Summary
אזור פני השטח הפנימי של הריאות (ISA) הוא קריטריון קריטי להערכת מורפולוגיה ריאות ופיזיולוגיה במחלות ריאה ו-התחדשות שנגרם על ידי פציעה. אנו מתארים כאן שיטה סטנדרטית שיכולה למזער את הטיה המדידה עבור השב"כ הן ריאות pneumonectomy ריאות מודלים השתלת עכבר פרוטה.
Introduction
הפונקציה הבסיסית של הריאה היא החלפת חמצן דו תחמוצת הפחמן בין כלי הדם לבין האווירה. מחלות ריאות כגון bronchopulmonary dysplasia (BPD), מחלת ריאות חסימתית כרונית (COPD) ודלקות בדרכי הנשימה חריפות, גורמות לירידת ערך 2 . חוקרים שחקרו מחלת ריאה פיתחו מספר שיטות כמותיות להערכת שינויים מורפולוגיים בריאות, כולל MLI, ILV, מספר יחידות חילופי גז, השב"כ, תאימות רקמות ריאה 2 , 3 . מחקרים חלוציים על ידי Weibel et al. 4 ו Duguid et al. 5 יחד נקבע כי ISA יכול לשמש כמדד ישיר של קיבולת גז ריאות החליפין בריאות האדם יכול לשמש כקריטריון כדי לקבוע חומרת נפחת. מספר מחקרים שפורסמו בחמש השנים האחרונות השתמשו בפרמטרים מורפולוגיים בריאה ( למשל, 6 במהלך ההתאוששות מן הפציעה PNX 1 , 7 . ISA מחושב באמצעות משוואה 1 8 , 9 :
, כאשר ILV הוא נפח הריאות הפנימי ו- MLI הוא פרמטר ביניים המייצג את מרחב המרחב האווירי הריאתי 10 .
PNX, הסרה כירורגית של אונות ריאה אחת או יותר, דווחה באופן נרחב על חידוש התחדשות של מינים רבים, כולל בני אדם 11 , עכברים 1 , כלבים 12 , חולדות 13 , וארנבות 14 , 15 . חתיךY של עכברים הריאות ב ארבעה עשר ימים לאחר PNX הראו כי הן התרחבות של הקיים מראש alveoli ואת היווצרות דה נובו של alveoli לתרום לשיקום של השב"כ, ILV, ומספר alveoli ברקמות הריאה הנותרים 1 . אנחנו ואחרים הראו כי החדרת חומרים כגון ספוג, שעווה, או בצורת תותבת מותאמת אישית לתוך חלל החזה ריק הבא PNX ( כלומר , השתלת תותבת) פוגעת התחדשות אבולרית. עכשיו הוא הקים היטב כי כוח מכני פונקציות כאחד הגורמים החשובים ביותר ליזום התחדשות בשן 1 , 16 , 17 . מחקרים אלה הדגישו את האפקטיביות של השימוש בערכים של ISA מ ריאות שטופלו ב- PNX ו-מושתלים-ריאות כקריטריון להערכה כמותית של התחדשות אלואולרית.
הטיה משקיף ידוע להשפיע באופן משמעותי vaLues עבור פרמטרים מורפולוגיים ריאה ( למשל , MIL ו ILV). פרוטוקולים סטנדרטיים יכולים לשמש כדי למנוע הטיה זו בקביעת ILV ו- MLI, שהם שני הפרמטרים המשמשים בחישוב השב"כ. כאן, אנו מספקים פרוטוקולים מאוד מפורט, סטנדרטי למדידת פרמטרים אלה הריאה. חשוב לציין, היכולת לכמת במדויק את השב"כ מבטיח לשפר את האמינות ואת שחזור של מחקרים על תפקוד הריאות במודלים התחדשות פציעה שנגרמו על ידי פציעה צריך להקל על גילויי מכני במחלות ריאה מרובים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הנהלים המשמשים בפרוטוקול זה בוצעו בהתאם להמלצות הקווים המנחים לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי למדעי הביולוגיה בבייג'ינג. 8 שבועות בן CD-1 עכברים זכר שוכנו מתקן פתוגן ללא תשלום (SPF) חינם עד הניסויים נערכו. ניתוחים בוצעו באמצעות עכברים מורדמים לחלוטין ( כלומר , ללא תגובות קמצוץ הבוהן). לאחר הניתוח, עכברים נשמרו בחדר חם ולח, עם מספיק מזון ומים מתוקים. עכברים הוקרב באמצעות מנת יתר של הרדמה נמסר על ידי הזרקה intraperitoneal.
