Patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos

El objetivo general de esta metodología es crear patrones espaciales de proteínas bioactivas inmovilizadas que puedan utilizarse para estudiar las respuestas celulares. Este método permite recapitular señales in vivo mediante estrategias de biomateriales. Esta técnica posibilita una simulación precisa de ciertos motivos de señalización que no pueden lograrse con métodos de cultivo estándar, como factores de crecimiento secuenciales, señalización entre células y señales bioquímicas específicas espacialmente.

Este protocolo es significativo respecto a los métodos existentes porque proporciona un método sencillo para ajustar la rigidez del sustrato y el patrón de proteínas. Aunque este método puede mejorar las tecnologías de ingeniería de tejidos y medicina regenerativa, también puede aplicarse para estudiar otros sistemas, como el desarrollo tisular y el destino de las células madre. Para comenzar, prepare soluciones stock para el componente principal del hidrogel, el diacrilato de polietilenglicol, el iniciador fotoquímico, el fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de litio, y la proteína de la matriz extracelular, fibronectina, en condiciones estériles según se describe en el protocolo de texto adjunto.

Filtrar estérilmente cada solución utilizando un filtro de jeringa de 0,22 micrones antes de usarla o almacenar las alícuotas individuales. Luego, envolver la solución de PEG-DA con papel de aluminio para protegerla de la luz. Envolver la solución stock del iniciador fotográfico con papel de aluminio para protegerla de la luz y almacenar la solución preparada a cuatro grados centígrados durante varios meses.

Si la solución stock de fibronectina está congelada, deje que la alícuota estéril se descongele sobre hielo durante varias horas o a cuatro grados centígrados durante la noche. Comience por autoclavar una lámina de poliéster para cada molde de gel. Luego, sumerja dos portaobjetos de vidrio y tres separadores plásticos para cada molde de gel en etanol al 70 % durante al menos dos horas.

Además, sumerja cinco clips sujetadores por cada molde de gel en etanol al 70 % durante 10 minutos. Coloque las láminas de vidrio, los espaciadores y los clips sujetadores sobre una hoja pequeña para autoclave en la cabina de cultivo celular para que sequen al aire durante varias horas. A continuación, prepare los moldes de hidrogel colocando los espaciadores de plástico de 0,5 milímetros de grosor alrededor del borde de una lámina de vidrio.

Coloque la segunda lámina de vidrio encima y luego asegure firmemente los separadores uno al lado del otro con clips sujetadores. Finalmente, esterilice la superficie del molde colocándolo en la cabina y encendiendo la luz UV durante 30 minutos antes de usarlo. A la mitad del proceso de esterilización, déle vuelta al molde para asegurarse de exponer ambas superficies.

Cree las soluciones precursoras del gel según se describe en la tabla uno del protocolo de texto adjunto. Luego, mezcle los volúmenes de PEG-DA, fibronectina e iniciador fotocurable para crear el hidrogel. Pipetee la solución enérgicamente para asegurar una solución homogénea, pero evite crear burbujas.

Pipetee cuidadosamente la solución precursora del gel entre los dos portaobjetos de vidrio del molde para gel. Luego, coloque el molde bajo una luz UV y expóngalo durante uno o dos minutos para formar el hidrogel. Una vez formado el gel, retire las pinzas sujetadoras y extraiga suavemente el portaobjetos superior aplicando presión opuesta a los dos separadores laterales.

Luego, utilice un punzón de biopsia de tamaño adecuado para recortar las muestras de hidrogel. Recorte múltiples hidogeles del rectángulo de gel para obtener réplicas y muestras de control. Esterilice la máscara fotográfica sumergiéndola en etanol al 70 % durante 10 minutos.

Luego, deje que la máscara fotográfica se seque al aire en una cabina de cultivo celular. A continuación, pipetee de uno a dos microlitros por centímetro cuadrado de una solución de proteína tiolada sobre la superficie de cada hidrogel recortado para el patrón superficial. Es importante distribuir la solución de proteína uniformemente sobre la superficie del hidrogel para garantizar una inmovilización uniforme de la proteína.

