Name: Patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprende a crear patrones proteicos bioactivos inmovilizados en hidrogeles de PEG mediante fotoquímica para estudiar respuestas celulares in vitro. Este método permite recapitular señales in vivo con aplicaciones en ingeniería de tejidos.

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Este estudio fue apoyado principalmente por donaciones de subvención de desarrollo científico de corazón Asociación Americana (12SDG12050083 a G.D.), los institutos nacionales de salud (R21HL102773, R01HL118245 a G.D.) y la National Science Foundation (CBET-1263455 y CBET-1350240 a G.D.).

1. preparación de materiales para la síntesis de hidrogel <ol><li>Preparar soluciones madre de PEGDA, fenil litio-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) y fibronectina en condiciones estériles y en cálculos (tabla 1A).
	<ol><li>Pesar y disolver compuestos en solución salina tamponada con fosfato (PBS). Por lo general, mantener PEGDA concentraciones entre 50 y 200 mg/mL (5-20% peso/volumen) de solución de trabajo. Pipetear la solución PEGDA a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm para la esterilización de. 
		Nota: Mantenga las soluciones PEGDA cubiertas con una papel de embalaje para proteger de la luz. Preparar una solución fresca de PEGDA (recomendado) para cada experimento.</li>
		<li>Reconstituir fibronectina proteína en polvo basado en el fabricante &#39; recomendación de s. Mantener la solución 1 mg/ml, de alícuota fibronectina en alícuotas de 60 a 100 μl y almacenarlos a-20 ° C hasta su uso. Descongelar las alícuotas a 4 º C durante varias horas o durante la noche antes de usar. Si la acción de la proteína ya no está prevista en condiciones estériles, utilice un filtro de jeringa de 0,22 μm para la esterilización. 
		Nota: Fibronectina se utiliza para la fijación de la célula. Pueden sustituirse otras proteínas ECM.</li>
		<li>Pesar LAP para la solución y disolverlo en PBS, una típica concentración stock es 25 mg/mL. Someter a ultrasonidos si hay algún problema con la disolución. Pasar la solución por un filtro 0,22 μm de esterilización. Cubrir la vuelta con un envoltorio de papel de aluminio y guardar a 4 ° C por hasta varios meses. 
		Nota: LAP es el fotoiniciador utilizado para la fotoquímica.</li>
	</ol></li> <li>Preparar moldes de diapositivas de vidrio estéril para hidrogel formación.
	<ol><li>Autoclave un poliéster HOJA; uno es necesario para cada molde de gel. Remoje dos portaobjetos de cristal y tres espaciadores de plástico (0,5 mm de espesor) para cada molde de gel en etanol al 70% durante al menos 2 h, pero generalmente, déjelos remojando la noche anterior. Remojar cinco clips de carpeta para cada molde de gel en etanol al 70% para 10 minutos antes del uso.</li>
		<li>Colocar el portaobjetos de vidrio, separadores y clips binder sobre una pequeña hoja esterilizada en la campana de la cultura de célula para permitirles al aire seco durante varias horas.</li>
		<li>Moldes de hidrogel preparación colocando espaciadores de plástico alrededor del borde de un portaobjetos de vidrio. Colocar el segundo portaobjetos de cristal en la parte superior. Garantizar los espaciadores firmemente al lado de uno con los clips de la carpeta, dos en cada lado largo y uno en la parte superior. 
		Nota: Si esto no es montado correctamente, la solución gel se derramará.</li>
		<li>Esterilización de superficie el molde con cultivo celular campana UV luz 30 minutos antes de usar. A la mitad, voltear el molde para exponer las dos superficies.</li>
	</ol></li></ol> 2. Modificación de proteínas con un tiol libre <ol><li>Preparar soluciones madre, utilizando cálculos de la hoja de cálculo para convertir aminas en grupos tiol en proteínas (tabla 1A).
	<ol><li>Para hacer el tampón de reacción, ajuste el PBS a pH 8 y añadir 5 mM EDTA. Tampón de reacción de pipeta a un filtro de jeringa de 0,22 μm para la esterilización de. 
		Nota: El EDTA es importante, como protege tioles formando enlaces disulfuro. Grupos tiol deben permanecer en su forma reducida por la reacción ocurrir.</li>
		<li>Pesar 2-iminothiolane (Traut &#39; s reactivo) y disolver en buffer de reacción para la concentración de una solución de 2 mg/mL (14 mM). Pasar la solución por un filtro de jeringa de 0,22 μm para la esterilización. Almacenar la solución a 4 ° C por hasta varios meses. 