1. עכבר PNX כירורגיה
- להרדים לחלוטין את העכברים עם נתרן phenobarbital (120 מ"ג / ק"ג משקל גוף) ו buprenorphine (0.1 מ"ג / ק"ג משקל גוף) באמצעות הזרקת intraperitoneal (IP). בצע ניתוח כאשר עכברים לא מגיבים עוד צביטה הבוהן.
- הסר את השיער על החזה השמאלי של העכברים עם dep כימי(3 × 3 ס"מ שטח 2 ).
- מאובטח כל עכבר על פלטפורמת אינטובציה עם הצד הגחון שלה מול המפעיל ( איור 1 א ).
- לשלוף את הלשון העכבר להאיר את מיתרי הקול עם laryngoscope חיה קטנה המכילה חריץ להנחיית קטטרים 18 ( איור 1 א ).
- להבדיל את מיתרי הקול על ידי התבוננות תנועות של מיתרי הקול במהלך הנשימה. הכנס בעדינות 20 אינפוזיה צינורית תוך וריידית לתוך קנה הנשימה בזווית הקדמית 19 .
- מקום עכברים בתנוחה ישרה לרוחב ימין לחבר את הצינורית למכונת הנשמה מכני ( למשל, לחץ מבוקרת, לראות את לוח החומרים ). בדוק את הכניסה של הצינור לתוך קנה הנשימה על ידי התבוננות בתנועות נשימה של החזה העכבר ( איור 1 ב ).
- הגדר את הלחץ ההשראה oF המאוורר עד 12 ס"מ H 2 O ולהגדיר את קצב הנשימה עד 120 נשימות לדקה ( איור 1 ב ).
- לטהר את העור באזור כירורגי עם betadine ו 70% אתנול.
- הפוך 2 - חתך בית החזה 3 ס"מ posterolateral במרחב בחלל 5 th צלעי, לחתוך דרך העור והשרירים עם נויס האביב מספריים (חיתוך קצה: 14 מ"מ; קצה בקוטר: 0.275 מ"מ) (איור 2B, C). כירורגי מכשירים המשמשים הליך thoracotomy הם מעוקרים לפני השימוש.
- ביצוע חתך 1.5 ס"מ על שטח צלעי 5 th לחשוף את הריאה השמאלית (איור 2 ד, ה). במהלך הניתוח, יש להשתמש בקוטריזר בטמפרטורה גבוהה כדי להפסיק את הדימום.
- הרם שליש מהאונה הריאה השמאלית מהחזה עם מלקחיים קצה קהה ( איור 2F ), ולאחר מכן להשתמש במקלון צמר גפן כדי למשוך את כל שמאלריאות ( איור 2G ).
- לזהות את העורק הריאתי ואת ברונכי של האונה הריאות השמאלית ( איור 2G ).
- חזק לקשור את הסמפונות ואת כלי בשעה הילום עם תפר משי כירורגי לחתוך את האונה הריאות השמאלית ב 3-4 מ"מ מן קשירת ( איור 2H , I ).
הערה: היזהר לא לנתק את הקשרים תפר על הילום השמאלי, אשר יכול לגרום pneumothorax ( כלומר , אוויר או גז בחלל של בית החזה) . - סגור את קיר החזה עם תפר 1, ולאחר מכן לתפור את שכבת השרירים ואת שכבת העור ברצף, באמצעות 5 - 6 התפרים קטע. השאירו 3 - 4 מ"מ הפער בין כל תפר ( איור 2M , 2N ).
הערה: לשמור על מחט תפר כירורגי הרחק מהלב; ניקוב לב לא מכוון עלול לגרום למוות מיידי. - לחטא את האזור כירורגית עם יוד פובידון.
- לאחר מכןR המבצע כירורגי, מניחים את העכבר על כרית תרמית 38 ° C ולחבר את העכבר למכונת ההנשמה עד תנועות נשימה ספונטניות להתחיל ( איור 2O ).
2. השתלת תותב
- בצע את השלבים 1.1 - 1.13 של הליך PNX (כלומר, עד לנקודה שבה האונה הריאה השמאלית של העכבר מוסר).
- מהדק את מרכז סיליקון פרוטזה (הלקוח עשה, 12 מ"מ אורך, עובי 3 מ"מ, 7 מ"מ רוחב, 0.2 גרם, אליפסואידים צורה) באמצעות מלקחיים קהה ( איור 2J ). לעקר פרוטזה סיליקון לפני הכניסה.
