Summary
A área de superfície pulmonar interna (ISA) é um critério crítico para avaliar a morfologia pulmonar e a fisiologia em doenças pulmonares e regeneração alveolar induzida por lesão. Descrevemos aqui um método padronizado que pode minimizar o viés de medição para ISA tanto na pneumonectomia pulmonar quanto nos modelos de mouse de implante de prótese.
Introduction
A função fundamental do pulmão é a troca de oxigênio e dióxido de carbono entre os vasos sanguíneos e a atmosfera. As doenças pulmonares como a displasia broncopulmonar (DBP), a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC) e as infecções respiratórias agudas resultam em diminuição da AIS 2 . Pesquisadores que estudaram doença pulmonar desenvolveram vários métodos quantitativos para avaliar alterações morfológicas nos pulmões, incluindo MLI, ILV, número de unidades de troca de gás, ISA e adesão ao tecido pulmonar 2 , 3 . Estudos pioneiros de Weibel et al. 4 e Duguid et al. 5 juntos estabeleceram que o ISA pode ser usado como uma medida direta da capacidade de troca de gás pulmonar em pulmões humanos e pode ser usado como critério para determinar a gravidade do enfisema. Uma série de estudos publicados nos últimos cinco anos utilizaram parâmetros morfológicos pulmonares ( por exemplo, 6 e durante a recuperação da lesão PNX 1 , 7 . O ISA é calculado usando a Equação 1 8 , 9 :
, Onde ILV é o volume pulmonar interno e MLI é um parâmetro intermediário que representa o espaço aéreo periférico do espaço 10 .
A PNX, a remoção cirúrgica de um ou mais lóbulos pulmonares, foi amplamente relatada para induzir regeneração alveolar em muitas espécies, incluindo humanos 11 , camundongos 1 , cães 12 , ratos 13 e coelhos 14 , 15 . Um galinheiroDos pulmões de ratos aos catorze dias pós-PNX mostraram que tanto a expansão dos alvéolos pré-existentes como a formação de novo de alvéolos contribuem para a restauração de ISA, ILV e o número de alvéolos nos demais tecidos pulmonares 1 . Nós e outros mostraram que a inserção de materiais como esponja, cera ou uma prótese em forma de costume na cavidade torácica vazia após PNX ( ou seja , implantação de prótese) prejudica a regeneração alveolar. Agora está firmemente estabelecido que a força mecânica funciona como um dos fatores mais importantes para iniciar a regeneração alveolar 1 , 16 , 17 . Tais estudos evidenciaram a eficácia do uso de valores ISA de pulmões tratados com PNX e Prótese implantada como critério para avaliar quantitativamente a regeneração alveolar.
Observa-se que o viés observador influencia significativamente a variaçãoLua para parâmetros morfológicos pulmonares ( por exemplo , MIL e ILV). Protocolos padronizados podem ser usados para evitar este viés na determinação de ILV e MLI, que são os dois parâmetros utilizados no cálculo de ISA. Aqui, fornecemos protocolos altamente detalhados e padronizados para medir esses parâmetros pulmonares. Importante, a capacidade de quantificar com precisão a ISA promete melhorar a confiabilidade e a reprodutibilidade dos estudos sobre a função pulmonar em modelos de regeneração alveolar induzida por lesão e deve facilitar descobertas mecanicistas em múltiplas doenças pulmonares.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Todos os procedimentos utilizados neste protocolo foram realizados de acordo com as recomendações das Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório do Instituto Nacional de Ciências Biológicas de Pequim. Os ratinhos macho CD-1 de 8 semanas de idade foram alojados em uma instalação específica de patógenos livres (SPF) até que os experimentos fossem conduzidos. As cirurgias foram realizadas usando camundongos completamente anestesiados ( ou seja , sem respostas de pinça do dedo do pé). Após a cirurgia, os ratos foram mantidos em uma sala quente e úmida com comida e água doce suficientes. Os ratos foram sacrificados usando uma sobredosagem de anestesia administrada por injeção intraperitoneal.
1. Cirurgia do mouse PNX
- Anestesiar completamente os camundongos com fenobarbital de sódio (120 mg / kg de peso corporal) e buprenorfina (0,1 mg / kg de peso corporal) por meio de injeção intraperitoneal (IP). Execute a cirurgia quando os camundongos já não reagem à compressão do dedo do pé.
- Remova os cabelos no tórax esquerdo dos ratos com dep. QuímicaTratamento ilatório (área de ~ 3 x 3 cm 2 ).
- Proteja cada mouse em uma plataforma de intubação com o lado ventral de frente para o operador ( Figura 1A ).