		Nota: 2-iminothiolane es la molécula que reacciona con las aminas libres expuestos al solvente de las proteínas y las convierte en tioles gratis.</li>
		<li>Reconstituir la proteína en buffer de reacción a una concentración entre 0,1 y 1 mg/mL. A menos que previamente estéril, pipeta esta solución a través de un filtro de jeringa de 0,22 μm para la esterilización de. 
		Nota: Esta proteína es la señal bioquímica que va estampada en la superficie del hidrogel. También, mientras que las concentraciones de proteína pueden variar, concentraciones más altas son ideales para patrones de proteína mayor.</li>
	</ol></li> <li>Reaccionar las proteínas con 2 iminothiolane mezclando dos soluciones madre; utilizar 1B de la tabla para calcular el ratio de volumen correcto. Normalmente, utilizar una relación molar de 2-iminothiolane de 8:1 a la proteína de. 
	Nota: Para las proteínas más grandes o más diluir concentraciones, usar una mayor fracción molar de 2-iminothiolane. Consulte al fabricante &#39; s protocolo 15.</li>
	<li>Incubar la reacción por 1 h a temperatura ambiente. Utilizar una micro-columna de desalación centrifugado para extraer el producto de la proteína thiolated los reactivos restantes, siguiendo el fabricante &#39; s protocolo 16. 
	Nota: El límite de exclusión de esta resina es KDa 5.</li>
	<li>Uso Ellman &#39; s de ensayo para medir cuantitativamente el número de tioles libres por proteína. Siga el fabricante &#39; protocolo de s para el ensayo 17.</li>
</ol> 3. Formación de hidrogel <ol><li>crear la solución precursora de gel basada en valores calculados a partir de tabla 1. Mezclar el PEGDA, fibronectina, volúmenes de vuelta. Pipetear la solución vigorosamente para asegurar una solución homogénea y evitar la creación de burbujas. Mantener la solución protegida de la luz.</li>
	<li>Pipetear la solución precursora de gel cuidadosamente entre los dos portaobjetos del molde del gel. Por lo general, añadir un volumen de entre 800 y 1.000 μl al molde. Exponga la solución del gel en el molde a la luz UV (longitud de onda: 365 nm, potencia: 3-4 mW/cm 2) por 1-2 min formar el hidrogel. 
	Nota: No exponer el hidrogel a la luz UV prolongada, ya que limitará la proteína superficial patrones capacidades.</li>
	<li>Quitar los clips de la carpeta y eliminar suavemente el portaobjeto superior aplicando frente a la presión a los espaciadores laterales.</li>
	<li>Utilizar un punch de biopsia de tamaño adecuado para cortar las muestras de hidrogel. Perfore múltiples hidrogeles de rectángulo gel repeticiones y las muestras de control.</li>
</ol> 4. Medidas de rigidez de hidrogel sacador de biopsia <ol><li>Punch out hidrogeles con 8 mm de diámetro para un reómetro de placas paralelas de 8 mm. Cargar una muestra de hidrogel en el Reómetro (véase la Tabla de materiales).</li>
	<li>Bajo la geometría de placas paralelas es de 8 mm de diámetro hasta hacer contacto con la superficie del gel. Mantenga una distancia de separación de 0,5 mm para una muestra de 0,5 mm de espesor hidrogel.</li>
	<li>Realizar barridos de tiempo durante 5 minutos a la tensión de 0,1%, frecuencia de 0.1 Hz y 37 º C. promedio el G &#39; valores a través de cada barrido de tiempo. Funcionamiento independiente hidrogeles para réplicas de cada composición. 
	Nota: La G &#39; valores deben ser estables a través de puntos de tiempo; Si no, colar por ciento y barridos de frecuencia se deben realizar para seleccionar los apropiados valores de 14.</li>
</ol> 5. Proteína patrón <ol><li>preparar el patrón deseado de la fotomáscara utilizando un programa de diseño asistido por ordenador. Imprimir el photomask en una hoja transparente utilizando una impresora de alta resolución. Remoje el photomask en etanol al 70% para 10 minutos antes de usar. Seque el photomask al aire en una campana de cultivo celular antes de su uso.</li>
	<li>Añadir la solución de proteína thiolated preparada en el paso 2 a la superficie del hidrogel para modelar superficial. Pipeta de 1-2 μl/cm 2 de thiolated solución de proteína a la superficie de cada corte gel. 
	Nota: Es importante minimizar el volumen de proteína; sólo añadir lo suficiente para cubrir uniformemente toda la superficie de la muestra de hidrogel.</li>