- החזק את הצלע עם מלקחיים ביד אחת לחשוף את חלל החזה, ולאחר מכן להכניס את הפרתזה לתוך חלל בית החזה ריק עם יד אחרת.
הערה: זווית ההכנסה הוא כ 45 מעלות בין המטוס הקדמי של תותבת לבין משטח החזה ( איור 2K ,L). להיות עדין מאוד בעת הכנסת תותבת. כוח מופרז יגרום לקרע pleural. - התאם את הכיוון של תותבת עם מלקחיים קהה על מנת להבטיח כי תותבת תופסת את חלל בית החזה ריק.
- בצע את שלבים 1.14 - 1.16 של הליך PNX העכבר.
3. מדידת ILV
- הכן התקן מותאם אישית ("צינור אינפלציה") המורכב מבוכנה שהוסרה מ פיפטה סרולוגית חד פעמית (10 מ"ל), צינור 40 ס"מ גמיש ארוך עם מתאם מחט, שסתום בקרת קצב הזרימה, 18 מחט G. לאחר הרכבה, לאבטח את פיפטה על לוח עם קלטת ( איור 3 א ). המרחק בין החלק העליון של פיפטה הספסל הניסוי חייב להיות לפחות 30 ס"מ.
- הכן טריים 4% paraformaldehyde (PFA) פתרון קיבוע על ידי המסת 20 גרם PFA ב 500 מ"ל מראש מחומם 1x פוספט שנאגרו מלוחים (PBS) ב 55 מעלות צלזיוס אמבטיה, רועדת ידנית עלCe כל 10 דקות עד הפתרון ברור. לאחר הקירור לטמפרטורת החדר, לסנן את הפתרון עם מסנן 0.45 מיקרומטר.
זהירות: ללבוש ציוד מגן אישי מתאים (PPE) בעת טיפול ב- PFA. - להקריב עכברים עם הזרקה מנת יתר של הרדמה (0.8% phenobarbital נתרן, 1,000 U / mL הפרין).
- מאובטח כל עכבר על צלחת לנתיחה פוליסטירן לרסס אותו עם אלכוהול 70%.
- בזהירות לפתוח את החזה העכבר לחתוך את עצם החזה באמצעות מספריים כדי לחשוף ביסודיות את אונות הריאות.
- הסר רקמות מוגזמות באמצעות מספריים לחשוף את קנה הנשימה. הקפד להפריד את קנה הנשימה מן הוושט.
- חותכים את אבי העורקים הבטן ומוסיפים מחט 25-מד לתוך החדר הימני של הלב; לחבר את המחט מזרק 20 מ"ל לפני הכניסה זו. לאט לאט לדחוף 1x PBS לתוך הלב כדי להסיר את תאי הדם עד הריאות להפוך לבן. בדרך כלל, 5-10 מ"ל PBS נדרש לנקות את כלי הדם הריאתיים.
- מלא את הדואר מותאם אישית צינור אינפלציה עם 4% טריים PFA ולהסיר את כל הבועות מן צינור האינפלציה.
- הכנס את המחט 18-מד של צינור האינפלציה לתוך קנה הנשימה ואת קליפ קנה הנשימה עם קליפים כלי כדי למנוע דליפת נוזל.
- לנפח ריאות עם PFA 4% בלחץ transpulmonary קבוע של 25 ס"מ / H 2 O 2 , 20 . דגירה את הריאות בטמפרטורת החדר למשך 2 שעות כדי להשיג ריאות מורחבת באופן מלא. זה "מראש לתקן" צעד קריטי לשימור מורפולוגיה ריאות.
- על ידי ניטור צינור האינפלציה, לרשום את הערך של נפח PFA 4% הראשונית ולהקליט את נפח הסופי. נפח הריאות הפנימי שווה נפח PFA 4% הראשונית פחות נפח PFA הסופי 4%.
- לקשור את קנה הנשימה באמצעות מספריים, בעדינות לנתח את הריאות (שמירה על הריאות שלם) מן הרקמות החיבור הסובבים. להיות עדין מאוד כדי למנוע נזק לריאות.
- אינקולהכות את הריאות בצינור חרוטי 50 מ"ל מלא PFA 4% עבור 12 שעות ב 4 ° C עם רעד עדין על שייקר (50 סל"ד). המשך לעיבוד רקמות וכתמים (ראה סעיף 4).
4. רקמה Embedding, חתך, ו Hematoxylin & Eosin (H & E) מכתים
- לאחר קיבוע, השתמש Noyes האביב מספריים כדי לקצץ את הלב ואת רקמת החיבור מוגזם מן הריאות. בעדינות להפריד את אונות הריאה הפרט על ידי ניתוק הסמפונות שמחבר את אונות הריאות אל קנה הנשימה.