- Retire a língua do mouse e ilumine os cordões vocais com um laringoscópio de pequeno animal contendo um entalhe para guiar os cateteres 18 ( Figura 1A ).
- Distinguir as cordas vocais observando os movimentos das cordas vocais durante a respiração. Insira suavemente uma cânula de intubação intravenosa de 20 G na traquéia em ângulo anterior 19 .
- Coloque os camundongos em uma posição reclinada lateral direita e conecte a cânula a um ventilador mecânico ( por exemplo, controle de pressão, veja a Tabela de Materiais ). Verifique a inserção da cânula na tráquea observando os movimentos de respiração do peito do mouse ( Figura 1B ).
- Defina a pressão inspiratória oF o ventilador a 12 cm H 2 O e ajuste a freqüência respiratória para 120 respirações por minuto ( Figura 1B ).
- Descontaminar a pele na área cirúrgica com betadina e 70% de etanol.
- Faça uma incisão de toracotomia posterolateral de 2 a 3 cm no espaço no 5º espaço intercostal, corte a pele e os músculos com as Tesouras Noyes Spring (corte: 14 mm, diâmetro da ponta: 0,275 mm) ( Figura 2B , C ). Os instrumentos cirúrgicos utilizados para o procedimento de toracotomia são esterilizados antes do uso.
- Faça uma incisão de 1,5 cm no 5º espaço intercostal para expor o pulmão esquerdo ( Figura 2D , E ). Durante a operação, use um cauterizador de alta temperatura para parar o sangramento.
- Levante um terço do lóbulo do pulmão esquerdo do tórax com fórceps de ponta romba ( Figura 2F ) e, em seguida, use um cotonete de algodão para puxar toda a esquerdaPulmão ( Figura 2G ).
- Identificar a artéria pulmonar e brônquios do lóbulo pulmonar esquerdo ( Figura 2G ).
- Ligue ligeiramente os brônquios e vasos no hilum com uma sutura cirúrgica de seda e corte o lobo do pulmão esquerdo a 3 - 4 mm da ligação ( Figura 2H , I ).
NOTA: Tenha cuidado para não cortar os nós de sutura no hilado esquerdo, o que pode causar pneumotórax ( ou seja , ar ou gás na cavidade do tórax) . - Feche a parede torácica com 1 sutura e, em seguida, coloque a camada muscular e a camada de pele sequencialmente, usando 5 a 6 suturas interrompidas. Deixe um espaço de 3 a 4 mm entre cada sutura ( Figura 2M , 2N ).
NOTA: Mantenha a agulha de sutura cirúrgica afastada do coração; A punção cardíaca inadvertida resultará em morte imediata. - Desinfecte a área cirúrgica com povidona-iodo.
- AfteNa operação cirúrgica, coloque o mouse sobre uma almofada térmica de 38 ° C e conecte o mouse ao ventilador até que os movimentos respiratórios espontâneos comecem ( Figura 2O ).
2. Implantação de Prótese
- Execute as etapas 1.1 - 1.13 do procedimento PNX (ou seja, até o ponto em que o lobo do pulmão esquerdo do mouse é removido).
- Aperte o centro da prótese de silicone (feita pelo cliente, com 12 mm de comprimento, 3 mm de espessura, 7 mm de largura, 0,2 g, forma elipsoidal) usando fórceps bruscos ( Figura 2J ). Esterilize a prótese de silicone antes da inserção.
- Segure a costela com fórceps com uma mão para expor a cavidade torácica e, em seguida, insira a prótese na cavidade torácica vazia esquerda com outra mão.
NOTA: O ângulo de inserção é de aproximadamente 45 graus entre o plano frontal da prótese e a superfície torácica ( Figura 2K ,L). Seja muito gentil ao inserir a prótese. Força excessiva resultará em ruptura pleural. - Ajuste a orientação da prótese com fórceps sem corte para garantir que a prótese ocupe a cavidade torácica vazia esquerda.
- Execute as etapas 1.14 - 1.16 do procedimento PNX do mouse.
3. Medição de ILV
- Prepare um dispositivo personalizado ("tubo de inflado") que consiste em um êmbolo removido de uma pipeta sorológica descartavel (10 mL), um tubo flexível de 40 cm de comprimento com um adaptador de agulha, uma válvula de controle de fluxo e uma agulha de 18 G. Após a montagem, prenda a pipeta em uma placa com fita adesiva ( Figura 3A ). A distância entre o topo da pipeta e o banco experimental deve ser de pelo menos 30 cm.
