Summary
Interne longoppervlakte (ISA) is een kritisch criterium voor de beoordeling van longmorfologie en fysiologie bij longziekten en schade-geïnduceerde alveolaire regeneratie. We beschrijven hier een gestandaardiseerde methode die de metafora voor ISA kan minimaliseren in zowel longpneumonectomy als protes implantatie muis modellen.
Introduction
De fundamentele functie van de long is de uitwisseling van zuurstof en kooldioxide tussen bloedvaten en de atmosfeer. Longziekten zoals bronchopulmonale dysplasie (BPD), chronische obstructieve longziekte (COPD) en acute respiratoire infecties resulteren in verminderde ISA 2 . Onderzoekers die longziekte bestuderen hebben verschillende kwantitatieve methoden ontwikkeld om morfologische veranderingen in de longen te evalueren, waaronder MLI, ILV, aantal gasuitwisselingseenheden, ISA en longweefsel compliance 2 , 3 . Baanbrekende studies van Weibel et al. 4 en Duguid et al. 5 samen vastgesteld dat ISA kan worden gebruikt als een directe maatregel van longgasuitwisselingscapaciteit in de menselijke longen en kan gebruikt worden als criterium om de emfysem ernst te bepalen. Een aantal studies gepubliceerd in de afgelopen vijf jaar hebben longmorfologische parameters gebruikt ( bijv. 6 te beoordelen en tijdens herstel van letsel PNX 1 , 7 . ISA wordt berekend aan de hand van vergelijking 1 8 , 9 :
, Waar ILV het interne longvolume is en MLI een tussenliggende parameter is die de pulmonale perifere luchtruim grootte 10 vertegenwoordigt .
PNX, de chirurgische verwijdering van een of meer longlengtes, is algemeen gerapporteerd om alveolaire regeneratie in veel soorten te veroorzaken, waaronder mensen 11 , muizen 1 , honden 12 , ratten 13 en konijnen 14 , 15 . Een stoetY van muizenlongen bij veertien dagen na PNX bleek dat zowel de uitbreiding van reeds bestaande alveoli als de de novo- vorming van alveoli bijdragen aan de restauratie van ISA, ILV en het aantal alveoli in de overige longweefsels 1 . Wij en anderen hebben aangetoond dat het inbrengen van materialen zoals spons, wax of een op maat gemaakte prothese in de lege thoracale holte na PNX (dat wil zeggen implantaatprothese) de alveolaire regeneratie verzwakt. Het is nu duidelijk vast dat mechanische kracht functioneert als een van de belangrijkste factoren voor het initiëren van alveolaire regeneratie 1 , 16 , 17 . Dergelijke studies hebben de effectiviteit van het gebruik van ISA-waarden van PNX-behandelde en Prosthesis-geïmplanteerde longen als criterium benadrukt om alveolaire regeneratie kwantitatief te evalueren.
Observer bias is bekend om de gemeten va significant beïnvloedenLues voor longmorfologische parameters ( bijvoorbeeld MIL en ILV). Gestandaardiseerde protocollen kunnen worden gebruikt om deze vooroordeel te voorkomen bij het bepalen van zowel ILV als MLI, die de twee parameters zijn die bij de berekening van ISA worden gebruikt. Hier bieden wij zeer gedetailleerde, gestandaardiseerde protocollen voor het meten van deze longparameters. Belangrijk is dat het ISA-belofte nauwkeurig kan kwantificeren om de betrouwbaarheid en reproduceerbaarheid van studies van longfunctie bij schade-geïnduceerde alveolaire regeneratiemodellen te verbeteren en mechanistische ontdekkingen bij meerdere longziekten te vergemakkelijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle procedures die in dit protocol werden gebruikt, werden uitgevoerd in overeenstemming met de aanbevelingen in de richtlijnen voor de zorg en het gebruik van laboratoriumdieren van het Nationaal Instituut voor Biologische Wetenschappen, Beijing. 8 week oude CD-1 mannelijke muizen werden gehuisvest in een specifieke pathogeenvrije (SPF) faciliteit tot de experimenten werden uitgevoerd. Surgeries werden uitgevoerd met behulp van volledig verdoofde muizen (dat wil zeggen zonder enige knijpreacties). Na de operatie werden muizen in een warme, vochtige kamer gehouden met voldoende voedsel en zoet water. Muizen werden opgeofferd met behulp van een overdosis anesthetica afgegeven door intraperitoneale injectie.