- לשטוף את אונות הריאה באופן נרחב 3 - 4 פעמים 50 מ"ל 1x PBS (30 דקות / לשטוף) על שייקר מסלולית (50 סל"ד).
- לאחר לשטוף הסופי, cryoprotect את אונות הריאה על ידי טבילה אותם פתרון סוכרוז 30% (ב 1x PBS) ב 4 ° C עד הכיור רקמות לתחתית צינורות 50 מ"ל חרוטי (כ 12 שעות).
- לפני הטבעה cryosectioning הרקמות, להסיר את דגימות אונה הריאות מן הצינורות עם מלקחיים, לשמור על accesסורי אונות לניתוח היסטולוגית, dab הפתרון הנותר סוכרוז מפני השטח של דגימות האונה אביזר, ולאחר מכן לטבול ביסודיות את המדגם לתוך צלחת פטרי המכיל אופטימלית טמפרטורת חיתוך (OCT) המתחם במשך כ 30 דקות.
- להקפיא את OCT- מוטבע אביזר דגימות האונה חנקן נוזלי באמצעות cryomolds. מקם את פני השטח הגדול ביותר של האונה במקביל לתחתית של התבנית.
- הכן סך של שלושה 10 מיקרומטר עבה חלקים עבור כל מדגם במהלך cryosectioning לניתוח היסטולוגית. מחק הראשון 1 מ"מ של רקמות, לאסוף סעיף 10 מיקרומטר עבה, למחוק 0.5 מ"מ של רקמות, לאסוף קטע אחר, להשליך 0.5 מ"מ של רקמות, ולאסוף את החלק השלישי (הסופי).
- האוויר יבש את הסעיפים עבור 1 שעות לפני ביצוע מכתים H & E.
- ביצוע מכתים H & E
- לשטוף את הסעיפים 3-4 שינויים של מי ברז ולאחר מכן הכתם את הסעיפים hematoxylin טריים במשך 2 דקות; שוטפים את החלק מתחת למים זורמים; לטבול את הקטע שתי פעמים ב 1% HCl-70% פתרון אתנול להסיר hematoxylin עודף.
- הכתם בסעיף eosin טריים במשך 3 דקות; לייבש את הסעיפים עם שני רצופים 30 s שוטף באתנול 95% ושני 30 s שוטף עם 100% אתנול; לנקות את החלקים ב xylene עבור 30 s, לחזור על שלב ניקוי פעם קסילן טרי; הר שקופיות עם המדיום גובר באמצעות coverslips זכוכית.
5. כימות של MLI
- לרכוש תמונות דיגיטליות של H & E כתמים אביזר קטעים (הגדלה 20X) באמצעות מיקרוסקופ שדה בהיר.
- כדי לכמת את MLI, בחר סך של 15 תצוגות לא חופפות (1,000 מיקרומטר x 1000 מיקרומטר) באופן אקראי מן האזורים המתאימים (ללא עורקים וורידים, דרכי הנשימה הגדולות, צינוריות alveolar) של 3 חלקים.
- מניחים רשת עם 10 שורות אנכיות מבוזרות באופן שווה ו -10 קווי אופקי מופצים באופן שווה של len מוגדרGth (1000 מיקרומטר) על האזורים הנבחרים של תצוגה באמצעות כלי סרגל; כל שורה הוא ובכך רווח 100 מיקרומטר בנפרד ( איור 4 ב ).
- הגדר את הערך של אחד ליירט כמו אורך ליניארי בין שני epithelia alvolar סמוך. למדוד את הערכים של כל מיירט לאורך כל קו אורך 1000 מיקרומטר.
- עבור כל רשת, לכמת את הערכים של כל intercepts בין 10 אופקית 1000 שורות אורך מיקרומטר 10 אנכי 1000 מיקרומטר שורות אורך.
הערה: ה- MLI הוא הערך הממוצע של אורכי היורט מתוך סך של 15 רשתות המנותחות מתוך שלושת החלקים שהוכנו עבור כל אחת מאונות האביזרים.
6. חישוב הרשות
- חישוב השב"כ באמצעות משוואה 1 (ראה מבוא ). ראו סעיף 3 למדידת ILV, והתייחסו לסעיף 5 לכימות של מכון מנדל למנהיגות.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
ביצענו כאן ניסוי עם PNX שטופלו הקבוצה השתלת תותבת (Prosthesis-implanted) קבוצה. קבוצות אלה זהות לקבוצות ששימשו במחקר שפורסם בעבר מקבוצת המחקר 14 שלנו.