- Prepare uma solução de fixação fresca de paraformaldeído a 4% (PFA), dissolvendo 20 g de PFA em 500 ml de solução salina tamponada com fosfato 1x (PBS) pré-aquecida em um banho de água a 55 ° C, agitando manualmenteCe cada 10 min até a solução ficar limpa. Após o arrefecimento até à temperatura ambiente, filtre a solução com um filtro de 0,45 μm.
CUIDADO: Use equipamento de proteção pessoal apropriado (PPE) ao manusear PFA. - Sacrifique ratos com uma injeção de overdose de anestesia (0,8% de fenobarbital de sódio, 1000 U / mL de heparina).
- Fixe cada mouse em uma placa de dissecção de poliestireno e pulverize com 70% de álcool.
- Abra cuidadosamente o baú do mouse e corte o esterno usando tesoura para expor completamente os lobos pulmonares.
- Remova o excesso de tecido usando tesoura para expor a traquéia. Certifique-se de separar a traqueia do esôfago.
- Corte a aorta abdominal e insira uma agulha de calibre 25 no ventrículo direito do coração; Conecte a agulha a uma seringa de 20 mL antes desta inserção. Empurre lentamente 1x PBS no coração para remover as células sanguíneas até que os pulmões fiquem brancos. Normalmente, 5 a 10 mL de PBS são necessários para limpar os vasos sanguíneos pulmonares.
- Preencha oE tubo de inflado personalizado e com 4% de PFA fresco e retire todas as bolhas do tubo de inflado.
- Insira a agulha de calibre 18 do tubo de inflado na traquéia e prenda a traquéia com os clipes do recipiente para evitar vazamento de fluido.
- Inflar os pulmões com PFA a 4% a uma pressão transpulmonar constante de 25 cm / H 2 O 2, 20. Incube os pulmões à temperatura ambiente durante 2 h para obter pulmões totalmente expandidos. Este passo "pré-reparo" é fundamental para preservar a morfologia pulmonar.
- Ao monitorar o tubo de inflado, registre o valor do volume inicial de 4% de PFA e registre o volume final. O volume interno do pulso é igual ao volume inicial de 4% de PFA menos o volume final de 4% de PFA.
- Ligue a traquéia e use uma tesoura, dissecando suavemente os pulmões (mantendo os pulmões intactos) dos tecidos conjuntivos circundantes. Seja muito gentil para evitar danificar os pulmões.
- IncuBate os pulmões em um tubo cônico de 50 mL preenchido com 4% de PFA por 12 h a 4 ° C com agitação suave em um agitador (50 rpm). Proceda ao processamento e à coloração dos tecidos (ver secção 4).
4. Inspeção de tecidos, secções e coloração com hematoxilina e eosina (H & E)
- Após a fixação, use Noyes Spring Scissors para cortar o coração e os tecidos conjuntivos excessivos nos pulmões. Separa delicadamente os lobos pulmonares individuais cortando o brônquio que liga os lobos pulmonares à traquéia.
- Lave extensamente os lobos pulmonares 3 a 4 vezes em 50 mL 1x PBS (30 min / lavagem) em um agitador orbital (50 rpm).
- Após a lavagem final, crioproteie os lobos pulmonares imergindo-os em uma solução de sacarose a 30% (em 1x PBS) a 4 ° C até o tecido escorrer no fundo dos tubos cônicos de 50 mL (aproximadamente 12 h).
- Antes da incorporação e criosecção dos tecidos, remova as amostras do lóbulo pulmonar dos tubos com fórceps, mantenha o acessoLóbulos sory para a análise histológica, dab a solução de sacarose restante da superfície das amostras de lóbulos acessórias, e depois mergulhe completamente a amostra em uma placa de Petri contendo um composto ótimo de temperatura de corte (OCT) por aproximadamente 30 min.
- Congele as amostras de lóbulos acessórias embutidas OCT em nitrogênio líquido usando gemelos. Posicione a maior área de superfície do lóbulo paralelamente ao fundo do molde.
- Prepare um total de três secções de 10 μm de espessura para cada amostra durante a criosecção para análise histológica. Descarte os primeiros 1 mm de tecido, coloque uma seção de 10 μm de espessura, descarte 0,5 mm de tecido, colecione outra seção, descarte 0,5 mm de tecido e colecione a terceira seção (final).
- Ar seco as secções por 1 h antes de realizar a coloração H & E.
- Execute a coloração H & E
- Lave as secções em 3 a 4 mudanças de água da torneira e depois coloque as secções em hematoxilina fresca por 2 min.; Enxague a seção sob água corrente da torneira; Mergulhe a seção duas vezes em uma solução de etanol a 1% a 70% de etanol para remover o excesso de hematoxilina.
