研究应用（ 即单独的细胞培养）。本文提出了一个统一的方法框架，用于同时处理多个下游应用的单个初级人类VS或GAN样品：细胞类型特异性培养，蛋白质提取，RNA保存，肿瘤分泌物收集和组织固定。这项工作还详细介绍了人工脑脊液（CSF）和外翻淋巴结切除术期间的外科手术收集和处理，因为这些密切相关的组织可能作为VS的生物标志物的重要来源。最后，该方案提出了培养中原代人VS细胞病毒转导的步骤，作为该组织用于基因治疗的新应用。
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Protocol
在手术前获得了收集所有样品的书面知情同意书，根据世界医学协会道德守则（赫尔辛基宣言）进行了实验。研究方案的所有部分均由马萨诸塞州眼科和马萨诸塞州总医院机构审查委员会批准。
注意：以下1-7节设计为在从手术室接收到初级人类VS或GAN样品后依次执行。处理应始终从第1节开始。然后，通常应首先保留RNA（第2部分），然后制备用于收集分泌物（第3部分）和蛋白质提取的组织（第4部分）。要培养的组织（VS的第5部分，GAN的第6部分）可以在补充的培养基中进行，而执行第2,3和4部分。切片组织的固定（第7节）非常短，c在任何离心步骤中进行。第8节（外淋巴处理）和第9节（CSF处理）可以在椎间盘VS切除术期间从手术室接收到外淋巴或CSF后进行。可以在培养中生长的VS或施旺细胞上进行第10节（病毒转导）。
1.准备和接收外科手术样本
注意：以下步骤应在无菌环境中进行，例如组织培养罩或层流罩。预计熟悉基本的无菌技术。
- 准备用于初级人VS或施万细胞培养的培养基
- 在37℃水浴中解冻冷冻胎牛血清（FBS）的50mL等分试样。
- 将5mL青霉素/链霉素混合物加入到500mL DMEM / F-12瓶中，最终稀释为1:100。
- 将50mL解冻的FBS加入500mL DMEM / F-12瓶中，最终稀释1:10。
- 在瓶子上写下日期，研究人员的姓名，以及补充信息（ 例如 1％P / S，10％FBS）。
- 将新培养基置于冰箱中（4℃）。
- 接收和清洗VS或GAN样品
- 在手术室中，将新鲜收获的VS或GAN样品置于标本容器中的无菌盐水中。将样品从手术室的冰上运送到实验室的层流罩。
注意：根据相关肿瘤的大小或切除的神经的数量，患者之间的样本大小和体重差异很大。 - 从冷冻箱中取出透明质酸酶（25,000 U / mL）和胶原酶（3,200 U / mL）的储备溶液等分试样，并使酶在室温下解冻（步骤5.1.4或6.1.6要求，取决于样品是否为一个VS或一个GAN）。
注意：冻干酶的再悬浮在产品信息表中详细描述。可将胶原酶重悬于0.02M磷酸盐缓冲液（pH7.0），77mM NaCl和0.01％1mg / mL牛血清白蛋白溶液中的任何无钙平衡盐溶液和透明质酸酶中。每个冻干酶的比活性随批次而变化，应在再悬浮前进行验证。 - 使用一系列装有1.4mL 1x无菌PBS的1.5mL管，洗涤VS或GAN标本三次。用无菌镊子小心地将样品从管转移到管上。关闭每个管，一旦它包含样品，轻轻摇动洗涤。
注意：为了避免淹没1.5 mL管，如果肿瘤片大，每管可以使用少于1.4 mL的PBS。 - 将样品放入干燥的60 mm培养皿中，并使用镊子去除所有死组织（ 即烧灼部分，通常为白色或不透明的颜色）和具有突出血管的区域。
- 使用f手段或手术刀将样品分成单独的片段，用于RNA保存，蛋白质提取，分泌物收集，固定和细胞培养（见下文第2-6节）。
- 将指定用于细胞培养的试样（第5/6节）转移到含有5-8mL冷的补充DMEM / F-12培养基的新的60mm培养皿中（或者，第一培养皿的盖可以是用于此步骤）。
注意：所需的DMEM / F-12培养基的量（来自步骤1.1）将取决于肿瘤或神经的大小，但应在5至8 mL之间。该片可以在培养基中进行，同时执行后续步骤。
- 在手术室中，将新鲜收获的VS或GAN样品置于标本容器中的无菌盐水中。将样品从手术室的冰上运送到实验室的层流罩。
2. RNA保存VS和GAN组织（也适用于人类感觉上皮）
- 在层流罩下，将1-1.2 mL RNA稳定溶液转移到新的1.5 mL管中。
- 用PBS清洗样品（步骤1.2.3）后，短暂地浸泡小馅饼ce的RNA保存（约3毫米3的VS或长度为5毫米的GAN）进入RNA稳定溶液。确保样品完全浸入溶液中。
- 准备并标记一个新的1.5 mL管。从RNA稳定溶液中检索样品，将其转移到新管中，并将其储存在-80°C冷冻箱中。
3.收集VS和GAN分泌物
- 第1天