1. Muis PNX Chirurgie
- De muizen volledig anesthetiseren met natriumfenobarbital (120 mg / kg lichaamsgewicht) en buprenorfine (0,1 mg / kg lichaamsgewicht) via intraperitoneale (IP) injectie. Doe een operatie wanneer muizen niet meer reageren op de teen knijpen.
- Verwijder haar aan de linker thorax van de muizen met chemische depIlatoire behandeling (~ 3 x 3 cm 2 gebied).
- Bevestig elke muis op een intubatieplatform met de ventrale zijde naar de bediener gericht ( Figuur 1A ).
- Trek de muisstaal uit en verlig de stembanden met een kleine laryngoscoop die een hak bevat voor het begeleiden van katheters 18 ( Figuur 1A ).
- Onderscheid de stembanden door de bewegingen van de stembanden in acht te nemen tijdens het ademen. Zet een 20 G intraveneuze intubatie canule in de trachea voorzichtig in een voorste hoek 19 .
- Plaats muizen in een rechterwaartse liggend stand en verbind de canule met een mechanische ventilator ( bijv. Drukgestuurd, zie de Tabel van Materialen ). Controleer de inbrengen van de canule in de luchtpijp door de adembewegingen van de muisborst te waarnemen ( Figuur 1B ).
- Stel de inspiratiedruk inF de ventilator tot 12 cm H 2 O en stel de ademhalingssnelheid op tot 120 ademhalingen per minuut ( figuur 1B ).
- Decontamineer de huid in het chirurgische gebied met betadine en 70% ethanol.
- Voeg een 2-3 cm posterolaterale thoracotomie incisie in de ruimte bij de 5e intercostale ruimte, doorgesneden huid en spieren Noyes Spring Schaar (snijrand 14 mm, tip diameter: 0,275 mm) (Figuur 2B, C). Chirurgische instrumenten die worden gebruikt voor de thoracotomie procedure worden vóór gebruik gesteriliseerd.
- Maak een 1,5 cm incisie op de 5e intercostale ruimte linkerlong (figuur 2D, E) blootgesteld. Gebruik tijdens de operatie een hoge temperatuurcauterizer om te stoppen met bloeden.
- Houd een derde van de linker longklier uit de borst met stompe tippincen ( figuur 2F ) en gebruik dan een katoenen poot om de linker kant te trekkenLong ( figuur 2G ).
- Identificeer de longslagader en bronchi van de linker longklier ( Figuur 2G ).
- Liggelijk de bronchi en vaten in de hilum met een zijdechirurgische hechting en knip de linker longklier op 3 - 4 mm uit de ligatie ( Figuur 2H , I ).
OPMERKING: Wees voorzichtig om de hechtknopen op de linker hilum niet af te snijden, wat pneumothorax kan veroorzaken ( bijv . Lucht of gas in de holte van de thorax) . - Sluit de borstmuur met 1 hechting en steek vervolgens de spierlaag en de huidlaag achtereenvolgens met 5-6 onderbroken hechtingen. Laat een 3 - 4 mm kloof tussen elke hechting ( Figuur 2M , 2N ).
OPMERKING: Houd de chirurgische hechtingsnaald weg van het hart; Onopzettelijke hartsporing zal resulteren in onmiddellijke dood. - Desinfecteer het chirurgische gebied met povidon-jodium.
- afteR de chirurgische operatie, plaats de muis op een thermische kussentje van 38 ° C en sluit de muis aan op de ventilator totdat spontane adembewegingen beginnen ( figuur 2O ).
2. Prothese Implantatie
- Voer stappen 1.1 - 1.13 van de PNX procedure uit (tot op het moment dat de linker longklier van de muis verwijderd is).
- Klem het middelpunt van de siliconenprothese (klant gemaakt, 12 mm in lengte, 3 mm in dikte, 7 mm in breedte, 0,2 g, ellipsoidvormig) met behulp van stompe tang ( Figuur 2J ). Steriliseer siliconenprothese voor inbrengen.