PENX העכבר ואת פרוצדזה ההשתלה נהלים מוצגים באיור 2 . 8 שבועות בן CD-1 עכברים זכרים משמשים עבור ניתוחים עבור כימות. בקבוצת PNX שטופלה והקבוצה פרוטזה-המושתלת, הריאה השמאלית אונות הן היו כריתה (איור 2 א - 2I). בקבוצת ההשתלה-מושתלת, תותבת המחקה את גודל הצורה של האונה הריאה השמאלית הוכנסה לתוך החזה לאחר האונה הריאות השמאלית הוסרה ( איור 2J - 2L ).
14 ימים לאחר הניתוח נעשה שימוש בצינור אינפלציה בהתאמה אישית כדי לקבוע את ILV של הריאות הימניות הנותרות ( איור 3 א ) .ל ILV הממוצע של הימנית הנותרת הריאות של 5 PNX שטופלו עכברים היה כ 1.4 מ"ל, גבוה באופן משמעותי את ערכי ILV 1.05 מ"ל של הריאות הנכונות של 5 עכברים מושתלים- Proplanthesis ( איור 3 ב ' , טבלה 1 ).עבור מדידת MLI, סך של 15 צפיות נותחו מתוך 3 חלקים מוכנים מכל עכבר. איור 4 א מראה תמונה ממוזגת מאזור של אובר אביזר והסטנדרט המורפולוגי עבור אזור נבחר ( למשל, תצוגה 1 - 3) או אזור שאינו נבחר ( למשל, 4 - 5) המשמש לכימות של MLI. הנה, לראות 3 מתוך אביזר ריאות אביזר קטע של PNX שטופלו הקבוצה נלקחה כדוגמההמדידה של MLI ( איור 4 ב ). תמונה מוגדלת של תצוגה 3 מוצג גם להמחשה ( איור 5 א ). קו 3 מוצג כדוגמה: אורכו של חלל אוויר מיירט מיירט מסומן על ידי קווי חץ דו-ראשי. הניתוח שלנו הראה כי ערכי MLI בריאות ימין הנותרים של עכברים שטופלו PNX היו גדולים משמעותית מאלה של הריאות הנכונות הנותרות של עכברים מושתלים תותב ( איור 5 ב ' , טבלה 1 ). כל הנתונים מוצגים כ ממוצע ± SEM ( איור 5 ב ).
הרשות חושבה באמצעות משוואה 1 . לוח 1 מציג את ערכי ILV, ערכי MLI ו - ISA של כל הריאות. השב"כ של העכברים מושתלים- Prosthesis היה קטן באופן משמעותי מזה של PNX שטופלו עכברים, הוכחת כי הכנסN של פרוטזה פגום התחדשות PNX- המושרה.
איור 1: אינטובציה אנדוטרכלית עכבר ואוורור מכני. ( א ) אינטובציה אנדוטרכלית עם 20 G צינור תוך ורידי באמצעות צינורית laryngoscopy. ( ב ) לחבר את העכבר הרדים במלואו למכונת הנשמה מכני בלחץ לפני הניתוח. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 2: עכבר Pneumonectomy (PNX) ו השתלת תותב. ( A - C ) חותכים את העור ואת שכבת השרירים; עצור ב Leeding עם cuterizer טמפרטורה גבוהה במהלך הניתוח. (D - E) ביצוע חתך 1.5 ס"מ על שטח 5 th צלעי. ( F - H ) לשלוף את האונה הריאות השמאלית עם מלקחיים קהה לזהות את עורק הריאה ואת ברונצ'י, ligate בשעה הילום. ראשי חץ מייצגים את העורק הריאתי ואת ברונכי של האונה הריאות השמאלית. ( I ) האונה הריאות השמאלית היה resected ב 3-4 מ"מ מן קשירת. ( J - L ) הכנס תותבת לתוך חלל החזה השמאלי. ( M, N ) תפר את החזה, את שכבת השרירים, ואת שכבת העור. ( O ) לפקח על עכברים עד תנועות נשימה ספונטנית להתחיל. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
Thin-page = "1"> 
איור 3: מדידת נפח הריאות הפנימי (ILV) של הריאות הימניות הנותרות. ( א ) מכשיר מותאם אישית ("צינור אינפלציה") למדידת נפח הריאה הפנימי. ( ב ) ILVs (ממוצע ± SEM) של הריאות הימניות הנותרות של הקבוצה שטופלו PNX ו-מושתלים קבוצת השתלה נמדדו ב 14 ימים לאחר PNX. **, p <0.01, -test t של סטודנט. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 4: כימות של ליירט ליניארי ממוצע (MLI) של אונות אביזר בריאות ימין הנותרים. ( א ) IM ממוזגגיל של קטע האונה אביזר מוצג. דוגמאות לאזורים נבחרים ( למשל, נוף 1 - 3) ואזורים לא נבחרים ( למשל, תצוגה 4 - 5) המשמשים לכימות של MLI. ( ב ) 10 שורות אנכית במרווחים שווה ו -10 שורות אופקי במרווחים באורך מוגדר (1,000 מיקרומטר) הונחו על האזור הנבחר. סרגל קנה מידה = 1 מ"מ. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
איור 5: כימות של MLI ב PNX שטופלו הריאות ו-תותבים מושתלים-מושתלים. ( A ) תמונה מוגדלת של תצוגה 3 באיור 4B מוצג. קווים בצבע אדום עם ראשי חץ כפול מייצגים אורך של ליירט ליניארי אחד. ( ב ) ערכי ה- MLI (ממוצע ± SEמ ') של אונות אביזר של PNX שטופלו עכברים עכברים מושתלים- Proplanted נמדדו ב 14 ימים לאחר PNX. *, P <0.05, -test t של סטודנט. סולם בר: 100 מיקרומטר. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.