- 用PBS清洗样品（步骤1.2.3）后，将指定用于收集分泌物的VS或GAN放入空的1.5 mL管中。
- 准备两个额外的1.5 mL管，并将500μL的DMEM（未补充FBS）移液到每个管中。
注意：DMEM的第一管将用于收集肿瘤分泌物，DMEM的第二管将作为匹配对照。分泌物可以收集在DMEM，任何其他典型的培养基中补充血清或PBS。 - 将一个含DMEM的管放置在校准的数字刻度上。去皮垢，使得当管放在秤上方时，它读数为0毫克。
- 从秤中取出DMEM管，将指定收集分泌物的试样放入管中，称重。注意结果，这将代表单独的组织的重量。
- 在层流罩下，将管中的DMEM的体积调节为每10毫克样品100μL。
- 将含有组织样品的管和其匹配的对照（单独的DMEM）放入培养箱（37℃，5％CO 2 ）中，与本实验的计划一致。孵育组织至少72小时以收集生物有用量的肿瘤或神经分泌物15 。
- 第4天
- 孵育72小时后，从中除去含分泌物的培养基标本（ 即组织条件培养基），使用1毫升移液管。为了防止重复的冻融循环，根据计划的下游分析将培养基等分成新的管（ 例如，进行具有4个孔的ELISA的ELISA，每个孔需要50μL，可以制备210μL的等分试样）。
- 如果需要，在-80°C下将原始管中剩余的组织片（已经在第1天标记）冻结，以便进一步分析，如DNA提取。
- 将组织，分泌物和控制DMEM储存在-80°C冷冻箱中，直到下游应用启动（ 例如 ELISA，LC-MS / MS，细胞因子阵列等 ）。
4.从VS或GAN组织提取蛋白质
- 强化RIPA缓冲液的制备
- 在一个15 mL的管中，将一片磷酸酶抑制剂和一片蛋白酶抑制剂加入到10mL的RIPA缓冲液中;这是强化的RIPA缓冲区。
注意：将RIPA缓冲区存储在4°C，然后在使用前添加平板电脑。
- 在一个15 mL的管中，将一片磷酸酶抑制剂和一片蛋白酶抑制剂加入到10mL的RIPA缓冲液中;这是强化的RIPA缓冲区。
- 蛋白质提取
- 将210μL强化的RIPA缓冲液（步骤4.1.1）转移到新的1.5 mL管中。
- 用PBS洗涤样品（步骤1.2.3）后，将指定用于蛋白质提取的小块组织（约3 mm 3的VS或5 mm长度的GAN）转移到含RIPA缓冲液的管中，并置于冰上至少10分钟。如果研究磷酸化形式的蛋白质，补充RIPA缓冲液与蛋白酶和磷酸酶抑制剂14 。同时，可以进行组织处理的其他部件的步骤，例如固定（部分7）。
- 将离心机预冷却至4°C。
- 使用塑料杵，均匀化含有RIPA缓冲液的管中的组织。以20％振幅超声波处理组织10-15秒。确保标本仍然在冰上，即使在超声处理。
- 在15,000 xg和4℃下离心10分钟。
- 将上清液以50μL的增量等分到新的0.5mL管中（根据预期的下游应用，可以选择任何增量大小）。
- 将等分的蛋白质裂解液储存在-80°C冷冻箱中，直到下游应用启动（ 例如， ELISA或Western印迹） 20,21 。
5.初级人类VS文化
- 第1天
- 将指定用于细胞培养的VS组织（其已经坐在培养基中，如步骤1.2.6所述）分成约1mm 3片，每只手中使用一对镊子。
- 用10mL血清移液管吸取包含肿瘤片的培养基，并将所有内容物转移到15 mL锥形管中。
- 离心3分钟1,000 xg和25°C。
- 通过将4.7mL补充的DMEM / F-12培养基与250μL胶原酶（终浓度：160U / mL）和50μL透明质酸酶（终浓度：250U / mL）组合，在新的60mm培养皿中制备崩解培养基， ，最终体积为5mL。
注意：两种酶应储存在-20°C的冰箱中，然后在制备此培养基之前解冻（步骤1.2.2）。 - 离心后，肿瘤片将在锥形管底部形成颗粒。仔细移液并丢弃上清液。
- 加入2mL新鲜的含酶崩解介质（步骤5.1.4）加入肿瘤沉淀。上下移动几次以动员组织并将含肿瘤的培养基转移到60mm培养皿中。
- 将培养皿放入培养箱（37℃，5％CO 2 ）中18小时。
- 第二天
- 温暖D补充有10％FBS和1％青霉素/链霉素（步骤1.1中制备）的MEM / F-12培养基在37℃水浴中。
- 从培养箱中取出含有VS培养物的培养皿（步骤5.1.7）。使用连接到6 mL注射器的22 G针，吸出含培养液的培养基，并将其转移到新的15 mL锥形管中。
- 在1,000×g和37℃下离心5分钟。
- 同时，使用无菌镊子将所需数量的聚D-赖氨酸和层粘连蛋白包被的玻璃盖玻片放入24孔培养板中。
