Summary
Interne lungeoverflatearealer (ISA) er et kritisk kriterium for å vurdere lungemorfologi og fysiologi i lungesykdommer og skadefremkalt alveolær regenerering. Vi beskriver her en standardisert metode som kan minimere måleforstyrrelsen for ISA i både lunge pneumonectomy og protesimplantasjon musemodeller.
Introduction
Lungens grunnleggende funksjon er utveksling av oksygen og karbondioksid mellom blodkar og atmosfære. Lungesykdommer som bronkopulmonal dysplasi (BPD), kronisk obstruktiv lungesykdom (KOL) og akutt respiratorisk infeksjon, resulterer i redusert ISA 2 . Forskere som studerer lungesykdommer, har utviklet flere kvantitative metoder for å evaluere morfologiske endringer i lungene, inkludert MLI, ILV, antall gassutvekslingsenheter, ISA og lungevevinnets samsvar 2 , 3 . Banebrytende studier av Weibel et al. 4 og Duguid et al. 5 sammen etablert at ISA kan brukes som et direkte mål for lungegassutvekslingskapasitet i menneskelige lunger og kan brukes som et kriterium for å bestemme emfysem alvorlighetsgrad. En rekke studier publisert i de siste fem årene har brukt lungemorfologiske parametere ( f.eks. 6 og under gjenoppretting fra skade PNX 1 , 7 . ISA beregnes ved bruk av ligning 1 8 , 9 :
, Hvor ILV er det interne lungevolumet og MLI er en mellomparameter som representerer den lunge perifere luftrommet størrelse 10 .
PNX, den kirurgiske fjerning av en eller flere lungelabber, har blitt rapportert mye for å indusere alveolær regenerering hos mange arter, inkludert mennesker 11 , mus 1 , hunder 12 , rotter 13 og kaniner 14 , 15 . En studY av muslungene ved fjorten dager etter PNX viste at både utvidelsen av eksisterende alveoli og de novo dannelsen av alveoler bidrar til restaurering av ISA, ILV og antall alveoler i de gjenværende lungevevene 1 . Vi og andre har vist at innsetting av materialer som svamp, voks eller en tilpasset protese i det tomme thoracic hule som følger PNX ( dvs. proteseimplantasjon) forringer alveolær regenerering. Det er nå fastslått at mekanisk kraft fungerer som en av de viktigste faktorene for å starte alveolær regenerering 1 , 16 , 17 . Slike studier har fremhevet effekten av å bruke ISA-verdier fra PNX-behandlede og protese-implanterte lunger som et kriterium for kvantitativt å evaluere alveolær regenerering.
Observer bias er kjent for å vesentlig påvirke målt vaLunger for lungemorfologiske parametere ( f.eks . MIL og ILV). Standardiserte protokoller kan brukes til å eliminere denne bias ved å bestemme både ILV og MLI, som er de to parametrene som brukes i beregningen av ISA. Her gir vi svært detaljerte, standardiserte protokoller for måling av disse lungeparametrene. Det er viktig at evnen til nøyaktig kvantifisering av ISA lover å forbedre påliteligheten og reproduserbarheten av studier av lungefunksjon i skadefremkalte alveolære regenereringsmodeller og skal lette mekaniske funn i flere lungesykdommer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle prosedyrer som brukes i denne protokollen, ble utført i samsvar med anbefalingene i Retningslinjer for pleie og bruk av laboratoriedyr ved Nasjonalt institutt for biologiske vitenskap, Beijing. 8 uker gamle CD-1 mannlige mus ble plassert i en spesifikk patogenfri (SPF) -fasilitet inntil forsøkene ble utført. Surgerier ble utført ved bruk av fullbedøvede mus ( dvs. uten tåsporresponser). Etter operasjonen ble musene holdt i et varmt, fuktig rom med tilstrekkelig mat og ferskvann. Mus ble ofret ved bruk av en overdose av bedøvelse levert av intraperitoneal injeksjon.