| 14 ימים לאחר הניתוח | נפח ריאות פנימי (מ"ל) | ליניארי ליניארי מתכוון (מ"מ) | פני השטח הפנימי של הריאות = 4ILV / MLI (ס"מ 2 ) |
| PNX שטופלו | 1.5 | 57.8 | 1038.06 |
| 1.35 | 49.6 | 1088.71 | |
| 1.42 | 48.5 | 1171.13 | |
| 1.4 | 51.5 1087.38 | ||
| 1.4 | 54.6 | 1025.64 | |
| פרוסטזה - מושתלת | 1.1 | 49.6 | 887.10 |
| 1 | 50.5 | 792.08 | |
| 1.1 | 47.3 | 930.23 | |
| 1.15 | 44.8 | 1026.79 | |
| 0.86 | 46.3 | 742.98 |
טבלה 1: חישוב ערכי השב"כ של PNX שטופלו ועכברים מושתלים. הערכים של ILV, MLI, השב"כ של האונות אביזר ב 14 ימים לאחר PNX.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
בפרוטוקול זה, אנו מספקים תיאורים מפורטים על המדידה של פרמטרים ריאתיים לאחר העכבר השמאלי PNX ריאות השתלת תותבת. השב"כ נחשב כיום כמדד מרכזי להערכת תפקוד הנשימה במחלות ריאות רבות ובשיקום התחדשות השחלות המושרה. עם זאת, אף על פי שקהילת המחקר הריאתי מסכימה על תועלתה של הרשות כמדד שימושי, נכון להיום, לא היה משקל רב למדידה של מדידת ILV ו- MLI, שני הפרמטרים המשמשים לחישוב השב"כ. ברור, כמו בכל מדידה, חשוב לנסות להשיג נתונים משוחדת. מטרת הליבה של מאמץ המחקר הנוכחי היא להקים פרוטוקול סטנדרטי לשימוש על ידי קהילת המחקר הריאתי Murine.
ניסינו לצמצם את מקורות ההטיה במדידות במספר דרכים, כפי שפיתחנו פרוטוקול זה. מצאנו כי וריאציה במדידות ILV יכולה להיות אדומהUced על ידי מניעת דליפת נוזלים על ידי הבטחת כי גודל המחט מוכנס לתוך קנה הנשימה הוא מתאימים מימדי (מצאנו כי המחטים 18 מד מקרוב להתאים tracheae עכברים). מצאנו גם כי הקיר החזה העכבר צריך להיות מוסר ביסודיות לפני האינפלציה PFA, כמו זה ממזער את ההשפעה הפוטנציאלית של קיר החזה על מדידות ILV. ערכי ה- MLI תלויים במידה רבה במורפולוגיה של האלמוניות. בהתאם לכך, בנוסף לחשיבות השימוש בעכברים המותאמים לגיל ומין, התחזוקה הנכונה של המורפולוגיה הסימפונית במהלך הליכי קיבוע הריאות חשובה ביותר. אנחנו כאן בשימוש בשיטה קיבוע נרחב אימצה: אנחנו מנופח הריאות בלחץ transpulmonary של 25 ס"מ H 2 O עם 4% PFA מוכן טרי כדי להרחיב באופן מלא את רקמת הריאה. מניסיוננו, הלחצים הפחות נמוכים יכולים להוביל להתכווצות רקמות, למורפולוגיה לא תקינה של השומן, ובסופו של דבר לגרום לערכים נמוכים יותר של ה- MLI.