	<li>Coloque con cuidado el photomask en la superficie del hidrogel. No permita que las burbujas de aire entre el photomask y la superficie del hidrogel. Suavemente presione la mascarilla para eliminar las posibles burbujas que se forman.</li>
	<li>Exponer el hidrogel a una segunda ronda de la luz UV (longitud de onda: 365 nm, potencia: 3-4 mW/cm 2) de 30-60 s. 
	Nota: Es importante el patrón de exposición a suficiente luz ultravioleta para crear un patrón fuerte sin causar la pérdida de función de la proteína.</li>
	<li>Lave los hidrogeles con PBS para eliminar especies no reaccionadas y colocar cada hidrogel dentro de la placa de la pozo. Tenga cuidado al colocar los geles en cada pozo; Asegúrese de que la superficie estampada está boca arriba. Los geles de lavado en PBS a 4 ° C; los geles son estables por al menos dos semanas a 4 ° C.</li>
</ol> 6. Preparación de hidrogeles para la siembra de células <ol><li>incubar los geles en medio basal durante 5-10 min a 37 ° C antes de la siembra. Células endoteliales de vena umbilical humano (HUVECs), utilizar medio EGM-2 sin factores de crecimiento. Minimizar el volumen del medio añadido a cada uno para evitar la flotación de hidrogel. Para una placa de 48 pozos, utilice un volumen de 250 μl de medio.</li>
	<li>Vuelta abajo de la placa a 300 x g durante 3 minutos asegurar que los hidrogeles están situados en la parte inferior del pozo y no flotantes. Hacer esto inmediatamente antes de la siembra celular.</li>
</ol> 7. Siembra en los hidrogeles de la célula <ol><li>uso procedimientos de cultivo de células de mamífero estéril estándar para la siembra de células y procedimientos experimentales. Saque de HUVECs de frascos de cultivo de tejidos, utilizando protocolos de separación celular estándar. Lavar el plato de cultivo de tejido con PBS estéril e incubar con tripsina para 3-5 min a 37 ° C.</li>
	<li>Saciar la suspensión celular tripsinizaron con exceso celular medio o tripsina neutralizador solución.</li>
	<li>Girar por la suspensión de células en la centrifugadora a 300 x g por 5 min con cuidado quite el sobrenadante y mantener el sedimento celular.</li>
	<li>Resuspender el precipitado de células en el EGM-2 basal sin factores de crecimiento. Utilizar un hemocitómetro para recuento celular.</li>
	Superficie de <li>añadir 75.000 células/cm 2 para cada hidrogel transfiriendo poco a poco en el centro de cada bien para no molestar a los geles. Coloque la placa de la pozo en una incubadora de cultivo de células a 37 ° C. Para varios días, periódicamente Retire el plato para la observación de.</li>
</ol> 8. Evaluación de bioactividad <ol><li>cultura e. coli durante la noche en suspensión en caldo LB en una orbital suspensión a 37 ° C y 200 rpm. Desactivación de la cultura de e. coli, decantar y reconstituir el precipitado de células en volumen mínimo de PBS. Pesar la lisozima y reconstituir en 1 mg/mL de la solución.</li>
	<li>Pipetear un volumen pequeño (25 μl) de solución stock de lisozima en tubos de microcentrífuga. Añadir diferentes niveles de fotoiniciador de vuelta (0-12 mM) y exponer las muestras a 1 minuto de la luz UV. En un grupo separado, agregue la misma cantidad de vueltas (2 mM) a solución de lisozima y exponer las muestras a diferentes tiempos de luz UV (0-4 min). Son repeticiones para cada tratamiento.</li>
	Solución de <li>Agregar un volumen igual de concentrada e. coli para cada muestra de lisozima a una concentración de proteína lisozima final de 0,5 mg/mL. Incubar las soluciones mixtas de 4 h a temperatura ambiente. 
	Nota: Esto permite tiempo para lisozima funcional lisar la pared celular bacteriana y liberar las proteínas en la solución de.</li>
	<li>Uso lisozima no tratada se incubaron con e. coli para un control positivo, considera esto una medida bioactivos del 100%. Use una solución de lisozima se incubaron con PBS solo como control negativo.</li>
	<li>Vuelta abajo las muestras para eliminar restos celulares y conservar el sobrenadante. Ejecutar un ensayo de Bradford para cuantificar la concentración total de proteína en el sobrenadante para medir la cantidad de lisado bacteriano.</li>
	<li>Ejecutar un ensayo de Bradford tras el fabricante &#39; s protocolo 18. Calcular el doble cambio en la concentración de proteína en comparación con el control negativo.</li>
</ol>