注意：要培养的孔数取决于样品的大小;可以从1cm 3的肿瘤中培养大约24-32个孔，因此对于大多数较小的肿瘤，规划培养细胞的8-16个孔是合适的。 - 离心后，弃上清（ 即富酶培养基），并将残留的细胞沉淀重新悬浮于新鲜的DMEM / F-12培养基中，预热在步骤5.2.1中。
注意：重悬颗粒的体积由步骤5.2.4中计划的孔数确定，估计每个计划孔1 mL的培养基。 - 使用5 mL血清移液管吸出2 mL重悬细胞培养基（步骤5.2.5）。将1mL含肿瘤细胞的培养基沉积到24孔板的每个制备的孔中。
- 继续抽吸和沉积含有肿瘤细胞的培养基（以2mL的增量抽吸，从其中将1mL沉积到每个计划的孔中），直到肿瘤细胞悬浮液在所有制备的孔之间均等分配。
- 将24孔板置于37℃培养箱中过夜。
- 第3天
- 如果井下有明显的碎屑，请小心地将每个孔中的培养基更换为新的补充DMEM / F-12培养基，注意不要去除贴壁细胞。如果没有，请将板返回孵化器并更换e在第5天第一次。
- 第5-7天及以后
- 每3天更换培养基。
注意：初级人类VS和GAN细胞通常维持在培养基中，直到其在14天龄或约14天龄的下游应用中使用。 19世纪后，文化纯度下降。
- 每3天更换培养基。
6.原始人类GAN文化
- 第1天
- 在解剖显微镜下，从指定用于GAN培养的组织（其已经坐在培养基中，如步骤1.2.6中所概述的）分离出分子束。
- 通过使用no来拉动神经束来隔离神经束和纤维鞘的束。 5镊子，同时扣上神仙宝碱。 3镊子
- 一旦分离物与周围的神圣宝石充分隔离，转移到新的培养皿中，该培养皿含有2毫升新鲜的海绵打褶中等。
- 使用手术刀刀片将束切割成1到2毫米的段。
- 将小分子片和周围培养基移入含有3 mL新鲜补充培养基的15 mL试管中，使15 mL试管中的总体积变为5 mL。
- 在1,000 xg和25℃下离心样品3分钟。
- 同时，通过将4.7mL补充的DMEM / F-12培养基，250μL胶原酶和50μL透明质酸酶组合，在新的60mm培养皿中制备雪旺细胞培养基，终体积为5mL。
注意：将两种酶保存在-20°C;在制备该培养基之前在室温下解冻（步骤1.2.2）。 - 在样品离心后，锥体将凝结成锥形管中的小颗粒。丢弃上清液。
- 加入2mL新鲜的含酶崩解介质（步骤6.1.6）加入神经球。移动和d自己多次动员组织并将其转移到新的60毫米培养皿中。
- 将培养皿放在培养箱中（37℃，5％CO 2 ）20-22小时。
注意：这是比VS样品所需的更长的孵化（步骤5.1.7）。
- 在解剖显微镜下，从指定用于GAN培养的组织（其已经坐在培养基中，如步骤1.2.6中所概述的）分离出分子束。
- 第二天
- 在37°C水浴中加热补充DMEM / F-12培养基。
- 使用连接到6 mL注射器的22 G针头吸取含细胞培养液的培养基，并将其转移到新的15 mL锥形管中。
- 在1,000×g和37℃下离心5分钟。
- 丢弃上清液并将样品重新悬浮在新的预热的DMEM / F-12培养基中。
- 使用无菌镊子将所需数量的涂覆的盖玻片放入24孔培养板的孔中。
注意：每1厘米神经标本计算培养细胞的两个孔促进强壮的培养生长。 - 向每个培养基中加入1mL培养基在24孔板中很好地指定。
- 将24孔板置于37℃和5％CO 2的培养箱中。
- 第3天
- 如果孔中有明显的碎屑，请用新的补充DMEM / F-12培养基小心地更换培养基，注意不要去除贴壁细胞。如果没有，请将板返回培养箱，并在第5天首次更换培养基。
- 第5-7天及以后
- 每3天更换培养基。
7. VS＆GAN组织固定
- 将1-1.2mL的4％多聚甲醛（PFA;小心）吸入新的1.5 mL管中。
- 用PBS清洗肿瘤或神经（步骤1.2.3）后，将一小块组织（约3 mm 3的VS或5 mm长度的GAN）转移到4％的PFA中，并将管置于振荡器上4° C。确保样品完全浸没在t中他的解决方案。
- 在固定至少2小时后，从振荡器中取出管，继续进行进一步处理（ 例如，将其嵌入石蜡或最佳切割温度化合物（OCT）中用于随后的免疫组化或免疫荧光） 22,23,24 。或者，如前所述，组织可以快速冷冻， 25,26 。
8.翻译期间人类外皮的收集和储存
- 将三个无菌的1.5 mL管置于冰上。
注意：一个管子将被保留作为备件，以防污染。 - 向一个1.5 mL的管中加入约1.2 mL PBS溶液，PBS溶液用0.22μm过滤器过滤两次。
注意：为了在椎间盘切除术中收集外淋巴液，外科医生必须首先确保手术卡尔地区没有骨灰，血液或盐水。为了这个目的，外科医生可以在非优势手中使用Schuknecht 21或24 G吸管。