- Houd de rib met de hand vast met de ene hand om de thoracale holte bloot te leggen, en plaats de prothese in de linker lege thoraxholte met een andere hand.
OPMERKING: De invoeghoek is ongeveer 45 graden tussen het frontvlak van de prothese en het thoracale oppervlak ( Figuur 2K ,L). Wees erg zacht bij het plaatsen van de prothese. Overmatige kracht zal leiden tot pleurale breuk. - Pas de oriëntatie van de prothese aan met stompe tang om ervoor te zorgen dat de prothese de linker lege thoracale holte bekleedt.
- Voer stappen 1.14 - 1.16 van de muis PNX procedure uit.
3. Meting van ILV
- Bereid een aangepast apparaat ("inflatiebuis") op die bestaat uit een plunjer verwijderd van een weggooibare serologische pipet (10 ml), een 40 cm lange flexibele buis met een naaldadapter, een debietregelaar en een 18 G-naald. Bevestig de pipet na een montage op een bord met tape ( afbeelding 3A ). De afstand tussen de bovenkant van de pipet en de experimentele bank moet minstens 30 cm zijn.
- Bereid verse 4% paraformaldehyde (PFA) fixatieoplossing door 20 g PFA in 500 ml voorverwarmde 1x fosfaatbufferde zoutoplossing (PBS) in een 55 ° C waterbad op te lossen, handmatig schuddenStop elke 10 minuten tot de oplossing helder is. Na afkoelen tot kamertemperatuur, filter de oplossing met een 0,45 μm filter.
LET OP: Draag geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PPE) bij het hanteren van PFA. - Offer muizen met een overdosisinjectie van verdoving (0,8% fenobarbital natrium, 1000 U / ml heparine).
- Bevestig elke muis op een polystyreen dissectieplaat en spuit het met 70% alcohol.
- Maak de muiskist voorzichtig open en snijd de sternum uit met behulp van een schaar om de longlobben grondig bloot te leggen.
- Verwijder overmatig weefsel met behulp van een schaar om de luchtpijp bloot te stellen. Zorg ervoor dat u de luchtpijp scheidt van de slokdarm.
- Snij de abdominale aorta in en steek een 25-gauge naald in de rechter hart van de hart; Verbind de naald met een 20 ml spuit voor deze insertie. Druk langzaam 1x PBS in het hart om bloedcellen te verwijderen totdat de longen wit worden. Gewoonlijk is 5 - 10 ml PBS nodig om de longvaten te verwijderen.
- Vul hetEen op maat gemaakte inflatiebuis met 4% vers PFA en verwijder alle bellen van de infuusbuis.
- Plaats de 18-gauge naald van de infuusbuis in de luchtpijp en plak de luchtpijp met vaatjesclips om vloeistoflek te voorkomen.
- Opblazen longen met 4% PFA bij een constante transpulmonaire druk van 25 cm / H2O 2, 20. Incubeer de longen bij kamertemperatuur gedurende 2 uur om volledig uitgestrekte longen te bereiken. Deze "pre-fix" -stap is cruciaal voor het behoud van longmorfologie.
- Controleer de waarde van het initiële 4% PFA volume en controleer het eindvolume door de inflatiebuis te controleren. Het inwendige longvolume is gelijk aan het initiële 4% PFA volume minus het uiteindelijke 4% PFA volume.
- Ontleed de luchtpijp en gebruik een schaar, ontleed de longen voorzichtig uit (om de longen intact te houden) van de omliggende bindweefsels. Wees erg zacht om de longen te beschadigen.
- IncuBaat de longen in een 50 ml conische buis gevuld met 4% PFA gedurende 12 uur bij 4 ° C met zacht schudden op een shaker (50 rpm). Ga door naar weefselverwerking en kleuring (zie rubriek 4).
4. Weefsel Inbedding, Sectie, en Hematoxyline & Eosine (H & E) Staining
- Na fixatie, gebruik Noyes Spring Scissors om het hart en overmatige bindweefsel uit de longen te trimmen. Zet de afzonderlijke longlabbers voorzichtig af door de bronchus af te snijden die de longlopen aan de luchtpijp verbindt.
- Was de longkloven 3 - 4 keer in 50 ml 1x PBS (30 min / was) op een orbitale shaker (50 rpm).