1. Mus PNX kirurgi
- Fullbedøve musene med natriumfenobarbital (120 mg / kg kroppsvekt) og buprenorfin (0,1 mg / kg kroppsvekt) via intraperitoneal (IP) injeksjon. Utfør kirurgi når mus ikke reagerer på tå klemme.
- Fjern håret på venstre thorax av musene med kjemisk deponeringIlatende behandling (~ 3 x 3 cm 2 område).
- Sikre hver mus på en intubasjonsplattform med ventral side mot operatøren ( figur 1A ).
- Trekk ut musemålet og belys stemmeleddet med et lite dyr laryngoskop som inneholder et hakk for å lede katetre 18 ( figur 1A ).
- Distiller vokalledninger ved å observere bevegelsene til vokalbåndene under pusten. Sett forsiktig en 20 G intravenøs intubasjonskanyl i luftrøret i en fremre vinkel 19 .
- Plasser mus i en høyre lateral liggende stilling og koble kanylen til en mekanisk ventilator ( f.eks. Trykkregulert, se materialetabellen ). Kontroller innsatsen av kanylen i luftrøret ved å observere pustebevægelsene på musekisten ( figur 1B ).
- Sett det inspiratoriske trykket oF ventilatoren til 12 cm H 2 O og sett luftveiene til 120 puste per minutt ( figur 1B ).
- Dekontaminere huden i det kirurgiske området med betadin og 70% etanol.
- Lag en 2 x 3 cm posterolateral thorakotomi snitt i rommet på femte mellomrommet, skjær gjennom huden og musklene med Noyes Spring Scissors (skjærekant: 14 mm, tippdiameter: 0,275 mm) ( Figur 2B , C ). Kirurgiske instrumenter som brukes til thorakotomi prosedyre steriliseres før bruk.
- Lag et 1,5 cm snitt på femte intercostal plass for å avsløre venstre lunge ( Figur 2D , E ). Under operasjonen, bruk en høytemperaturstrålebeholder for å stoppe blødningen.
- Løft en tredjedel av venstre lungelabbe fra brystet med stumpe spisspinner ( figur 2F ), og bruk deretter en bomullspinne for å trekke ut hele venstreLunge ( figur 2G ).
- Identifiser lungearterien og bronkiene i venstre lungelag ( figur 2G ).
- Tett brettet bronkiene og karene i hilumet med en silk kirurgisk sutur og kutt ut den venstre lungebollen på 3-4 mm fra ligeringen ( Figur 2H , I ).
MERK: Vær forsiktig så du ikke kutter ut suturknottene på venstre hilum, noe som kan forårsake pneumothorax ( dvs. luft eller gass i thoraxens hulrom) . - Lukk brystveggen med 1 sutur, og sy deretter muskellaget og hudlaget sekventielt ved å bruke 5-6 avbrutt suturer. La et gap på 3 - 4 mm mellom hver sutur ( figur 2M , 2N ).
MERK: Hold kirurgisk suturnål vekk fra hjertet; Utilsiktet kardial punktering vil resultere i umiddelbar død. - Desinfiser det kirurgiske området med povidon-jod.
- afteR kirurgisk operasjon, legg musen på en 38 ° C termisk pute og koble musen til ventilatoren til spontane pustebevegelser påbegynnes ( figur 2O ).
2. Proteseimplantasjon
- Utfør trinn 1.1 - 1.13 i PNX-prosedyren (det vil si opp til punktet når muskelen til venstre er fjernet).
- Klem midten av silikonprotesen (kundetilpasset, 12 mm i lengden, 3 mm i tykkelse, 7 mm i bredden, 0,2 g, ellipsoidformet) ved hjelp av stumpe tang ( figur 2J ). Steriliser silikonprotesen før innsetting.
- Hold ribben med tupper med en hånd for å eksponere thoracic hulrom, og sett deretter protesen inn i venstre tomme thoracic hule med en annen hånd.