Coloque cuidadosamente la máscara fotográfica sobre la superficie del hidrogel. Presione suavemente la máscara para eliminar cualquier burbuja que se forme entre la máscara y la superficie del hidrogel. A continuación, coloque el hidrogel bajo la luz UV y expóngalo a una segunda ronda de luz UV durante 30 a 60 segundos.

Lave los hidrogeles con PBS para eliminar cualquier especie no reaccionada y coloque cada hidrogel dentro de la placa de pocillos de manera que la superficie con el patrón quede hacia arriba. A continuación, lave los geles durante la noche en PBS a cuatro grados centígrados. Retire el PBS de los pocillos, luego agregue 250 microlitros de EGM2 basal en cada pocillo e incube los geles durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados.

Durante la incubación, la tripsina digiere una placa de HUVECs casi confluentes en una suspensión celular única utilizando técnicas estándar. Luego, centrifugar la suspensión celular y eliminar cuidadosamente el sobrenadante. Re-suspender el botón celular en EGM2 basal sin factores de crecimiento añadidos y agregar parte de la suspensión celular a un hemocitómetro.

Cuente las células para determinar la concentración. A continuación, centrifugue la placa que contiene los hidrogeles a 300 x G durante tres minutos, para asegurar que los hidrogeles se sitúen en el fondo del pocillo y no floten. Es fundamental que los hidrogeles no floten dentro de los pocillos.

Los hidrogeles flotantes limitarán el éxito en la siembra celular y causarán problemas con la imagenología del hidrogel. Pipetee lentamente 75.000 células por centímetro cuadrado sobre el centro de cada superficie de hidrogel para no perturbar los geles. Luego, coloque la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados celsius.

Durante varios días, retire periódicamente el cultivo para observar la migración celular en respuesta al patrón de proteína. Cambie el 50 % del medio cada dos o tres días. Al formar los hidrogeles, se pueden utilizar diversas concentraciones del precursor PEG-diacrilato para obtener la rigidez deseada del sustrato.

Como se muestra aquí, una solución de PEG-DA al 20 % se correlaciona con una rigidez superior a 100 kilopascales. También es importante considerar tanto la concentración del iniciador fotográfico como el tiempo de exposición a la luz UV, ya que un aumento en cualquiera de estas variables disminuirá la bioactividad de las moléculas unidas, representada aquí por la bioactividad de la lisozima. Minimizar la exposición a la luz UV durante la formación del hidrogel es fundamental para mantener grupos funcionales acrilato libres para reacciones posteriores de inmovilización de proteínas.

Los hidrogeles expuestos a luz UV durante más de dos minutos no pueden crear patrones de proteínas inmovilizadas mostrados en rojo. Además, a medida que aumenta la exposición a UV del patrón de proteínas, más proteínas reaccionan con la superficie. Cuando se preparan correctamente, las células pueden cultivarse sobre estos sustratos de hidrogel con patrones para manipular su comportamiento.

Aquí, las células endoteliales se sembraron de manera uniforme sobre la superficie de los hidrogeles de PEG con patrón de VEGF. Dos días después de la siembra, se observó que las células endoteliales migraban hacia las regiones espaciales del hidrogel que contenían la VEGF inmovilizada. Tras el desarrollo de este protocolo, los investigadores pueden utilizarlo para inmovilizar cualquier proteína o péptido con el fin de explorar nuevas plataformas bioactivas para sistemas celulares in vitro.

Al realizar este procedimiento, es importante recordar minimizar la concentración del iniciador fotográfico y el tiempo de exposición a la luz UV para mantener la actividad biológica de las moléculas inmovilizadas. Tras ver este video, debería tener una buena comprensión de cómo crear patrones de proteínas y péptidos bioactivos sobre hidrogeles de PEG, sembrar células de manera uniforme sobre los hidrogeles y observar la respuesta celular consecuente.