- Na de laatste wassing beschermt u de longlobben door ze in een 30% sucroseoplossing (in 1x PBS) bij 4 ° C te onderdompelen tot het weefsel tot de bodem van de 50 ml kegelbuizen (ongeveer 12 uur) zakt.
- Voordat u de weefsels inbedekt en cryosectieert, verwijdert u de lunglobe-monsters uit de buizen met pincet, behoud de accesSory lobes voor de histologische analyse, druppel de resterende sucroseoplossing uit het oppervlak van de accessoire lobmonsters, en doe het monster vervolgens grondig in een Petri-schaal met een optimale snijtemperatuur (OCT) verbinding gedurende ongeveer 30 minuten.
- Vries de OCT-embedded accessoire lobe monsters in vloeibare stikstof met behulp van cryomolds. Plaats het grootste oppervlak van de lobe evenwijdig aan de bodem van de mal.
- Bereid in totaal drie 10 μm dikke secties voor elk monster tijdens cryosectie voor histologische analyse. Verwijder de eerste 1 mm weefsel, verzamel een 10 μm dikke sectie, verwijder 0,5 mm weefsel, versamel een ander gedeelte, verwijder 0,5 mm weefsel en verzamel de derde (laatste) sectie.
- Droog de secties 1 uur voor het uitvoeren van H & E-kleuring.
- Voer H & E-kleuring uit
- Was de secties in 3 - 4 veranderingen van kraanwater en vlek de secties in verse hematoxyline gedurende 2 minuten; Spoel het gedeelte onder stromend kraanwater af; Dompel het gedeelte twee keer in een 1% HCl-70% ethanoloplossing om overtollige hematoxyline te verwijderen.
- Verdeel de sectie in verse eosine gedurende 3 minuten; De secties uitdrogen met twee opeenvolgende 30 s wassen in 95% ethanol en twee 30 s wassen met 100% ethanol; De secties in xyleen gedurende 30 s wissen, herhaal de clearingstap een keer in verse xyleen; Monteer de glijbanen met montagemedium met glazen deklagen.
5. Kwantificering van MLI
- Verkrijg digitale afbeeldingen van de H & E-gekleurde accessoire lobe secties (20X vergroting) met een heldere veld microscoop.
- Om de MLI te kwantificeren, selecteer in totaal 15 niet-overlappende standpunten (1000 μm x 1.000 μm) willekeurig uit de geschikte gebieden (zonder slagaders en aderen, grote luchtwegen en alveolaire buizen) van 3 secties.
- Plaats een rooster met 10 gelijkmatig verdeelde verticale lijnen en 10 even verdeelde horizontale lijnen van gedefinieerde lenGth (1000 μm) op de gekozen gezichtsvelden met behulp van een liniaal tool; Elke lijn is dus op afstand van 100 μm gescheiden ( figuur 4B ).
- Definieer de waarde van een onderscheiding als de lineaire lengte tussen twee aangrenzende alveolaire epithelia. Meet de waarden van alle afsnijdingen langs elke 1000 μm lengte lijn.
- Bepaal voor elk raster de waarden van alle afsnijdingen onder de 10 horizontale 1,000 μm lengte lijnen en de 10 verticale 1,000 μm lengte lijnen.
OPMERKING: MLI is de gemiddelde waarde van de onderscheppingslengten uit een totaal van 15 grids geanalyseerd uit de 3 secties die zijn voorbereid op elk van de accessoire lobben.
6. Berekening van ISA
- Bereken de ISA met behulp van Equation 1 (zie de introductie ). Raadpleeg sectie 3 voor de meting van ILV en verwijzen naar sectie 5 voor de kwantificering van MLI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
We hebben hier een experiment uitgevoerd met een PNX-behandelde groep en een prothese-implantatie (Prosthesis-geïmplanteerde) groep. Deze groeperingen zijn hetzelfde als de groeperingen die in een eerder gepubliceerde studie van onze onderzoeksgroep 14 gebruikt werden .