MERK: Innføringsvinkelen er ca. 45 grader mellom protesens frontplan og thoraxflaten ( Figur 2K ,L). Vær veldig forsiktig når du setter protesen inn. Overdreven kraft vil resultere i pleural ruptur. - Juster protesens orientering med stumpe tang for å sikre at protesen opptar det venstre tomme thoracic hule.
- Utfør trinn 1.14 - 1.16 av musen PNX prosedyre.
3. Måling av ILV
- Klargjør en tilpasset enhet ("inflasjonsrør") som består av en plunger fjernet fra en engangs serologisk pipette (10 ml), et 40 cm langt fleksibelt rør med en nåladapter, en strømningsreguleringsventil og en 18 G nål. Etter montering, fest pipetten på et brett med tape ( figur 3A ). Avstanden mellom pipettens topp og eksperimentell benk må være minst 30 cm.
- Forbered fersk 4% paraformaldehyd (PFA) fikseringsløsning ved å oppløse 20 g PFA i 500 ml forvarmet 1x fosfatbuffet saltvann (PBS) i et 55 ° C vannbad, risting manuelt påHvert 10. minutt til løsningen er klar. Etter avkjøling til romtemperatur, filtrer løsningen med et 0,45 μm filter.
FORSIKTIG: Bruk egnet personlig verneutstyr (PPE) ved håndtering av PFA. - Offer mus med en overdose injeksjon av anestesi (0,8% fenobarbital natrium, 1000 U / ml heparin).
- Fest hver mus på en polystyren disseksjonsplate og spray den med 70% alkohol.
- Åpne forsiktig muskisten og kutt ut brystbenet med saks for å eksponere lungelobberene grundig.
- Fjern overflødig vev ved hjelp av saks for å utsette luftrøret. Pass på å skille luftrøret fra spiserøret.
- Klipp abdominal aorta og sett inn en 25-gauge nål inn i høyre hjertekammer; Koble nålen til en 20 ml sprøyte før denne innsatsen. Trykk langsomt 1x PBS inn i hjertet for å fjerne blodceller til lungene blir hvite. Vanligvis kreves 5 - 10 ml PBS for å fjerne lunge blodkar.
- Fyll thE tilpasset inflasjonsrør med 4% frisk PFA og fjern alle boblene fra inflasjonsrøret.
- Sett inn 18-gauge nålen i inflasjonsrøret i luftrøret og klem luftrøret med fartøysklips for å unngå væskelekkasje.
- Blås lungene med 4% PFA ved et konstant transpulmonart trykk på 25 cm / H 2 O 2, 20. Inkuber lungene ved romtemperatur i 2 timer for å oppnå full utvidede lunger. Dette "pre-fix" -trinnet er avgjørende for å bevare lungemorfologi.
- Ved å overvåke inflasjonsrøret registrerer du verdien av det første 4% PFA-volumet og registrerer sluttvolumet. Det indre lungevolumet er det første 4% PFA volumet minus det endelige 4% PFA volumet.
- Liger luftrøret og bruk saks, disses forsiktig ut lungene (holder lungene intakt) fra omkringliggende bindevev. Vær veldig forsiktig for å unngå å skade lungene.
- IncuBate lungene i et 50 ml konisk rør fylt med 4% PFA i 12 timer ved 4 ° C med forsiktig risting på en rister (50 rpm). Fortsett med behandling av vev og flekker (se avsnitt 4).
4. Tissue Embedding, Sectioning, og Hematoxylin & Eosin (H & E) Staining
- Etter fiksering, bruk Noyes Spring Scissors for å trimme hjertet og overdreven bindevev fra lungene. Forsiktig skille de enkelte lungelobber ved å kutte av bronkusen som forbinder lungelobberne til luftrøret.
- Vask lungerne 3 - 4 ganger i 50 ml 1 x PBS (30 min / vask) på en orbital shaker (50 rpm).