תצפיות במחקרים קודמים שלנו הראו כי האונה האביזרית של הריאה הנותרת מציגה הרחבה וולומטרית מקסימלית, בהשוואה לשלוש האונות האחרות של הריאה הימנית, לאחר התחדשות ה- PNX; האונה האביזרית של הריאה הנותרת מציגה גם עליות מקסימליות בערכי הפרמטרים המורפולוגיים ( למשל, MLI) 21 , 22 , 23 , 24 . לפיכך, ניתחנו רק קטעים מאונות אביזר כדי למנוע השתנות מאונות ריאות שונות. כדי לסייע בהורדת השונות בין הקטעים השונים המשמשים לכימות של מכון מנדל למנהיגות, שלטנו בכיוון של האונה במהלך הטבעה: הנחנו את המשטח הגדול ביותר של האונה במקביל לתחתית cryomold. אנחנו גם נשלט בקפידה את עובי של פרוסות מדגם, רצף של הדגימה סעיף, ואת המיקום חיתוך במהלך חתך. בנוסף לעיבוד מדגם, עוד importanההיבט של סטנדרטיזציה היא כי כל העורקים והורידים, pleura, דרכי הנשימה הגדולות, צינוריות alveolar צריך להיות נשלל מאזורים רקמות המוערכים במהלך כימות MLI. העורקים, הוורידים, ואת צינוריות alveolar הם הרבה יותר גדול מאשר alveoli (על ידי 4 - 10 פעמים), ולכן למעט מבנים גדולים אלה חשוב לקבלת מדידות ליירט אמין. עבור כל קבוצה, 5 עכברים מתאימים לכימות. עבור כל עכבר, סך של 15 תצוגות לא חופפות (1,000 מיקרומטר x 1000 מיקרומטר) נבחרו באופן אקראי מן האזורים המתאימים (ללא עורקים וורידים, דרכי הנשימה הגדולות, ותעלות אלוואליות) של 3 החלקים של האונה האביזרית. שיטת הטבעה המדגם ומדידה MLI ניתן להחיל גם על רקמות ריאות טיפול פרפין.
בעוד שאחרים הגדירו את ה- MLI כאורך הקו הכולל חלקי מספר המיירטים עם הקירות הצולבים חצויות 25 , אנו משתמשים כאן ליירט לינארי כאורך ליניאריבין שני קירות epithelial סמוכים אלכוהולי חישובים MLI, התעלמות עובי של mesenchyme מן הנתונים MLI. בהתאם לכך, חישבנו את ה- ISA באמצעות ILV אך לא את נפח הריאות הכולל.
עבור PNX ו השתלת פרוצדזה ההליכים, שיעור ההישרדות של עכברים עוברים PNX נע בין 85% ל 90%. שיעור ההישרדות של עכברים שעברו השתלת תותבת היה כ ~ 80%. במהלך כל הניתוחים, מספר צעדים יש לנקוט כדי לשפר את הישרדות עכברים. 1) הכניסה נכונה של הקטטר ב קנה הנשימה היא תנאי מוקדם לפעולה PNX מוצלח. עם הדרכה של laryngoscope, קנה הנשימה של העכבר ניתן לצפות בקלות כדי להקל על אינטובציה endotracheal בטוח ויעיל. 2) לא לנקב את הריאות או לבבות במהלך ההליך. ודא כי בית החזה של החמישי נותר intercostal שטח נפתח באופן נרחב וכי hilum של האונה השמאלית מזוהה בבירור לפני כריתת עצם. כאשר ביצוע אריה ריאה שמאל מחדשסעיף, להבטיח כי האונה השמאלית היא שלמה באמצעות שימוש מלקחיים קהה כדי למנוע דימום ריאתי ו / או קרע lobar. במהלך הסגר הפצע, לשמור על קצה המחט כירורגית מן הלב והריאות. 3) להיות עדין בעת הכנסת תותבת לתוך חלל בית החזה ריק, כמו כוח מופרז יכול לגרום לקרע של הצדר. 4) עכברים יש להציב על כרית תרמית 38 מעלות צלזיוס לפקח עד החושים שלהם להתאושש, כמו היפותרמיה לאחר הניתוח ידוע להגדיל את התחלואה העכבר.