De muis PNX- en prothese-implantatieprocedures worden weergegeven in Figuur 2 . 8 week oude CD-1 mannelijke muizen worden gebruikt voor de operaties en voor de kwantificering. In de PNX-behandelde groep en de Prosthesis-geïmplanteerde groep werden de linker longbeenbeen geresecteerd ( Figuur 2A - 2I ). In de prothese geïmplanteerde groep werd een prothese die de grootte en vorm van de linker longklier naboots, in de borst geplaatst nadat de linker longklier verwijderd was ( figuur 2J - 2L ).
Veertien dagen na de operatie werd een op maat gemaakte inflatiebuis gebruikt om de ILV van de overige rechter longen te bepalen ( Figuur 3A ). De gemiddelde ILV van het resterende recht Longen van de 5 PNX behandelde muizen was ongeveer 1,4 ml, significant hoger dan de 1,05 ml ILV waarden van de rechter longen van de 5 Prothese geïmplanteerde muizen ( Figuur 3B , Tabel 1 ).Voor de MLI-meting werden in totaal 15 uitzichten geanalyseerd uit de drie secties die uit elke muis werden opgesteld. Figuur 4A toont een samengevoegde afbeelding uit een accessoire lob sectie en de morfologische standaard voor een gekozen gebied ( bijvoorbeeld weergave 1 - 3) of een niet gekozen gebied ( bijvoorbeeld weergave 4 - 5) die wordt gebruikt voor de kwantificering van MLI. Hier is voorbeeld 3 van een accessoire lunglobe-sectie van de PNX-behandelde groep genomen als voorbeeld voorDe meting van MLI ( figuur 4B ). Een vergrote afbeelding van weergave 3 wordt ook weergegeven voor illustratie ( Figuur 5A ). Lijn 3 wordt als voorbeeld weergegeven: de lengte van een onderschepte alveolaire luchtruimte, aangegeven door de dubbelkopige pijllijnen. Uit onze analyse bleek dat de MLI waarden in de overige rechter longen van de PNX-behandelde muizen significant groter waren dan die van de overige rechter longen van de Prothese geïmplanteerde muizen ( Figuur 5B , Tabel 1 ). Alle gegevens worden weergegeven als de gemiddelde ± SEM ( Figuur 5B ).
ISA werd berekend onder gebruikmaking van vergelijking 1 . Tabel 1 toont de ILV-waarden, MLI-waarden en ISA van alle longen. De ISA van de Prothese geïmplanteerde muizen was significant kleiner dan die van de PNX-behandelde muizen, waaruit blijkt dat de insertioN van een prothese gestoorde PNX geïnduceerde regeneratie.
Figuur 1: Muis Endotracheale Intubatie en Mechanische Ventilatie. ( A ) Endotracheale intubatie met een 20 G intraveneuze intubatie canule via laryngoscopie. ( B ) Verbind de volledig verdoofde muis voor een operatie met een drukbeheerde mechanische ventilator. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Muispneumonectomie (PNX) en Prothese Implantatie. ( A - C ) Snijd de huid en de spierlaag; Stop bLeed met een hoge temperatuur cauterizer tijdens de operatie. (D - E) Voeg een 1,5 cm incisie op de 5e intercostale ruimte. ( F - H ) Trek de linker longklap uit met stompe tang en identificeer de pulmonale slagader en bronchi, ligateer bij de hilum. Pijlpunten vertegenwoordigen de pulmonale slagader en bronchi van de linker longklier. ( I ) De linker longklier werd geresecteerd op 3 - 4 mm van de ligatie. ( J - L ) Plaats een prothese in de linker borstholte. ( M, N ) Zuig de borst, de spierlaag en de huidlaag aan. ( O ) Monitor de muizen totdat spontane ademhalingsbewegingen beginnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Meting van de interne longvolumes (ILV's) van de resterende rechterlogen. ( A ) Een aangepast apparaat ("inflatiebuis") voor het meten van de interne longvolumes. ( B ) De ILV's (gemiddelde ± SEM) van de overige rechter longen van de PNX-behandelde groep en Prosthesis geïmplanteerde groep werden gemeten op 14 dagen na PNX. **, p <0,01, Student's t- test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Kwantificering van de gemiddelde lineaire intercept (MLI) van Accessoire Lobes in de