- Etter den endelige vasken krypterer du lungelobber ved å nedsenke dem i en 30% sukroseoppløsning (i 1x PBS) ved 4 ° C til vevet synker til bunnen av de 50 ml koniske rørene (ca. 12 timer).
- Før embedding og cryosectioning av vevet, fjern lungelagprøver fra rørene med pincet, hold på tilbehøretSore lobes for den histologiske analysen, dab den resterende sukroseoppløsningen fra overflaten av tilbehørslobeprøver, og prøv deretter forsiktig prøven i en petriskål som inneholder en optimal skjæretemperatur (OCT) -forbindelse i ca. 30 minutter.
- Frys det OCT-innebygde tilbehørslobeprøver i flytende nitrogen ved hjelp av kryololder. Plasser lobens største overflateareal parallelt med bunnen av formen.
- Klargjør totalt tre 10 μm tykke seksjoner for hver prøve under kryoseksjonering for histologisk analyse. Kast den første 1 mm vevet, saml en 10 μm tykk seksjon, kast bort 0,5 mm vev, samle inn en annen seksjon, kast bort 0,5 mm vev og samle den tredje (siste) delen.
- Lufttørk seksjonene i 1 time før H & E-farging utføres.
- Utfør H & E-farging
- Vask seksjonene i 3 - 4 endringer i vann fra springen og flekk deretter delene i frisk hematoksylin i 2 minutter; Skylle delen under rennende vann fra springen; Nedsenk avsnittet to ganger i en 1% HCI-70% etanolløsning for å fjerne overflødig hematoksylin.
- Farg seksjonen i fersk eosin i 3 minutter; Dehydrere delene med to påfølgende 30 s vasker i 95% etanol og to 30 s vasker med 100% etanol; Fjern seksjonene i xylen i 30 s, gjenta klargjøringstrinnet en gang i fersk xylen; Monter glidene med monteringsmedium ved å bruke glassdeksler.
5. Kvantifisering av MLI
- Oppnå digitale bilder av H & E-farget tilbehørs lobe-seksjoner (20X forstørrelse) ved hjelp av et lysfeltmikroskop.
- For å kvantifisere MLI, velg totalt 15 ikke-overlappende visninger (1000 μm x 1000 μm) tilfeldig fra de egnede områdene (uten arterier og vener, store luftveier og alveolære kanaler) på 3 seksjoner.
- Plasser et gitter med 10 jevnt fordelte vertikale linjer og 10 like fordelte horisontale linjer med definert lenGth (1000 μm) på de valgte synsfeltene ved hjelp av et linjalverktøy; Hver linje er således fordelt på 100 μm fra hverandre ( figur 4B ).
- Definer verdien av en avskjæring som den lineære lengden mellom to tilstøtende alveolare epiteler. Mål verdiene for alle avskjæringer langs hver 1000 μm lengdelinje.
- For hvert rutenett kvantifiserer du verdiene for alle avlytinger blant de 10 horisontale 1,000 μm lengde linjene og de 10 vertikale 1,000 um lange linjene.
MERK: MLI er gjennomsnittsverdien av intervalllengder fra totalt 15 grid analysert blant de 3 seksjonene som er forberedt for hver av de tilbehørslobene.
6. Beregning av ISA
- Beregn ISA ved å bruke ligning 1 (se Introduksjon ). Se avsnitt 3 for måling av ILV og se avsnitt 5 for kvantifisering av MLI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Vi utførte her et eksperiment med en PNX-behandlet gruppe og en proteseimplantasjon (protese-implantert) gruppe. Disse grupperinger er de samme som grupperingene som ble brukt i en tidligere publisert studie fra vår forskningsgruppe 14 .