提取外淋巴的一个典型的地方是外侧半规管（但是，根据外科医生的偏好，也可以访问后半规管或圆窗膜）。外科医生应该用金刚石钻头（同时使用连续抽吸）小心地移除迷路骨，以识别半规管的蓝线（ 即膜状迷宫）。半规管通过连接到1mL结核菌素注射器的长27 G针穿过蓝线。 - 请外科医生轻轻吸出少量的外淋巴，然后将注射器和连接的针头通过手术护士。
注意：通常，收集一滴外淋巴或更少的。如果观察到的体积较大，样品可能被其他f污染LUID。 - 在使用前，直接打开准备好的空的1.5 mL管和管填充PBS。打开它们时，注意不要触摸管盖的内部。
- 从外科护士接收注射器和连接的针头，并将流体完全吹入空管，注意不要用针接触管本身。
- 小心地从注射器上取下针头。不要污染针尖，并继续握住一只手。
注意：已经收集到非常小体积的外淋巴，所以一些流体可能会保留在针的长尖端。 - 另一方面，使用注射器本身（无针）将0.2 mL过滤的PBS溶液从准备的管中吸入注射器的体内。
- 将针重新连接到注射器。将注射器完全排空到含有外淋巴的管中，使用无菌PBS冲洗针尖。
- 关闭含有孔和PBS的管并放置它在冰上。
- 将针处置在锐器容器中。
- 将含有外淋巴的试管尽快放入-80°C冰箱。
9.人类脑脊液的收集和储存
- 将三个（或更多）无菌的1.5 mL管置于冰上。
注意：一个管将作为备份，以防污染或样品体积大于预期。 - 打开硬脑膜后，请外科医生用3 mL注射器（无针头）收集脑脊液。
注意：为防止污染，脑脊液收集应在硬脑膜开口后立即进行。 - 请外科医生将注射器交给外科护士。
- 从外科护士接收注射器，并将所需体积的CSF完全排出到管中。
- 关闭管子并将其放在冰上。
- 将管子尽快放在-80°C的冷冻箱中。
- 使用病毒储备浓度作为参考，计算拟议的转导实验所需的所需基因组计数（gc）数量和感染复数（MOI）;可将病毒原液直接稀释至补充的培养基中。
注意：可以使用适合于初级细胞转导的任何病毒载体;见Landegger 等 （2017），详细比较六种不同的腺相关病毒血清型27 。此外，当培养原代人细胞时，细胞计数通常在电镀到盖玻片之前不被确定。初级VS细胞对胰蛋白酶消化和传代不良反应，因此为了可靠的MOI计算，可以使用相差显微镜估计每孔的贴壁细胞数。或者，如果细胞接近汇合，则可以通过使用标准细胞密度值可靠地估计它们的数量一个24孔板（ 例如每孔5×10 4个细胞）。 - 在层流罩下，在15mL锥形实验室管中制备含有所需量病毒的补充培养基，使得每个转导细胞孔准备1mL含病毒培养基。上下移动含病毒的培养基，轻轻搅拌均匀。
- 使用无菌镊子，将含有初级VS细胞的盖玻片（步骤5.2.8）从原始的24孔板转移到新的24孔板。每个盖玻片转移后，加入1 mL含病毒的培养基。每次添加培养基时旋转板，以确保细胞均匀涂覆病毒。
- 在计划实验期间，在37℃和5％CO 2下孵育。
注意：48-120小时的孵化都显示出有希望的转导结果27 。
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Representative Results
如第5节所述，培养物中的初级人VS细胞可以被视为许多下游研究应用中疾病相关过程的信息模型（ 图1 ）。在第6节中培养的健康雪旺烷细胞提供了直接和有启发性的比较。如下所述，根据这种统一的方法框架处理的VSs和GAN的广泛数据可以在以前发表的12,13,14,15,27中的多篇文章中找到。
第一次介绍了用于基因治疗的具有腺相关病毒的原代VS细胞的成功转导（ 图2 ）。在培养物中转导初级VS细胞第一个GFP表达Anc80，腺相关病毒的预测祖先28 。已经证明Anc80是体外和体内鼠耳蜗组织中基因转移的最有效的载体。使用该载体对原代人细胞的有效转导对未来的VS基因治疗有重要意义。
图1：原始人类前庭神经鞘瘤培养物的明场图像。
可以鉴定培养中VS细胞组织中的典型模式。刻度棒= 200μm。 请点击此处查看此图的较大版本。
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图2：在感染多重感染（MOI）为25万的暴露于表达GFP的Anc80 48小时后，原代人前庭神经鞘瘤培养物的代表性免疫荧光图像。
绿色= GFP;红色=鬼笔环肽/ F-肌动蛋白（染色细胞骨架）;蓝色= DAPI（污染细胞核）。刻度棒=50μm（A）和100μm（B）。 请点击此处查看此图的较大版本。
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Discussion