<ol><li>Yao, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-effects+of+matrix+low+elasticity+and+aligned+topography+on+stem+cell+neurogenic+differentiation+and+rapid+neurite+outgrowth%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Co-effects of matrix low elasticity and aligned topography on stem cell neurogenic differentiation and rapid neurite outgrowth.</a> Nanoscale. 8 (19), 10252-10265 (2016).</li>
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<li>Sridhar, B. V., Doyle, N. R., Randolph, M. A., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Covalently+tethered+TGF-beta1+with+encapsulated+chondrocytes+in+a+PEG+hydrogel+system+enhances+extracellular+matrix+production%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Covalently tethered TGF-beta1 with encapsulated chondrocytes in a PEG hydrogel system enhances extracellular matrix production.</a> J Biomed Mater Res A. 102 (12), 4464-4472 (2014).</li>
<li>Salinas, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Decorin+moieties+tethered+into+PEG+networks+induce+chondrogenesis+of+human+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+A%22%5BJournal%5D)">Decorin moieties tethered into PEG networks induce chondrogenesis of human mesenchymal stem cells.</a> J Biomed Mater Res A. 90 (2), 456-464 (2009).</li>
<li>Joddar, B., Guy, A. T., Kamiguchi, H., Ito, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+gradients+of+chemotropic+factors+from+immobilized+patterns+to+guide+axonal+growth+and+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Spatial gradients of chemotropic factors from immobilized patterns to guide axonal growth and regeneration.</a> Biomaterials. 34 (37), 9593-9601 (2013).</li>
<li>Wylie, R. G., Ahsan, S., Aizawa, Y., Maxwell, K. L., Morshead, C. M., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatially+controlled+simultaneous+patterning+of+multiple+growth+factors+in+three-dimensional+hydrogels%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Mater%22%5BJournal%5D)">Spatially controlled simultaneous patterning of multiple growth factors in three-dimensional hydrogels.</a> Nat Mater. 10 (10), 799-806 (2011).</li>
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<li>Saik, J. E., Gould, D. J., Keswani, A. H., Dickinson, M. E., West, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+hydrogels+with+immobilized+ephrinA1+for+therapeutic+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Biomimetic hydrogels with immobilized ephrinA1 for therapeutic angiogenesis.</a> Biomacromolecules. 12 (7), 2715-2722 (2011).</li>
<li>McCall, J. D., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thiol-ene+photopolymerizations+provide+a+facile+method+to+encapsulate+proteins+and+maintain+their+bioactivity%5BTitle%5D)+AND+%22Biomacromolecules%22%5BJournal%5D)">Thiol-ene photopolymerizations provide a facile method to encapsulate proteins and maintain their bioactivity.</a> Biomacromolecules. 13 (8), 2410-2417 (2012).</li>
<li>Fairbanks, B. D., Schwartz, M. P., Bowman, C. N., Anseth, K. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photoinitiated+polymerization+of+PEG-diacrylate+with+lithium+phenyl-2%2C4%2C6-trimethylbenzoylphosphinate%3A+polymerization+rate+and+cytocompatibility%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Photoinitiated polymerization of PEG-diacrylate with lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate: polymerization rate and cytocompatibility.</a> Biomaterials. 29 (6), 997-1003 (2009).</li>
<li>Zuidema, J. M., Rivet, C. J., Gilbert, R. J., Morrison, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+protocol+for+rheological+characterization+of+hydrogels+for+tissue+engineering+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biomed+Mater+Res+B+Appl+Biomater%22%5BJournal%5D)">A protocol for rheological characterization of hydrogels for tissue engineering strategies.</a> J Biomed Mater Res B Appl Biomater. 102 (5), 1063-1073 (2014).</li>
<li>Truat's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/.../MAN0011238_Trauts_Reag_UG.pdf</a> (2017).</li>
<li>Ellman's Reagent Instructions. Thermo Scientific. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf">https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011216_Ellmans_Reag_UG.pdf</a> (2017).</li>
<li>Desalting Columns. GE Life Sciences. , Available from: 
 <a target="_blank" href="https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf">https://www.gelifesciences.com/gehcls_images/GELS/Related%20Content/Files/1478781880316/litdoc52130800_2016111034421.pdf</a> (2017).</li>
<li>Quick State Bradford Reagent Protein Assay, Instruction Manual. Bio-Rad. , Available from: 
 <a target="_blank" href="http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf">http://www.bio-rad.com/webroot/web/pdf/lsr/literature/4110065A.pdf</a> (2017).</li>
</ol>