PNX- og proteseimplantasjonsprosedyrene for mus er vist i figur 2 . 8 uker gamle CD-1 hannmus brukes til operasjonene og kvantifiseringen. I den PNX-behandlede gruppen og den protese-implanterte gruppen ble de venstre lungelobber begge reset ( figur 2A - 2I ). I proteseplanterte gruppen ble en protese som etterligner størrelsen og formen til venstre lungelag, satt inn i brystet etter at venstre lungelag var fjernet ( figur 2J - 2L ).
14 dager etter operasjonen ble det brukt et tilpasset inflasjonsrør for å bestemme ILV for de resterende høyre lungene ( figur 3A ). Gjennomsnittlig ILV for gjenværende høyre Lunger av de 5 PNX-behandlede musene var ca. 1,4 ml, signifikant høyere enn 1,05 ml ILV-verdiene av de høyre lungene av de 5 Prothese-implanterte musene ( figur 3B , tabell 1 ).For MLI-måling ble totalt 15 visninger analysert blant de 3 seksjonene som ble utarbeidet fra hver mus. Figur 4A viser et sammensmelt bilde fra en tilbehørslobseksjon og den morfologiske standard for et valgt område ( f.eks. Visning 1-3) eller et ikke-valgt område ( f.eks. Visning 4-5) anvendt for kvantifisering av MLI. Her ble visning 3 fra en tilbehøret lungelagsseksjon av den PNX-behandlede gruppen tatt som et eksempel forMåling av MLI ( figur 4B ). Et forstørret bilde av visning 3 vises også for illustrasjon ( figur 5A ). Linje 3 presenteres som et eksempel: lengden på et oppfanget alveolært luftrom som er angitt av de dobbelthøyde pilelinjene. Analysen viste at MLI-verdiene i de resterende høyre lungerne av de PNX-behandlede musene var signifikant større enn de av de resterende høyre lungene i protesimplantatmusene ( figur 5B , tabell 1 ). Alle data presenteres som gjennomsnittet ± SEM ( Figur 5B ).
ISA ble beregnet ved bruk av ligning 1 . Tabell 1 viser ILV-verdiene, MLI-verdiene og ISA av alle lungene. ISA av protesimplantatmusene var signifikant mindre enn for de PNX-behandlede musene, hvilket demonstrerte at innsatsenN av en proteseforstyrret PNX-indusert regenerering.
Figur 1: Mus Endotracheal Intubasjon og Mekanisk Ventilasjon. ( A ) Endotracheal intubasjon med en 20 G intravenøs intubasjonskanyl via laryngoskopi. ( B ) Koble den fullanestetiserte musen til en trykkregulert mekanisk ventilator før operasjonen. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Muspneumonektomi (PNX) og proteseimplantasjon. ( A - C ) Kutt huden og muskellaget; Stopp bLeeding med en høy temperatur cauterizer under kirurgisk operasjon. ( D - E ) Lag et 1,5 cm snitt på det femte intercostalområdet. ( F - H ) Trekk ut venstre lungelag med stumpe tang og identifiser lungearterien og bronkiene, ligat på hilum. Arrowheads representerer lungearterien og bronkiene i venstre lungelag. ( I ) Venstre lungelag ble resektert ved 3 - 4 mm fra ligeringen. ( J - L ) Sett en protese inn i venstre thoracic hule. ( M, N ) Sutur brystet, muskellaget og hudlaget. ( O ) Overvåk musene til spontane pustebevegelser påbegynnes. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Måling av de indre lungevolumene (ILV) av de resterende høyre lungene. ( A ) En tilpasset enhet ("inflasjonsrør") for måling av de interne lungevolumene. ( B ) ILVene (middel ± SEM) av de resterende høyre lungene i den PNX-behandlede gruppen og protese-implanterte gruppen ble målt 14 dager etter PNX. **, p <0,01, Studentens t- test. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: Kvantifisering av den gjennomsnittlige lineære avskjæringen (MLI) av tilbehørsklubber i de resterende høyre lungene. ( A ) Et fusjonert imAlderen på en tilbehørslobseksjon vises. Eksempler på utvalgte områder ( f.eks. Visning 1 - 3) og ikke-valgte områder ( f.eks. Visning 4 - 5) som brukes til MLI-kvantifisering. ( B ) 10 jevnt fordelte vertikale linjer og 10 jevnt fordelte horisontale linjer med definert lengde (1000 μm) ble plassert på det valgte området. Skalbjelke = 1 mm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 5: Kvantifisering av MLI i PNX-behandlede lunger og protese-implanterte lunger. ( A ) Et forstørret bilde av visning 3 i figur 4B er vist. Rødfargede linjer med dobbelte pilehoder representerer lengden på en lineær avlytting. ( B ) MLI-verdiene (middel ± SEM.) av tilbehørslobber av PNX-behandlede mus og protese-implanterte mus ble målt 14 dager etter PNX. *, P <0,05, Studentens t- test. Skalbjelke: 100 μm. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| 14 dager etter operasjonen | Indre lungevolum (ml) | Gjennomsnittlig lineær avskjæring (mm) | indre lungeoverflateareal = 4ILV / MLI (cm2) |
| PNX behandlet | 1.5 | 57.8 | 1038,06 |
| 1,35 | 49.6 | 1088,71 | |
| 1,42 | 48.5 | 1171,13 | |
| 1.4 | 51,5 1087,38 | ||
| 1.4 | 54.6 | 1025,64 | |
| Protese-implantert | 1.1 | 49.6 | 887,10 |
| 1 | 50,5 | 792,08 | |
| 1.1 | 47.3 | 930,23 | |
| 1,15 | 44,8 | 1026,79 | |
| 0,86 | 46,3 | 742,98 |
Tabell 1: Beregning av ISA-verdiene av PNX-behandlede og protese-implanterte mus. Verdiene av ILV, MLI og ISA av tilbehøret lober ved 14 dager etter PNX.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen gir vi detaljerte beskrivelser av måling av pulmonale parametere etter musen, venstre lungepNX og proteseimplantasjon. ISA anses nå å være en nøkkelstatistikk for vurdering av respiratorisk funksjon i mange lungesykdommer og ved skadefremkalt alveolær regenerering. Imidlertid, selv om lungforskningsfellesskapet er enig om bruken av ISA som en nyttig metrisk, har det hittil vært lite hensyn til standardiseringen av måling av ILV og MLI, de to parametrene som brukes til å beregne ISA. Åpenbart, som med hvilken som helst måling, er det viktig å forsøke å skaffe seg objektive data. Kjernemålet med den nåværende forskningsinnsatsen er å etablere en standardisert protokoll for bruk av det murale lungeforskningsmiljøet.
Vi forsøkte å redusere kilder til måleforstyrrelser på en rekke måter som vi utviklet denne protokollen. Vi fant at variasjon i ILV-målinger kunne være rødUced ved å hindre fluid lekkasje ved å forsikre at størrelsen på nålen satt i luftrøret er dimensjonalt matchet (vi fant at 18-måler nåler nøye matchet mus tracheae). Vi har også funnet ut at musemuskelen må fjernes grundig før PFA-inflasjonen, da dette minimerer den potensielle innflytelsen av brystveggen på ILV-målingene. MLI-verdiene er i stor grad avhengig av alveolær morfologi. Følgelig, i tillegg til betydningen av å bruke alders-matchede og sex-matchede mus, er riktig vedlikehold av alveolær morfologi under lungefikseringsprosedyrene kritisk viktig. Vi brukte her en allment vedtatt fikseringsmetode: vi oppblåste lungene ved et transpulmonalt trykk på 25 cm H 2 O med ferskt tilberedt 4% PFA for å fullstendig utvide lungevevvet. I vår erfaring kan lavere avstivende trykk føre til vevskollisjon, unormal alveolær morfologi, og til slutt resultere i lavere MLI-verdier.