该手稿描述了VS研究的统一方法框架，概述了下游研究应用中人VS和GAN标本的同时处理。随着VS研究进入精密医学的时代，以能够回答许多研究问题的形式准备相同的样本将能够发现特定于个体患者的分子，细胞，遗传和蛋白质组学的见解。
通过免疫细胞化学，使用S100标记阳性的细胞比与DAPI核染色阳性的细胞比例，随时间深入评估人雪旺细胞和VS培养物的纯度。因此，推荐在电镀细胞后的前两周对原代人雪旺细胞培养物进行实验，因为这些细胞的纯度在此期间最高;此后，成纤维细胞样细胞开始占主导地位。汝gh VS细胞培养物在培养两周时也是最大纯度的，VS细胞缺乏接触介导的抑制作用，并将在后期继续增殖。另外，来自VS组织（部分4）的蛋白质表达和来自相同肿瘤的培养物中的VS细胞的直接微阵列比较（第5节）成功地显示VS培养物显示出与其各自的亲本肿瘤具有令人满意的高水平的生物相似性。可以通过蛋白质印迹在第4部分中产生的蛋白质裂解物的蛋白质印迹和通过RNA RNA转录物的定量来进行成功的定量，该RNA转录物通过RNA稳定溶液保存的组织（第2部分） 12,13,14中提取的RNA的qRT-PCR进行定量。
培养中的VS和GAN细胞可以暴露于化学活性物质如非甾体抗炎药物中l干扰RNA（siRNAs）或天然有机化合物，以阐明疾病特异性分子机制或测试治疗靶标13,14,29 。可以在常规补充的培养基中适当稀释后将感兴趣的化合物直接加入到培养物中的细胞中。为了评估这些物质对细胞生理学的重要方面的影响，用于增殖的溴脱氧尿苷（BrdU）标记，用于凋亡的末端脱氧核苷酸转移酶dUTP切口末端标记（TUNEL）和3-（4,5-二甲基噻唑-2-基） - 用于代谢活力的2,5-二苯基四唑溴化物（MTT）还原是可以在这些细胞上置信使用的可靠测定19 。处理细胞的培养基也可以小心吸出，保存在-20℃，并进行测定以量化分泌物质的相对水平，例如前列腺素E2，其分泌物c受药物治疗的影响13 。此外，组织固定（第7部分）和随后包埋在OCT或石蜡中为免疫荧光测定提供了强大的底物13,14 。
在第3部分产生的肿瘤或神经条件培养基提供了一种评估VS分泌的可溶性分子和提取细胞外囊泡的简单而有效的方法。细胞因子阵列或ELISA可以在这些分泌物上进行，如在两篇已发表的研究9,12中概述的制造商的方案所示。可以使用超离心从这些分泌物中纯化细胞外囊泡，如先前的出版物30所详述。或者，分泌物本身可以用作下游研究应用的患者特异性试剂。例如，在一个实验中提出了一种基于VS相关感觉神经性听力损失的新型机制，从DMEM中培养72小时后的良好听力VS患者的VS组收集分泌物（第3部分）。然后将这些肿瘤分泌物应用于鼠耳蜗外植体，并且显示来自VS听力不良的患者的肿瘤分泌物对耳蜗外植体的损伤比来自具有良好听力的VS患者的分泌物更多。重要的是，在72小时之前的时间点收集的分泌物没有造成重大损失。
从经历翻译VS切除术的患者收集的人体外淋巴（第8部分）是发现VS生物标志物的一个令人兴奋的新途径。通过液相色谱 - 串联质谱（LC-MS / MS）分析根据第8节收集的样品，以绘制人外淋巴的蛋白质组，并且成功地使用了15个VS的候选生物标志物牙齿化31 。使用从VS患者收集的人类CSF可以进行类似的分析（第9节）。
VS研究中的一个重要考虑是选择适当的对照组织。以前的研究已经使用了耳蜗神经，前庭神经和不相关的周围神经（如坐骨神经），可变效应22,32 。然而，有几个原因导致支持使用GAN作为最大程度的相关控制15 。类似于前庭神经，GAN是由施万细胞融合的具有轴突的外周感觉神经。重要的是，文献检索显示神经鞘瘤从未被发现从GAN发展，使得该组织的肿瘤变化不可能。此外，当访问更深的颈部结构时，GANs经常被牺牲，使医院的研究人员容易获得健康常规颈部清扫和腮腺切除术中的标本。虽然耳蜗神经经常在VS手术期间被牺牲，并且可能容易获得，但其与前庭神经的紧密接触有可能共享相同的微环境，这可能表现出肿瘤前分子改变33 。其他实验室也成功利用GAN作为VS研究的充分控制，建议继续实施20,21,22,34 。
细胞类型特异性培养方案（第5和6节）中的一个关键但经常被忽视的步骤是适当去除非活组织和血管。去除这些非肿瘤组织对于产生最大纯度的强壮培养物是至关重要的。此外，当将含细胞的培养基镀在盖玻片上时，重要的是密切关注转移到每个井的组织量。在每个孔中实现含有几个更密集组织“块”的细胞的均匀，轻度致密的分布对于需要足够数量的贴壁细胞繁殖的雪旺细胞尤其重要。用聚-D-赖氨酸和层粘连蛋白涂覆盖玻片也可以有效地生长细胞。与市售的预涂产品相比，当实验室中盖玻片被涂覆时，细胞增殖更强烈。