Los autores no tienen nada que revelar.

Este protocolo proporciona un método para la creación de patrones de proteínas bioactivas para aplicaciones biológicas. Hay varias modificaciones que pueden realizarse para adaptarse a este protocolo para diversos experimentos. En primer lugar, requisitos de accesorio celular variará para diferentes tipos de células. Si inicialmente se observa un apego pobre celular a los geles, aumentando la concentración de la proteína de la ECM en la solución precursora se recomienda. Otras proteínas de la ECM se pueden utilizar en lu...

Hay muchos estímulos que influyen en comportamiento celular. En general, técnicas de cultivo de célula típica dependen de factores solubles que provocan respuestas celulares; sin embargo, existen limitaciones a este enfoque. Estos métodos no son capaces de mostrar con precisión todos motivos señalización comúnmente en vivo. Tales mecanismos de señalización incluyen factores de crecimiento secuestradas, célula de señalización y señales bioquímicas espacial específica. Además, rigidez de sustrato puede jugar un papel importante en la diferenciación de comportamiento y célula de vástago de la célula y no se manipula fácilmente usando el cultivo común de la célula1,de prácticas2. Biomaterial enfoques ofrecen una nueva plataforma para comenzar a explorar estos mecanismos de señalización. En particular, los hidrogeles son excelentes candidatos para tuning sustrato rigidez3,4, inmovilización de proteínas y péptidos5,6y la creación de patrones espacialmente específica7, 8.
Los hidrogeles se usan como andamios en la ingeniería del tejido fino debido a sus características biofísicas y bioquímicas comunes con la matriz extracelular (MEC)9,10. Polímeros naturales son opciones comunes para andamios, ya que son biocompatibles y se encuentran en muchos tejidos del cuerpo. La limitación del uso de polímeros naturales como sustratos es que carecen de grupos químicos fácilmente manipulables para bioconjugation. Por otro lado, hidrogel sintético, así como PEG, es excelentes plataformas para químicos específicos11,12. Además, hidrogeles de PEG no provocan una respuesta celular y por lo tanto se utilizan como columna vertebral inerte para crear andamios bioactivos.
Para crear hidrogeles bioactivos, fotopolimerización y tiol-ene química se emplean reacciones click. Estos photoreactions requieren un fotoiniciador y una fuente de luz UV. Cuando fotoiniciadores se introducen a la luz UV, bonos rompen para formar radicales. Los radicales de la tesis son necesarios para iniciar la reacción pero pueden afectar negativamente la proteína bioactividad12,13. Por lo tanto, es crucial optimizar el fotoiniciador y tiempos de exposición de rayos UV para mantener la bioactividad de la proteína.
En este método, los hidrogeles se sintetizan mediante fotopolimerización de crecimiento de cadena acrylate-acrilato. PEG-diacrylate (PEGDA) monómeros reaccionan entre sí para formar redes de polímeros ramificados responsables de la estructura del hidrogel. La concentración de monómeros PEGDA dentro de la solución precursora de gel de control de la rigidez del sustrato. Debido al pequeño tamaño del hidrogel de poro, proteínas ECM como la fibronectina pueden ser fácilmente incorporadas en el hidrogel con el fin de archivo adjunto de la celular. Finalmente, estos hidrogeles pueden ser superficie modelada con péptidos bioactivos o proteínas vía tiol-ene en reacciones de química. Aquí, acrilatos libre sin reaccionar dentro del sistema de hidrogel reaccionará con tioles libres en la proteína o péptido cuando se expone a la luz UV. Después de que las proteínas o péptidos son inmovilizados en la superficie del hidrogel, el hidrogel puede almacenarse a 4 ° C durante varias semanas sin perder la bioactividad. Esto ofrece conveniencia, planificación experimental flexible y la posibilidad de colaboración entre laboratorios. En general, esta plataforma permite controlar bioquímica biomecánica y espacial, independiente unos de otros, por la oportunidad de influir en el comportamiento celular.

<table><tbody><tr><td>PEG-diacrilato (PEGDA)</td><td>Laysan Bio</td><td>ACRL-PEG-ACRL-3400</td><td>También se puede sintetizar o comprar a través de otros vendedores. Se pueden utilizar diferentes pesos moleculares.</td></tr><tr><td>Litio Fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato (LAP)</td><td></td><td></td><td>Sintetizado en laboratorio</td></tr><tr><td>Fibronectina</td><td>Corning 356008</td><td></td><td>Se pueden utilizar otras proteínas de unión celular, como laminina, matrigel</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Sigma</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Photomask</td><td>FineLine Imaging</td><td>n/a</td><td>Impresiones personalizadas en hojas transparentes con DPI de alta resolución.</td></tr><tr><td>Clips de carpeta</td><td>Varios proveedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fuente de luz UV compacta (365 nm)</td><td>UVP</td><td>UVP-21</td><td>Se pueden utilizar otras fuentes de luz UV, se requiere calibración de la potencia.</td></tr><tr><td>2-iminotiolano (Pierce Traut' s Reactivo)</td><td>Thermo Sci.</td><td>26101</td><td></td></tr><tr><td>Ellman' s Reactivo: DTNB; 5,5-ditio-bis(ácido 2-nitrobenzoico)</td><td>Thermo Sci.</td><td>22582</td><td></td></tr><tr><td>células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVECs)</td>Número de paso de <td>Lonza</td><td></td><td>entre 6-10</td></tr><tr><td>EGM-2 Media</td><td>Lonza</td><td>CC31-56, CC-3162</td><td>EGM-2 sin factores de crecimiento se utilizó en experimentos. Se utilizaron medios EGM-2 completos para el mantenimiento de la célula</td></tr><tr><td>0,25% de tripsina EDTA</td><td>Life Tech</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Neutralizador de tripsina</td><td>Life Tech</td><td>R-002-100</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Varios vendedores</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hemocitómetro</td><td>Hausser Sci. Línea brillante</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Etilendiaminoácido tetraacético (EDTA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>0.22 y micro; m filter</td><td>Cell Treat</td><td>229743</td><td></td></tr><tr><td>1mL Jeringa de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>vidrio Portaobjetos de microscopio</td><td>Fisher Sci.</td><td>12-550C</td><td></td></tr><tr><td>Espaciadores de plástico</td><td>Varios proveedores 0,5</td><td></td><td>mm de espesor</td></tr><tr><td>70% Etanol</td><td>BICCA</td><td>2546.70-1</td><td></td></tr><tr><td>Bio-shield</td><td>Bio-shield</td><td>19-150-0010</td><td></td></tr><tr><td>Bradford Reagent&nbsp;</td>Resina desalinizante <td>BIO-RAD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Sephadex G-25</td><td>GE Healthcare</td><td>95016-754</td><td></td></tr><tr><td>Columnas Microspin</td><td>Thermo Sci.</td><td></td><td></td>PI69725</tr><tr><td>reemplazador AR-G2</td><td>TA Instruments</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos

Patterning Bioactive Proteins or Peptides on Hydrogel Using Photochemistry for Biological Applications