resterende rechter longen. ( A ) Een samengevoegde imLeeftijd van een accessoire lobe sectie wordt getoond. Voorbeelden van geselecteerde gebieden ( bijvoorbeeld weergave 1 - 3) en niet-gekozen gebieden ( bijv. Weergave 4 - 5) die gebruikt worden voor MLI-kwantificering. ( B ) 10 evenwijdige verticale lijnen en 10 evenwijdig verdeelde horizontale lijnen met gedefinieerde lengte (1000 μm) werden op het gekozen gebied geplaatst. Schaalbalk = 1 mm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Kwantificering van de MLI in PNX-behandelde longen en prothese geïmplanteerde longen. ( A ) Een vergrote afbeelding van weergave 3 in figuur 4B is getoond. Roodkleurige lijnen met dubbele pijlpunten vertegenwoordigen de lengte van één lineaire onderscheiding. ( B ) De MLI waarden (gemiddelde ± SEM.) van accessoire lobben van PNX-behandelde muizen en Prothese geïmplanteerde muizen werden gemeten op 14 dagen na PNX. *, P <0,05, Student's t- test. Schaalbalk: 100 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| 14 dagen na de operatie | Inwendige longvolume (ml) | Gemiddelde lineaire afsnijding (mm) | inwendig long oppervlakte = 4ILV / MLI (cm2) |
| PNX-behandelde | 1.5 | 57.8 | 1038,06 |
| 1.35 | 49.6 | 1088,71 | |
| 1.42 | 48.5 | 1171,13 | |
| 1.4 | 51.5 1087,38 | ||
| 1.4 | 54.6 | 1025,64 | |
| -Prothese geïmplanteerd | 1.1 | 49.6 | 887,10 |
| 1 | 50.5 | 792,08 | |
| 1.1 | 47.3 | 930,23 | |
| 1.15 | 44.8 | 1026,79 | |
| 0.86 | 46.3 | 742,98 |
Tabel 1: Berekening van de ISA-waarden van PNX-behandelde en prothese geïmplanteerde muizen. De waarden van ILV, MLI en ISA van de accessoire lobben op 14 dagen na PNX.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
In dit protocol geven we gedetailleerde beschrijvingen over de meting van pulmonale parameters na de linker long PNX en de implantatie van de prothese. ISA wordt nu beschouwd als een belangrijke meetwaarde voor de beoordeling van de ademhalingsfunctie bij veel longziekten en bij schade-geïnduceerde alveolaire regeneratie. Echter, hoewel de pulmonale onderzoeksgemeenschap in overeenstemming is over het nut van ISA als een nuttige metrische tot nu toe, is er weinig aandacht besteed aan de standaardisatie van de meting van ILV en MLI, de twee parameters die gebruikt werden om ISA te berekenen. Uiteraard, zoals bij elke meting, is het belangrijk om te proberen onbevooroordeelde gegevens te verkrijgen. Het hoofddoel van de huidige onderzoeksinspanning is het vaststellen van een gestandaardiseerd protocol voor gebruik door de militaire longenonderzoeksgemeenschap.
We hebben geprobeerd de bronnen van meting vooroordeel te verminderen op een aantal manieren als we dit protocol ontwikkelden. We vonden dat variatie in ILV-metingen rood zou kunnen zijnDoor het voorkomen van fluïdum lekkage te voorkomen door te verzekeren dat de grootte van de naald die in de luchtpijp is ingebracht dimensies overeenkomt (we hebben vastgesteld dat 18-gauge naalden nauw met muizen tracheae overeenkomen). We hebben ook geconstateerd dat de muisborstmuur van de muis voor de PFA-inflatie grondig moet worden verwijderd, omdat dit de mogelijke invloed van de borstwand op de ILV-metingen minimaliseert. MLI waarden zijn grotendeels afhankelijk van de alveolaire morfologie. Bijgevolg is, naast het belang van het gebruik van leeftijdsmatched en geslachtgekoppelde muizen, het juiste onderhoud van de alveolaire morfologie tijdens de longfixatieprocedures kritisch belangrijk. We hebben hier een veelgebruikte fixatiemethode gebruikt: we hebben longen opgeblazen bij een transpulmonale druk van 25 cm H 2 O met vers bereide 4% PFA om het longweefsel volledig te verdunnen. In onze ervaring kunnen lagere afstotende druk leiden tot weefselcontractie, abnormale alveolaire morfologie, en resulteren uiteindelijk in lagere MLI waarden.