为了确保高质量的蛋白质和RNA提取，请确认组织在第2部分和第4部分保持在低于4°C的温度。此外，由于关于VS分泌物分析的文献很少（第3节），新项目可能需要进一步创新和不同长度的孵化。
作为解决VS病理生物学的方法不断推进，使用这个str基本技术的电子组合将允许从单个人体样本中收集到最大量的信息。知情同步处理VS和GAN组织将成为对这种衰弱性肿瘤产生有效的药理学和遗传疗法的积极因素。
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Disclosures
作者没有什么可以披露的。
Acknowledgments
这项工作得到了国家失聪和其他传播障碍研究所的资助R01DC015824（KMS）和T32DC00038（支持JES和SD），国防部授予W81XWH-14-1-0091（KMS），贝塔雷利基金会（KMS） ，Nancy Sayles Day基金会（KMS），Lauer耳鸣研究中心（KMS）和Barnes Foundation（KMS）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| BioCoat Poly-D-Lysine/Laminin 12 mm #1 German Glass Coverslip | Corning | 354087 | Or prepare coverslips with Corning Laminin (CB-40232) and Cultrex Poly-L-Lysine (3438-100-01) |
| CELLSTAR 15 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 188161 | |
| CELLSTAR 50 mL Centrifuge Tubes, Conical bottom, Graduation, Sterile | Greiner Bio-One | 227261 | |
| CELLSTAR Cell Culture Dish, 60 mm | Greiner Bio-One | 628160 | |
| Collagenase from Clostridium histolyticum, Sterile-filtered | Sigma-Aldrich | C1639 | |
| Costar 24 Well Clear TC-Treated Multiple Well Plates, Sterile | Corning | 3526 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermo Fisher Scientific | D1306 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate, no glutamine, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10313-039 | |
| DMEM/F-12, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 11320-033 | |
| Dumont #3 Forceps, Dumoxel | Fine Science Tools | 11231-30 | Autoclave prior to use |
| Dumont #5 Forceps, Standard tip, Inox | Fine Science Tools | 11251-20 | Autoclave prior to use |
| Fetal Bovine Serum, qualified, USDA-approved regions, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10437-028 | Aliquot in 50 mL tubes and store in -20°C freezer |
| Hyaluronidase from Bovine Testes, Type I-S, Lyophilized Powder | Sigma-Aldrich | H3506 | |
| Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, sterile | EMD Millipore | SLGP033RS | |
| Paraformaldehyde, Reagent Grade, Crystalline | Sigma-Aldrich | P6148 | Prior to use: Establish Standard Operating Procedures based on protocols available online |
| PBS, pH 7.4, 500 mL | Thermo Fisher Scientific | 10010-023 | Autoclave prior to use |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL), 100 mL | Thermo Fisher Scientific | 15140-122 | |
| PhosSTOP Phosphatase Inhibitor Tablets | Roche | 04906845001 | |
| Pierce Protease Inhibitor Tablets | Thermo Fisher Scientific | 88666 | |
| Pipettes and pipette tips, 5/10/25 mL | Variable | Variable | |
| Plastic Homogenization Pestle for 1.5/2.0 mL Microtubes | E&K Scientific | EK-10539 | |
| PrecisionGlide Needles, 27 G x 1 1/2 in | BD | 301629 | |
| RIPA Buffer | Boston BioProducts | BP-115 | |
| RNAlater (RNA stabilization solution) | Thermo Fisher Scientific | AM7021 | |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 0.5 mL | Eppendorf | 022363719 | Autoclave prior to use |
| Safe-Lock Microcentrifuge Tubes, Polypropylene, 1.5 mL | Eppendorf | 022363204 | Autoclave prior to use |
| Saline - 0.9% Sodium Chloride Injection, bacteriostatic, 20 mL | Hospira | 0409-1966-05 | |
| Scalpel Blades - #15 | Fine Science Tools | 10015-00 | |
| Schuknecht Suction Tube 24 gauge | Bausch + Lomb | N1698 42 | Useful for the surgical approach (in addition to common otologic surgical instruments) and e.g. a blue surgical marker |
| Specimen Container, OR sterile, 4OZ | Medline | DYND30331H | |
| Stemi 2000-C Stereo Microscope | Zeiss | 000000-1106-133 | |
| Syringe/Needle Combination, Luer-Lok Tip, 5 mL, 22 G x 1 in. | BD | 309630 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 1 mL | BD | 309659 | |
| Tuberculin Syringe Only, Slip tip, 3 mL | BD | 309656 | |
| Ultrasonic homogenizer, 4710 Series, CV18 probe | Cole-Parmer | CP25013 |
References
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