Hay muchos estímulos biológicos que pueden influir en la diferenciación celular de comportamiento y la célula de vástago. General de la célula cultura enfoques dependen de factores solubles en el medio al control celular comportamiento. Sin embargo, adiciones solubles no pueden imitar ciertos motivos, como factores de crecimiento de la matriz-limite de señalización, célula señalización y espaciales señales bioquímicas, que son influencias comunes en las células. Además, propiedades biofísicas de la matriz, como rigidez de sustrato, desempeñan papeles importantes en el destino de la célula, que no es manipulada fácilmente usando celular convencional, prácticas de cultivo. En este método, se describe un protocolo sencillo para proporcionar proteínas bioactivas modeladas en hidrogel sintético polietileno glicol (PEG) con fotoquímica. Esta plataforma permite el control independiente de la rigidez de sustrato y las señales bioquímicas espaciales. Estos hidrogeles pueden lograr una amplia gama de valores de rigidez fisiológicamente relevantes. Además, las superficies de estos hidrogeles pueden ser photopatterned con péptidos bioactivos o proteínas vía tiol-ene en las reacciones química. Estos métodos han sido optimizados para retener la función de la proteína después de la inmovilización de superficie. Se trata de un protocolo versátil que se puede aplicar a cualquier proteína o péptido de interés para crear una variedad de patrones. Finalmente, las células sembradas en las superficies de estos hidrogeles bioactivos pueden controlarse con el tiempo, como responden a señales específicas espacial.

El protocolo para crear patrones bioactivos en la superficie del hidrogel de PEG se ilustra en la figura 1. Una hoja de cálculo fue desarrollado para calcular el volumen y la concentración de cada solución madre (tabla 1A). Modificación de proteínas para ser inmovilizado sobre la superficie de la hidrogel con 2-iminothiolane (figura 1B). Esta reacción se realiza utilizando los volúmenes del <stro...

En este método, utilizamos fotopolimerización e inmovilización de técnicas de química haga clic en crear patrones de proteína o péptido en la superficie del hidrogel de polietilenglicol (PEG), proporcionando señales bioactivas para el estudio de las respuestas celulares en vitro .

Patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos

There are many biological stimuli that can influence cell behavior and stem cell differentiation. General cell culture approaches rely on soluble factors ...