Waarnemingen inOnze eerdere studies hebben aangetoond dat de toebehorenlap van de overblijvende long maximale volumetrische expansie vertoont, in vergelijking met de andere drie lobben van de rechter long, na PNX regeneratie; De toebehorenlap van de overblijvende long toont ook maximale toenames in de waarde van morfologische parameters ( bijvoorbeeld MLI) 21 , 22 , 23 , 24 . Daarom hebben we alleen secties van accessoire lobben geanalyseerd om variatie te voorkomen van verschillende longlengtes. Om de variatie tussen de verschillende secties die bij de kwantificering van MLI werden gebruikt te verminderen, hebben we de oriëntatie van de lap tijdens het inbedden geregeld: we hebben het grootste oppervlak van de lob parallel aan de onderkant van de cryomold geplaatst. We hebben ook de dikte van de steekproefjes nauwkeurig geregeld, de volgorde van de steekproef en de snijpositie tijdens het snijden. Naast de verwerking van een monster, een andere importanHet aspect van standaardisatie is dat alle arteriën en aderen, pleura, grote luchtwegen en alveolaire buizen moeten worden uitgesloten van de weefselgebieden die worden beoordeeld tijdens MLI-kwantificering. Arterieën, aderen en alveolaire buizen zijn veel groter dan alveoli (4 tot 10 keer), dus uitsluitend deze grote structuren is belangrijk voor het verkrijgen van betrouwbare interceptmetingen. Voor elke groep zijn 5 muizen voldoende voor de kwantificering. Voor elke muis werden in totaal 15 niet-overlappende standpunten (1000 μm x 1.000 μm) willekeurig geselecteerd uit de geschikte gebieden (zonder slagaders en aderen, grote luchtwegen en alveolaire buizen) van de 3 secties van de accessoirelap. De methode voor het inbedden van monsters en MLI kan ook worden toegepast op paraffine behandelde longweefsels.
Terwijl anderen MLI hebben gedefinieerd als de totale lijnlengte gedeeld door het aantal afsnijdingen met gekruiste alveolaire muren 25 , hebben we hier een lineaire onderscheiding gebruikt als de lineaire lengteTussen twee aangrenzende alveolaire epitheliale muren in MLI-berekeningen, waarbij de dikte van mesenchym uit de MLI-gegevens is weggelaten. Daarom berekenen we ISA met behulp van de ILV, maar niet het totale longvolume.
Voor de PNX- en prothese-implantatieprocedures var de overlevingssnelheid van muizen die PNX ondergaan, van 85% tot 90%. Het overlevingspercentage van muizen die proteseplantatie ondergaan was ongeveer ~ 80%. Tijdens alle operaties dienen meerdere stappen te worden genomen om de overleving van muizen te verbeteren. 1) Het juiste inbrengen van de katheter in de luchtpijp is een vereiste voor een succesvolle PNX operatie. Onder leiding van een laryngoscoop kan de trachea van de muis gemakkelijk worden waargenomen om veilige en effectieve endotracheale intubatie te vergemakkelijken. 2) Doe de longen of harten niet tijdens de procedure. Zorg ervoor dat de thorax van de vijfde linker intercostale ruimte wijd geopend is en dat de hilum van de linkerlap duidelijk is geïdentificeerd voor lobectomie. Bij het uitvoeren van de linker longlobe reSectie, zorg ervoor dat de linker lob intact is door middel van stompe tang om longbloeding en / of lobarbreuk te voorkomen. Houd tijdens de wondsluiting het uiteinde van de chirurgische naald weg van het hart en de longen. 3) Wees zacht wanneer u de prothese in de lege thoraxholte plaatst, aangezien overmatige kracht de breuk van de pleura kan veroorzaken. 4) Muizen moeten worden geplaatst op een thermische kussentje van 38 ° C en worden gecontroleerd totdat hun zintuigen herstellen, aangezien postoperatieve hypothermie bekend is om de morbiditeit van de muis te verhogen.
