Patrones bioactivas proteínas o péptidos en hidrogel con fotoquímica para usos biológicos

El objetivo general de esta metodología es crear patrones de proteínas espaciales bioactivas inmovilizadas que se utilicen para estudiar las respuestas celulares. Este método permite recapitular señales in vivo utilizando estrategias de biomateriales. Esta técnica permite la imitación precisa de ciertos motivos de señalización que no se pueden lograr utilizando métodos de cultivo estándar, como factores de crecimiento secuenciales, células, señales celulares y señales bioquímicas espaciales específicas.

Este protocolo es importante para los métodos existentes, ya que proporciona un método simplista para ajustar la rigidez del sustrato y el patrón de proteínas. Si bien este método puede promover la ingeniería de tejidos y las tecnologías de medicina regenerativa, también se puede aplicar para estudiar otros sistemas, como el desarrollo de tejidos y el destino de las células madre. Para empezar, prepare soluciones madre para el componente principal del hidrogel, el diacrilato de polietilenglicol, el fotoiniciador, el fenil-2, 4, 6-trimetilboilfosfinato de litio y la proteína ECM, fibronectina, en condiciones estériles como se describe en el protocolo de texto adjunto.

Filtro: Esterilice cada solución con un filtro de jeringa de 0,22 micras antes de usar o almacenar las alícuotas individuales. Luego, envuelva la solución de PEG-DA con papel de aluminio para protegerla de la luz. Envuelva la solución madre del iniciador fotográfico en papel de aluminio para protegerla de la luz y almacene la solución preparada a cuatro grados centígrados durante varios meses.

Si la solución madre de fibronectina está congelada, deje que la alícuota estéril se descongele en hielo durante varias horas o a cuatro grados centígrados durante la noche. Comience esterilizando en autoclave una lámina de poliéster para cada molde de gel. A continuación, sumerja dos portaobjetos de vidrio en tres espaciadores de plástico para cada molde de gel en etanol al 70% durante al menos dos horas.

Además, remoje cinco clips aglutinantes para cada molde de gel en etanol al 70% durante 10 minutos. Coloque los portaobjetos de vidrio, los espaciadores y los clips aglutinantes en una pequeña hoja de autoclave en la campana de cultivo celular para permitir que se sequen al aire durante varias horas. A continuación, prepare los moldes de hidrogel colocando los espaciadores de plástico de 0,5 milímetros de grosor alrededor del borde de un portaobjetos de vidrio.

Coloque el segundo portaobjetos de vidrio en la parte superior y luego asegure los espaciadores firmemente uno al lado del otro con clips de carpeta. Finalmente, esterilice la superficie del molde colocándolo en la campana y encendiendo la luz ultravioleta durante 30 minutos antes de usarlo. A mitad del proceso de esterilización, voltee el molde para que quede al descubierto ambas superficies.

Cree las soluciones precursoras de gel como se describe en la tabla uno del protocolo de texto adjunto. A continuación, mezcle los volúmenes de PEG-DA, fibronectina y fotoiniciador para crear el hidrogel. Pipetear la solución enérgicamente para asegurar una solución homogénea, pero evite crear burbujas.

Pipetee la solución precursora de gel con cuidado entre los dos portaobjetos de vidrio del molde de gel. Luego, coloque el molde bajo una luz ultravioleta y expóngase durante uno o dos minutos para formar el hidrogel. Una vez gelificado, retire los clips de aglutinante y retire suavemente el portaobjetos de vidrio superior aplicando la presión opuesta a los dos espaciadores laterales.

Luego, use un punzón de biopsia del tamaño adecuado para cortar las muestras de hidrogel. Perfore varios hidrogeles del rectángulo de gel para que sirvan como réplicas y muestras de control. Esterilice la fotomascarilla sumergiéndola en etanol al 70% durante 10 minutos.

A continuación, deje que la fotomascarilla se seque al aire en una campana de cultivo celular. A continuación, pipetee uno o dos microlitros por centímetro cuadrado de una solución de proteína tiolada en la superficie de cada hidrogel cortado para modelar la superficie. Es importante distribuir la solución proteica por la superficie del hidrogel de manera uniforme para garantizar una inmovilización uniforme de la proteína.