El objetivo general de esta metodología es crear patrones espaciales de proteínas bioactivas inmovilizadas que puedan utilizarse para estudiar las respuestas celulares. Este método permite recapitular señales in vivo mediante estrategias de biomateriales. Esta técnica posibilita una simulación precisa de ciertos motivos de señalización que no pueden lograrse con métodos de cultivo estándar, como factores de crecimiento secuenciales, señalización entre células y señales bioquímicas específicas espacialmente.Este protocolo es significativo respecto a los métodos existentes porque proporciona un método sencillo para ajustar la rigidez del sustrato y el patrón de proteínas. Aunque este método puede mejorar las tecnologías de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, también puede aplicarse para estudiar otros sistemas, como el desarrollo tisular y el destino de las células madre. Para comenzar, prepare soluciones stock para el componente principal del hidrogel, el diacrilato de polietilenglicol, el iniciador fotoquímico, el fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio, y la proteína de la matriz extracelular, fibronectina, en condiciones estériles según se describe en el protocolo de texto adjunto.Filtrar estérilmente cada solución utilizando un filtro de jeringa de 0,22 micrones antes de usarla o almacenar las alícuotas individuales. Luego, envolver la solución de PEG-DA con papel de aluminio para protegerla de la luz. Envolver la solución stock del iniciador fotográfico con papel de aluminio para protegerla de la luz y almacenar la solución preparada a cuatro grados centígrados durante varios meses.Si la solución stock de fibronectina está congelada, deje que la alícuota estéril se descongele sobre hielo durante varias horas o a cuatro grados centígrados durante la noche. Comience por autoclavar una lámina de poliéster para cada molde de gel. Luego, sumerja dos portaobjetos de vidrio y tres separadores plásticos para cada molde de gel en etanol al 70 % durante al menos dos horas.Además, sumerja cinco clips sujetadores por cada molde de gel en etanol al 70 % durante 10 minutos. Coloque las láminas de vidrio, los espaciadores y los clips sujetadores sobre una hoja pequeña para autoclave en la cabina de cultivo celular para que sequen al aire durante varias horas. A continuación, prepare los moldes de hidrogel colocando los espaciadores de plástico de 0,5 milímetros de grosor alrededor del borde de una lámina de vidrio.Coloque la segunda lámina de vidrio encima y luego asegure firmemente los separadores uno al lado del otro con clips sujetadores. Finalmente, esterilice la superficie del molde colocándolo en la cabina y encendiendo la luz UV durante 30 minutos antes de usarlo. A la mitad del proceso de esterilización, déle vuelta al molde para asegurarse de exponer ambas superficies.Cree las soluciones precursoras del gel según se describe en la tabla uno del protocolo de texto adjunto. Luego, mezcle los volúmenes de PEG-DA, fibronectina e iniciador fotocurable para crear el hidrogel. Pipetee la solución enérgicamente para asegurar una solución homogénea, pero evite crear burbujas.Pipetee cuidadosamente la solución precursora del gel entre los dos portaobjetos de vidrio del molde para gel. Luego, coloque el molde bajo una luz UV y expóngalo durante uno o dos minutos para formar el hidrogel. Una vez formado el gel, retire las pinzas sujetadoras y extraiga suavemente el portaobjetos superior aplicando presión opuesta a los dos separadores laterales.Luego, utilice un punzón de biopsia de tamaño adecuado para recortar las muestras de hidrogel. Recorte múltiples hidogeles del rectángulo de gel para obtener réplicas y muestras de control. Esterilice la máscara fotográfica sumergiéndola en etanol al 70 % durante 10 minutos.Luego, deje que la máscara fotográfica se seque al aire en una cabina de cultivo celular. A continuación, pipetee de uno a dos microlitros por centímetro cuadrado de una solución de proteína tiolada sobre la superficie de cada hidrogel recortado para el patrón superficial. Es importante distribuir la solución de proteína uniformemente sobre la superficie del hidrogel para garantizar una inmovilización uniforme de la proteína.Coloque cuidadosamente la máscara fotográfica sobre la superficie del hidrogel. Presione suavemente la máscara para eliminar cualquier burbuja que se forme entre la máscara y la superficie del hidrogel. A continuación, coloque el hidrogel bajo la luz UV y expóngalo a una segunda ronda de luz UV durante 30 a 60 segundos.Lave los hidrogeles con PBS para eliminar cualquier especie no reaccionada y coloque cada hidrogel dentro de la placa de pocillos de manera que la superficie con el patrón quede hacia arriba. A continuación, lave los geles durante la noche en PBS a cuatro grados centígrados. Retire el PBS de los pocillos, luego agregue 250 microlitros de EGM2 basal en cada pocillo e incube los geles durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados.Durante la incubación, la tripsina digiere una placa de HUVECs casi confluentes en una suspensión celular única utilizando técnicas estándar. Luego, centrifugar la suspensión celular y eliminar cuidadosamente el sobrenadante. Re-suspender el botón celular en EGM2 basal sin factores de crecimiento añadidos y agregar parte de la suspensión celular a un hemocitómetro.Cuente las células para determinar la concentración. A continuación, centrifugue la placa que contiene los hidrogeles a 300 x G durante tres minutos, para asegurar que los hidrogeles se sitúen en el fondo del pocillo y no floten. Es fundamental que los hidrogeles no floten dentro de los pocillos.Los hidrogeles flotantes limitarán el éxito en la siembra celular y causarán problemas con la imagenología del hidrogel. Pipetee lentamente 75.000 células por centímetro cuadrado sobre el centro de cada superficie de hidrogel para no perturbar los geles. Luego, coloque la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados celsius.Durante varios días, retire periódicamente el cultivo para observar la migración celular en respuesta al patrón de proteína. Cambie el 50 % del medio cada dos o tres días. Al formar los hidrogeles, se pueden utilizar diversas concentraciones del precursor PEG-diacrilato para obtener la rigidez deseada del sustrato.Como se muestra aquí, una solución de PEG-DA al 20 % se correlaciona con una rigidez superior a 100 kilopascales. También es importante considerar tanto la concentración del iniciador fotográfico como el tiempo de exposición a la luz UV, ya que un aumento en cualquiera de estas variables disminuirá la bioactividad de las moléculas unidas, representada aquí por la bioactividad de la lisozima. Minimizar la exposición a la luz UV durante la formación del hidrogel es fundamental para mantener grupos funcionales acrilato libres para reacciones posteriores de inmovilización de proteínas.Los hidrogeles expuestos a luz UV durante más de dos minutos no pueden crear patrones de proteínas inmovilizadas mostrados en rojo. Además, a medida que aumenta la exposición a UV del patrón de proteínas, más proteínas reaccionan con la superficie. Cuando se preparan correctamente, las células pueden cultivarse sobre estos sustratos de hidrogel con patrones para manipular su comportamiento.Aquí, las células endoteliales se sembraron de manera uniforme sobre la superficie de los hidrogeles de PEG con patrón de VEGF. Dos días después de la siembra, se observó que las células endoteliales migraban hacia las regiones espaciales del hidrogel que contenían la VEGF inmovilizada. Tras el desarrollo de este protocolo, los investigadores pueden utilizarlo para inmovilizar cualquier proteína o péptido con el fin de explorar nuevas plataformas bioactivas para sistemas celulares in vitro.Al realizar este procedimiento, es importante recordar minimizar la concentración del iniciador fotográfico y el tiempo de exposición a la luz UV para mantener la actividad biológica de las moléculas inmovilizadas. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear patrones de proteínas y péptidos bioactivos sobre hidrogeles de PEG, sembrar células de manera uniforme sobre los hidrogeles y observar la respuesta celular consecuente.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

En este protocolo, se demuestra la fabricación de una amplia microactuator de mensajes desplazadas verticalmente en que se basa la tecnología, y cómo esta tecnología de base pueden ser modificados para llevar a cabo de alto rendimiento de cultivo de células mecánica dinámica, tanto en la cultura de dos dimensiones y tres dimensiones paradigmas.