- Mancha a seção em eosina fresca por 3 min; Desidrate as secções com duas lavagens sucessivas de 30 s em etanol a 95% e duas lavagens de 30 s com 100% de etanol; Limpe as secções em xileno durante 30 s, repita o passo de limpeza uma vez em xileno fresco; Monte as lâminas com meio de montagem usando lamínulas de vidro.
5. Quantificação da MLI
- Adquira imagens digitais das seções de lóbulos acessórias manchadas de H & E (ampliação 20X) usando um microscópio de campo brilhante.
- Para quantificar o MLI, selecione um total de 15 vistas não sobrepostas (1.000 μm x 1.000 μm) aleatoriamente das áreas adequadas (sem artérias e veias, principais vias aéreas e ductos alveolares) de 3 seções.
- Coloque uma grade com 10 linhas verticais uniformemente distribuídas e 10 linhas horizontais igualmente distribuídas de lenguas definidasGth (1.000 μm) nas áreas de visão escolhidas usando uma ferramenta de régua; Cada linha é, portanto, espaçada de 100 um de distância ( Figura 4B ).
- Defina o valor de uma intercepção como o comprimento linear entre dois epitélios alveolares adjacentes. Medir os valores de todos os interceptos ao longo de cada linha de comprimento de 1.000 m.
- Para cada grade, quantifique os valores de todas as intercepções entre as 10 linhas horizontais de 1000 μm e as 10 linhas verticais de 1000 μm.
NOTA: MLI é o valor médio dos comprimentos de interceptação de um total de 15 grades analisadas entre as 3 seções preparadas para cada um dos lobos acessórios.
6. Cálculo do ISA
- Calcule o ISA usando a Equação 1 (veja a Introdução ). Consulte a seção 3 para a medição de ILV e consulte a seção 5 para a quantificação de MLI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Realizamos aqui um experimento com um grupo tratado com PNX e um grupo de implante de prótese (Prótese implantada). Esses agrupamentos são os mesmos que os agrupamentos utilizados em um estudo publicado anteriormente em nosso grupo de pesquisa 14 .
O PNX do mouse e os procedimentos de implantação da prótese são mostrados na Figura 2 . Os ratos macho CD-1 de 8 semanas de idade são utilizados para as cirurgias e para a quantificação. No grupo tratado com PNX e no grupo implantado prótese, os lobos do pulmão esquerdo foram ressecados ( Figura 2A - 2I ). No grupo implantado em prótese, uma prótese que imita o tamanho e a forma do lóbulo do pulmão esquerdo foi inserida no tórax após o lóbulo pulmonar esquerdo ser removido ( Figura 2J - 2L ).
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Quatorze dias após a cirurgia, um tubo de inflado personalizado foi usado para determinar o ILV dos pulmões direito remanescentes ( Figura 3A ). O ILV médio do direito restante Os pulmões dos 5 ratinhos tratados com PNX foram de aproximadamente 1,4 mL, significativamente maiores do que os valores de ILV de 1,05 mL dos pulmões direitos dos 5 ratos implantados em prótese ( Figura 3B , Tabela 1 ).Para a medida MLI, um total de 15 visualizações foram analisadas entre as 3 seções preparadas a partir de cada mouse. A Figura 4A mostra uma imagem mesclada de uma seção de lóbulo acessório e o padrão morfológico para uma área escolhida ( por exemplo, vista 1 - 3) ou uma área não escolhida ( por exemplo, vista 4 - 5) utilizada para a quantificação de MLI. Aqui, a visão 3 de uma seção de lobo pulmonar acessória do grupo tratado com PNX foi tomada como um exemplo paraA medida da MLI ( Figura 4B ). Uma imagem ampliada da visão 3 também é exibida para ilustração ( Figura 5A ). A linha 3 é apresentada como um exemplo: o comprimento de um espaço de ar alveolar interceptado indicado pelas linhas de seta de duas cabeças. Nossa análise mostrou que os valores de MLI nos demais pulmões direitos dos camundongos tratados com PNX foram significativamente maiores que os dos pulmões direitos remanescentes dos camundongos implantados na prótese ( Figura 5B , Tabela 1 ). Todos os dados são apresentados como média ± SEM ( Figura 5B ).
O ISA foi calculado utilizando a Equação 1 . A Tabela 1 mostra os valores de ILV, MLI e ISA de todos os pulmões. O ISA dos camundongos implantados na Prótese foi significativamente menor do que o dos ratos tratados com PNX, demonstrando que a inserçãoN de uma prótese induzida por PNX induzida por regeneração.