Coloque con cuidado la fotomascarilla sobre la superficie del hidrogel. Presione suavemente la mascarilla para eliminar las burbujas que se formen entre la mascarilla y la superficie del hidrogel. A continuación, coloque el hidrogel bajo la luz ultravioleta y expóngalo a una segunda ronda de luz ultravioleta durante 30 a 60 segundos.

Lave los hidrogeles con PBS para eliminar cualquier especie que no haya reaccionado y coloque cada hidrogel dentro de la placa del pocillo de modo que la superficie del patrón quede hacia arriba. Luego, lave los geles durante la noche en PBS a cuatro grados centígrados. Retire el PBS de los pocillos, luego agregue 250 microlitros de EGM2 basal en cada pocillo e incube los geles durante cinco a 10 minutos a 37 grados centígrados.

Durante la incubación, la tripsina digiere una placa de HUVEC casi confluentes en una suspensión de una sola célula utilizando técnicas estándar. Luego, gire hacia abajo la suspensión celular y retire con cuidado el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet celular y el EGM2 basal sin factores de crecimiento añadidos y agregue parte de la suspensión celular a un hemocitómetro.

Cuente las celdas para determinar la concentración. A continuación, gire la placa que contiene los hidrogeles a 300 x G durante tres minutos, para asegurarse de que los hidrogeles estén ubicados en el fondo del pozo y no floten. Es fundamental que los hidrogeles no floten dentro de los pozos.

Los hidrogeles flotantes limitarán el éxito en la siembra de células y causarán problemas con las imágenes de hidrogel. Pipetear lentamente 75.000 células por centímetro cuadrado en el centro de cada superficie de hidrogel para no alterar los geles. Luego, coloque la placa en una incubadora de cultivo celular a 37 grados centígrados.

Durante varios días, retire periódicamente la placa para observar la migración celular en respuesta al patrón de proteínas. Intercambie el 50% de los medios cada dos o tres días. Al formar los hidrogeles, se pueden utilizar varias concentraciones precursoras de PEG-diacrilato para producir la rigidez deseada del sustrato.

En la imagen, la solución de PEG-DA al 20% se correlaciona con la rigidez de más de 100 kilopascales. También es importante tener en cuenta tanto la concentración de fotoiniciadores como el tiempo de exposición a los rayos UV, ya que un aumento en cualquiera de las variables disminuirá la bioactividad de las moléculas unidas, representadas aquí por la bioactividad del lisosoma. Minimizar la exposición a los rayos UV durante la formación de hidrogel es fundamental para mantener los grupos funcionales de acrilato libre para las reacciones posteriores de inmovilización de proteínas.

Los hidrogeles expuestos a la luz ultravioleta durante más de dos minutos son incapaces de crear patrones de proteínas inmovilizadas que se muestran en rojo. Además, a medida que aumenta la exposición UV al patrón de proteínas, más proteínas reaccionan a la superficie. Cuando se preparan correctamente, las células se pueden cultivar en estos sustratos de hidrogel con patrones para manipular su comportamiento.

Aquí, las células endoteliales se sembraron uniformemente en la superficie de los hidrogeles PEG de patrón VEGF. Dos días después de la siembra, se observó que las células endoteliales migraban hacia las regiones espaciales del hidrogel que contenía el VEGF inmovilizado. Tras el desarrollo de este protocolo, los investigadores pueden utilizarlo para inmovilizar cualquier proteína o péptido con el fin de explorar nuevas plataformas bioactivas para sistemas celulares in vitro.

Al intentar este procedimiento, es importante recordar minimizar la concentración del fotoiniciador y el tiempo de exposición a los rayos UV para mantener la bioactividad de las moléculas inmovilizadas. Después de ver este video, debe tener una buena comprensión de cómo modelar proteínas y péptidos bioactivos en hidrogeles PEG, células semilla uniformemente en hidrogeles y observar la respuesta celular consecuente.