Plataformas microfabricated para el cultivo celular mecánico dinámico

Este video ilustrar un método rápido y eficiente de metacrilato de poli (etilenglicol), lo que permite polimerizaciones de cadena y la síntesis de hidrogel. Demostrará cómo introducir de manera similar funcionalidades metacrilamida en péptidos, detalle los métodos analíticos comunes para evaluar la eficiencia de funcionalización, proporcionar sugerencias para la solución de problemas y modificaciones avanzadas y demostrar las técnicas típicas de caracterización de hidrogel.

Funcionalización asistida por microondas de poli (etilenglicol) y los péptidos sobre resina para uso en polimerizaciones de cadena y Formación de hidrogel

Presentamos un nuevo hidrogel de poliacrilamida, llamado hidroxi-Paam, que permite una unión directa de las proteínas ECM con costo o experiencia mínima. La combinación de hidroxi-Paam hidrogeles con impresión por microcontacto facilita el control independiente de muchas señales del microambiente celular natural para el estudio de mechanostransduction celular.

Preparación de hidroxi-Paam hidrogeles para desacoplar los efectos de mecanotransducción Cues

Describimos un protocolo para modificar la afinidad celular de la superficie de un andamio en un entorno acuoso. El método aprovecha la fotocatálisis de dióxido de titanio para descomponer la película orgánica en la región fotoirradiada. Demostramos que se puede utilizar para crear microdominios de proteínas de andamiaje, tanto ex situ como in situ.

Photopatterning proteínas y células en el medio ambiente acuoso Usando TiO<sub&gt; 2</sub&gt; Fotocatálisis

Presentamos un protocolo para la síntesis de hidrogeles funcionalizados con RGD como dispositivos para la administración de células y fármacos. El procedimiento consiste en la cicloadición de alquina-azida catalizada por cobre (CuAAC) entre el ácido poliacrílico modificado con alquino (PAA) y un derivado de RGD-azida. Los hidrogeles se forman mediante policondensación asistida por microondas y se investigan sus propiedades fisicoquímicas.

La síntesis de hidrogeles funcionalizado-RGD como una herramienta para aplicaciones terapéuticas

Describimos un proceso secuencial para la formación mediada por luz y el posterior modelado bioquímico de matrices de hidrogel sintético para aplicaciones de cultivo celular tridimensional. Se demuestra la construcción y modificación de hidrogeles con química fotoclic citocompatible. Además, se presentan técnicas sencillas para cuantificar y observar patrones y determinar la viabilidad celular dentro de estos hidrogeles.

Formación luz mediada y el patrón de hidrogeles para aplicaciones de cultivo celular

Nuestro objetivo general es entender cómo las células detectan señales extracelulares que conducen al crecimiento axonal dirigido. Aquí, describimos la metodología de la Adsorción Molecular Inducida por la Luz de Proteínas, utilizada para producir micropatrones definidos de componentes de matriz extracelular con el fin de estudiar eventos específicos que rigen el crecimiento de axón y la búsqueda de rutas.

Adsorción molecular inducida por la luz de proteínas utilizando el sistema PRIMO para micro-patrones para estudiar las respuestas celulares a las proteínas de matriz extracelular

Este protocolo introduce un método de micropatrón libre de litografía que es simple y accesible para aquellos con un fondo de bioingeniería limitado. Este método utiliza plantillas de corte láser personalizadas para proteínas de matriz extracelular micropatrón en una forma de interés para la modulación de morfologías celulares. El procedimiento para el micropatrón se demuestra utilizando cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas.

Micropatrón simple de células únicas sin litografía con plantillas de corte láser

La litografía UV cercana y la microscopía de fuerza de tracción se combinan para medir las fuerzas celulares en hidrogeles con micropatrones. La liberación dirigida inducida por la luz de células individuales permite un alto número de mediciones en la misma muestra.

Control de la adhesión celular mediante técnicas de patrón de hidrogel para aplicaciones en microscopía de fuerza de tracción

Describimos mejoras en un método estándar para medir las fuerzas de tracción celular, basado en la impresión de microcontacto con un solo paso de patrón sustractivo de matrices de puntos de proteínas de matriz extracelular en hidrogeles blandos. Este método permite una fabricación más simple y consistente de patrones de islas, esencial para controlar la forma del grupo celular.

Generación de patrones para microscopía de tracción de micropatrones

Este protocolo presenta tres métodos de preparación rápidos y sencillos que utilizan las condiciones ambientales para desencadenar el autoensamblaje de péptidos en hidrogeles. Además, se describe la caracterización de los hidrogeles peptídicos, demostrando que se pueden formar hidrogeles peptídicos mecánicamente estables en estas sencillas condiciones.

Preparación de hidrogeles de péptidos autoensamblados mecánicamente estables

Aprende a crear patrones proteicos bioactivos inmovilizados en hidrogeles de PEG mediante fotoquímica para estudiar respuestas celulares in vitro. Este método permite recapitular señales in vivo con aplicaciones en ingeniería de tejidos.

Patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos

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