Observasjoner iVåre tidligere studier har indikert at tilbehørslåsen til den gjenværende lungen viser maksimal volumetrisk ekspansjon, sammenlignet med de andre tre lobene til høyre lung, etter PNX-regenerering; Tilbehørslob av den resterende lungen viser også maksimale økninger i verdien av morfologiske parametere ( f.eks. MLI) 21 , 22 , 23 , 24 . Derfor analyserte vi bare seksjoner fra tilbehørslobber for å unngå variasjon fra forskjellige lungelobber. For å bidra til å redusere variasjonen mellom de ulike seksjonene som ble brukt i kvantifiseringen av MLI, kontrollerte vi orienteringen til loben under embedding: vi plasserte den største overflaten av loben parallelt med bunnen av cryomolden. Vi har også nøye kontrollert tykkelsen av prøvesnittene, sekvensen av seksjonen prøvetaking og skjæreposisjonen under snitting. I tillegg til prøvebehandling, en annen importanT aspekt av standardisering er at alle arterier og vener, pleura, store luftveier og alveolære kanaler må unngås fra vevsområdene som vurderes under MLI-kvantifisering. Arterier, vener og alveolære kanaler er alle mye større enn alveoler (ved 4 - 10 ganger), slik at unntak av disse store strukturer er viktig for å oppnå pålitelige interceptmålinger. For hver gruppe er 5 mus adekvat for kvantifiseringen. For hver mus ble totalt 15 ikke-overlappende visninger (1000 μm x 1000 μm) valgt tilfeldig fra de egnede områdene (uten arterier og vener, store luftveier og alveolære kanaler) av de 3 seksjonene av tilbehørsloben. Prøveinnleggingsmetoden og MLI-måling kan også påføres paraffinbehandlede lungevev.
Mens andre har definert MLI som den totale linjelengden divideres med antall avskjæringer med kryssede alveolære vegger 25 , brukte vi her en lineær avskjæring som den lineære lengdenMellom to tilstøtende alveolare epitelvegger i MLI-beregninger, uten hensyn til tykkelsen av mesenchym fra MLI-dataene. Følgelig beregnte vi ISA ved bruk av ILV, men ikke total lungevolum.
For PNX- og proteseimplantasjonsprosedyrene varierte overlevelse av mus som gjennomgår PNX fra 85% til 90%. Overlevelsesgraden av mus under proteseimplantasjon var ca. ~ 80%. Under alle operasjoner bør det tas flere skritt for å forbedre musens overlevelse. 1) Korrekt innføring av kateteret i luftrøret er en forutsetning for en vellykket PNX-operasjon. Under veiledning av et laryngoskop, kan musens luftrør lett observeres for å lette sikker og effektiv endotracheal intubasjon. 2) Ikke punkter lunger eller hjerter under prosedyren. Sørg for at thoraxen i det femte venstre interkostale rommet er åpent og at hilum av venstre lobe er tydelig identifisert før lobektomi. Når du utfører venstre lungelagreSeksjonen, sørg for at venstre lobe er intakt ved bruk av stumpe tang for å unngå lungeblødning og / eller lobarbrudd. Under sårlukking må du holde spissen av den kirurgiske nålen vekk fra hjertet og lungene. 3) Vær forsiktig når du legger protesen i det tomme thoraxhulen, da overdreven kraft kan føre til brudd i pleura. 4) Mus bør plasseres på en 38 ° C termisk pute og overvåkes til deres sanser gjenopprettes, ettersom postoperativ hypotermi er kjent for å øke musporbiditeten.