Na de verwijdering van de linker longklier werden zowel de long- respiratoire eenheden als het inwendige longgasuitwisselingsgebied significant verminderd. 14 dagen na de operatie waren de ILV, MLI en ISA in het overblijvende longweefsel significant groter in de PNX-behandelde groep muizen dan in de Prosthesis geïmplanteerde groep, die sterk suggereerde dat het inbrengen van een prothese geblokkeerde PNX geïnduceerde alveolaire regeneratie. Zo, zowel PNX als protes-implantatie muis modusLs kan gebruikt worden als krachtige hulpmiddelen voor het onderzoek naar de cellulaire en moleculaire gebeurtenissen die optreden tijdens mechanische kracht geïnduceerde re-alveolarisatie. Bovendien waren de ISA-waarden van Yap AT2 nul longen significant kleiner dan die van controle longen op post-PNX dag 14 1 , wat aangeeft dat ons protocol ook geschikt is voor het detecteren van een verminderde regeneratie van genetische mutante muizen. De strenge en gestandaardiseerde kwantitatieve methoden die in deze studie worden gepresenteerd, kunnen toegepast worden om de longparameters en ISA in ontwikkelingsstudies te meten en met genetisch gemodificeerde diermodellen van meerdere ziekten, waaronder emfyseem bij chronische obstructieve longziekten, alveolaire regeneratie na longschade en longontwikkeling defecten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Acknowledgments
De auteurs willen het Nationaal Instituut voor Biologische Wetenschappen, Beijing, voor de hulp erkennen. Dit werk werd ondersteund door de Beijing Municipal Natural Science Foundation (nr. Z17110200040000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low cost cautery kit | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Noyes scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vessel clips | Fine Science Tools | 18374-44 | |
| I. V. Cannula-20 gauge | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | 29P0601 | |
| Surgical suture | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | F602 | |
| Mouse intubation platform | Penn-Century, Inc | Model MIP | |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century, Inc | Model LS-2-M | |
| TOPO Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RSP1006-05L | |
| Thermal pad | Stuart equipment | SBH130D | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| Hematoxylin Solution | Sigma | GHS132 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma | HT110116 | |
| 10 mL Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| cryosection machine | Leica | CM1950 | |
| Disposable Base Molds | Fisher HealthCare | 22-363-553 | |
| 18 gauge needle | Becton Dickinson | 305199 | |
| Povidone iodine | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Infusion sets for single use | Weigao | SFDA 2012 3661704 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | |
| Tapes | 3M Scotch | 8915 | |
| Cotton pad | Vinda | Dr.P | |
| Silicone prosthesis | Custom made | ||
| Brightfield microscope | Olympus | VS120 | |
| Ruler tool | Adobe Photoshop |
References
- Liu, Z., et al. MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration. Cell Rep. 16 (7), 1810-1819 (2016).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
- Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach. J Appl Physiol. 108 (2), 412-421 (2010).
- Weibel, E. R. Morphometry of the Human Lung. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).
- Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. The internal surface area of the lung in emphysema. J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).
- Branchfield, K., et al. Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response. Science. 351 (6274), 707-710 (2016).
- Ding, B. -S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147 (3), 539-553 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17 (4), 320-328 (1962).
- Weibel, E. R., Gomez, M. Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures. Science. 137 (3530), 577-585 (1962).
- Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. Am Rev Respir Dis. 95 (5), 765-773 (1967).
- Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367 (16), 244-247 (2012).
- Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy. J Clin Invest. 94 (1), 405-412 (1994).
- Thurlbeck, S. W. M. Pneumonectomy in Rats at Various Ages. Am Rev Respir Dis. 120 (5), 1125-1136 (1979).
- Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits. Pediatr Pulmonol. 5 (2), 92-95 (1988).
- Langston, C., et al. Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 7-13 (1977).
- Cohn, R. Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung. Anatomical Record. 75 (2), 195-205 (1939).
- Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281 (5), L1279-L1287 (2001).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth. J Vis Exp. (94), (2014).
- Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats. Am J Respir Crit Care Med. 158 (4), 1230-1234 (1998).
- Yilmaz, C., et al. Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography. J Appl Physiol. 107 (5), 1569-1578 (2009).
- Voswinckel, R., et al. Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice. Eur Respir J. 24 (4), 524-532 (2004).
- Ravikumar, P., et al. Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography. J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).
- Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI Res. 2 (1), (2012).
- Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema. Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).