לאחר הסרת האונה הריאות השמאלית, הן יחידות הנשימה הריאתי ואת האזור החליפין גז טבעי ריאות הופחתו באופן משמעותי. 14 ימים לאחר הניתוח, ILV, MLI ו- ISA ברקמת הריאה הנותרת היו גדולים יותר באופן משמעותי בקבוצת ה- PNX שטופלה בעכברים בהשוואה לקבוצת ה- Prosthesis-implanted, דבר המצביע על כך שהכנסת תותב חסם את ה- PNX הִתחַדְשׁוּת. לכן, הן PNX ו תותבת השתלת עכבר מצבLs יכול לשמש כלי רב עוצמה לחקירה של אירועים תאיים ומולקולריים המתרחשים במהלך כוח מכני המושרה מחדש alvolarization. בנוסף, ערכי ISA של ריאות null יאפ AT2 היו קטנים משמעותיים מאלו של ריאות בקרת היום שלאחר PNX 14 1, המציין כי הפרוטוקול שלנו מתאים גם באיתור התחדשות לקויה של עכברים שעברו מוטציה גנטי. ניתן ליישם את השיטות הכמותיות הסטנדרטיות הקפדניות המוצגות במחקר זה על מנת למדוד את פרמטרי הריאות ואת השב"כ במחקרים התפתחותיים ובמודלים בבעלי חיים מהונדסים גנטית של מחלות מרובות, כולל אמפיזמה במחלות ריאות חסימות כרוניות, התחדשות אבולרית בעקבות פציעות ריאה, ופיתוח ריאה פגמים.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
למחברים אין מה לחשוף.
Acknowledgments
המחברים מבקשים להודות המכון הלאומי למדעי הביולוגיה, בייג 'ין על הסיוע. עבודה זו נתמכה על ידי הקרן הלאומית למדעי הטבע של בייג'ינג (מס 'Z17110200040000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low cost cautery kit | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Noyes scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vessel clips | Fine Science Tools | 18374-44 | |
| I. V. Cannula-20 gauge | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | 29P0601 | |
| Surgical suture | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | F602 | |
| Mouse intubation platform | Penn-Century, Inc | Model MIP | |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century, Inc | Model LS-2-M | |
| TOPO Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RSP1006-05L | |
| Thermal pad | Stuart equipment | SBH130D | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| Hematoxylin Solution | Sigma | GHS132 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma | HT110116 | |
| 10 mL Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| cryosection machine | Leica | CM1950 | |
| Disposable Base Molds | Fisher HealthCare | 22-363-553 | |
| 18 gauge needle | Becton Dickinson | 305199 | |
| Povidone iodine | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Infusion sets for single use | Weigao | SFDA 2012 3661704 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | |
| Tapes | 3M Scotch | 8915 | |
| Cotton pad | Vinda | Dr.P | |
| Silicone prosthesis | Custom made | ||
| Brightfield microscope | Olympus | VS120 | |
| Ruler tool | Adobe Photoshop |
References
- Liu, Z., et al. MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration. Cell Rep. 16 (7), 1810-1819 (2016).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
- Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach. J Appl Physiol. 108 (2), 412-421 (2010).
- Weibel, E. R. Morphometry of the Human Lung. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).
- Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. The internal surface area of the lung in emphysema. J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).
- Branchfield, K., et al. Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response. Science. 351 (6274), 707-710 (2016).
- Ding, B. -S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147 (3), 539-553 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17 (4), 320-328 (1962).
- Weibel, E. R., Gomez, M. Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures. Science. 137 (3530), 577-585 (1962).
- Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. Am Rev Respir Dis. 95 (5), 765-773 (1967).
- Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367 (16), 244-247 (2012).
- Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy. J Clin Invest. 94 (1), 405-412 (1994).
- Thurlbeck, S. W. M. Pneumonectomy in Rats at Various Ages. Am Rev Respir Dis. 120 (5), 1125-1136 (1979).
- Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits. Pediatr Pulmonol. 5 (2), 92-95 (1988).
- Langston, C., et al. Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 7-13 (1977).
- Cohn, R. Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung. Anatomical Record. 75 (2), 195-205 (1939).
- Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281 (5), L1279-L1287 (2001).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth. J Vis Exp. (94), (2014).
- Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats. Am J Respir Crit Care Med. 158 (4), 1230-1234 (1998).
- Yilmaz, C., et al. Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography. J Appl Physiol. 107 (5), 1569-1578 (2009).
- Voswinckel, R., et al. Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice. Eur Respir J. 24 (4), 524-532 (2004).
- Ravikumar, P., et al. Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography. J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).
- Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI Res. 2 (1), (2012).
- Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema. Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).