Etter fjerning av venstre lungelag ble både lungebeskyttelsesenhetene og det interne lungegassutvekslingsområdet betydelig redusert. 14 dager etter operasjonen var ILV, MLI og ISA i det gjenværende lungevevvet betydelig større i den PNX-behandlede gruppen av mus enn i den protese-implanterte gruppen, noe som sterkt antyder at innsetting av en proteseblokkert PNX-inducert alveolar regenerering. Således, både PNX og protese-implantering mus modusJeg kan brukes som kraftige verktøy for undersøkelse av de cellulære og molekylære hendelsene som oppstår under mekanisk kraftindusert re-alveolarisering. I tillegg var ISA-verdiene for Yap AT2 null lungene signifikant mindre enn de for kontroll lungene ved post-PNX dag 14 1 , hvilket indikerer at vår protokoll også er egnet for å detektere svekket regenerering av genetiske mutantmus. De strenge og standardiserte kvantitative metodene som presenteres i denne studien kan brukes til å måle lungeparametrene og ISA i utviklingsstudier og med genetisk modifiserte dyremodeller av flere sykdommer, inkludert emfysem i kronisk obstruktiv lungesykdom, alveolær regenerering etter lungeskader og lungutvikling defekter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Forfatterne vil gjerne anerkjenne Nasjonalt institutt for biologiske vitenskap, Beijing for bistanden. Dette arbeidet ble støttet av Beijing Municipal Natural Science Foundation (nr. Z17110200040000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low cost cautery kit | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Noyes scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vessel clips | Fine Science Tools | 18374-44 | |
| I. V. Cannula-20 gauge | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | 29P0601 | |
| Surgical suture | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | F602 | |
| Mouse intubation platform | Penn-Century, Inc | Model MIP | |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century, Inc | Model LS-2-M | |
| TOPO Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RSP1006-05L | |
| Thermal pad | Stuart equipment | SBH130D | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| Hematoxylin Solution | Sigma | GHS132 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma | HT110116 | |
| 10 mL Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| cryosection machine | Leica | CM1950 | |
| Disposable Base Molds | Fisher HealthCare | 22-363-553 | |
| 18 gauge needle | Becton Dickinson | 305199 | |
| Povidone iodine | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Infusion sets for single use | Weigao | SFDA 2012 3661704 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | |
| Tapes | 3M Scotch | 8915 | |
| Cotton pad | Vinda | Dr.P | |
| Silicone prosthesis | Custom made | ||
| Brightfield microscope | Olympus | VS120 | |
| Ruler tool | Adobe Photoshop |
References
- Liu, Z., et al. MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration. Cell Rep. 16 (7), 1810-1819 (2016).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
- Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach. J Appl Physiol. 108 (2), 412-421 (2010).
- Weibel, E. R. Morphometry of the Human Lung. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).
- Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. The internal surface area of the lung in emphysema. J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).
- Branchfield, K., et al. Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response. Science. 351 (6274), 707-710 (2016).
- Ding, B. -S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147 (3), 539-553 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17 (4), 320-328 (1962).
- Weibel, E. R., Gomez, M. Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures. Science. 137 (3530), 577-585 (1962).
- Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. Am Rev Respir Dis. 95 (5), 765-773 (1967).
- Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367 (16), 244-247 (2012).
- Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy. J Clin Invest. 94 (1), 405-412 (1994).
- Thurlbeck, S. W. M. Pneumonectomy in Rats at Various Ages. Am Rev Respir Dis. 120 (5), 1125-1136 (1979).
- Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits. Pediatr Pulmonol. 5 (2), 92-95 (1988).
- Langston, C., et al. Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 7-13 (1977).
- Cohn, R. Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung. Anatomical Record. 75 (2), 195-205 (1939).
- Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281 (5), L1279-L1287 (2001).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth. J Vis Exp. (94), (2014).
- Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats. Am J Respir Crit Care Med. 158 (4), 1230-1234 (1998).
- Yilmaz, C., et al. Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography. J Appl Physiol. 107 (5), 1569-1578 (2009).
- Voswinckel, R., et al. Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice. Eur Respir J. 24 (4), 524-532 (2004).
- Ravikumar, P., et al. Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography. J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).
- Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI Res. 2 (1), (2012).
- Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema. Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).