Figura 1: Intubação endotraqueal do mouse e ventilação mecânica. ( A ) intubação endotraqueal com cânula de intubação intravenosa de 20 G através de laringoscopia. ( B ) Conecte o mouse completamente anestesiado a um ventilador mecânico controlado por pressão antes da cirurgia. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: Pneumonectomia do mouse (PNX) e implante de prótese. ( A - C ) Corte a pele e a camada muscular; Pare bLeeding com um cauterizador de alta temperatura durante a operação cirúrgica. ( D - E ) Faça uma incisão de 1,5 cm no 5º espaço intercostal. ( F - H ) Retire o lobo do pulmão esquerdo com fórceps sem corte e identifique a artéria pulmonar e os brônquios, ligue no hilum. Os cabeçotes representam a artéria pulmonar e os brônquios do lóbulo pulmonar esquerdo. ( I ) O lóbulo do pulmão esquerdo foi ressecado a 3 - 4 mm da ligação. ( J - L ) Insira uma prótese na cavidade torácica esquerda. ( M, N ) Suture o tórax, a camada muscular e a camada de pele. ( O ) Monitore os ratos até que os movimentos de respiração espontânea começem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Medição dos Volumes Internos do Pulmão (ILVs) dos Pulmões Diretos Restantes. ( A ) Um dispositivo personalizado ("tubo de inflado") para medir os volumes pulmonares internos. ( B ) Os ILVs (média ± SEM) dos pulmões direitos remanescentes do grupo tratado com PNX e do grupo implantado em prótese foram medidos aos 14 dias pós-PNX. **, p <0,01, teste t de Student. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: Quantificação da interceptação linear média (MLI) dos lóbulos de acessórios nos pulmões remanescentes. ( A ) A mesclado euA idade de uma seção de lobo acessório é mostrada. Exemplos de áreas escolhidas ( por exemplo, vista 1 - 3) e áreas não escolhidas ( por exemplo, vista 4 - 5) utilizadas para a quantificação MLI. ( B ) foram colocadas 10 linhas verticais uniformemente espaçadas e 10 linhas horizontais uniformemente espaçadas de comprimento definido (1.000 μm) na área escolhida. Barra de escala = 1 mm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Quantificação do MLI em pulmões tratados com PNX e pulmões implantados com prótese. ( A ) Uma imagem ampliada da visão 3 na Figura 4B é mostrada. As linhas de cor vermelha com pontas de flecha dupla representam o comprimento de uma interceptação linear. ( B ) Os valores de MLI (média ± SEM.) de lóbulos acessórios de camundongos tratados com PNX e ratos implantados em prótese foram medidos aos 14 dias pós-PNX. *, P <0,05, teste t de Student. Barra de escala: 100 μm. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| 14 dias após a cirurgia | Volume pulmonar interno (ml) | Interceptação linear média (mm) | Área superficial do pulmão interno = 4ILV / MLI (cm 2 ) |
| Tratado com PNX | 1,5 | 57,8 | 1038.06 |
| 1.35 | 49,6 | 1088,71 | |
| 1.42 | 48,5 | 1171.13 | |
| 1.4 | 51,5 1087.38 | ||
| 1.4 | 54,6 | 1025.64 | |
| Prótese implantada | 1.1 | 49,6 | 887.10 |
| 1 | 50,5 | 792.08 | |
| 1.1 | 47.3 | 930.23 | |
| 1.15 | 44,8 | 1026.79 | |
| 0,86 | 46.3 | 742,98 |
Tabela 1: Cálculo dos Valores ISA dos ratos tratados com PNX e implantados na Prótese. Os valores de ILV, MLI e ISA dos lóbulos acessórios aos 14 dias pós-PNX.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Neste protocolo, fornecemos descrições detalhadas sobre a medição de parâmetros pulmonares após PNX do pulmão esquerdo do rato e implantação da prótese. Atualmente, a ISA é considerada uma métrica chave para a avaliação da função respiratória em muitas doenças pulmonares e na regeneração alveolar induzida por lesão. No entanto, embora a comunidade de pesquisa pulmonar esteja de acordo sobre a utilidade da ISA como métrica útil, até o momento, houve pouca consideração da padronização da medida de ILV e MLI, os dois parâmetros utilizados para calcular a ISA. Obviamente, como com qualquer medida, é importante tentar obter dados imparciais. O principal objetivo do presente esforço de pesquisa é estabelecer um protocolo padronizado para uso da comunidade de pesquisa pulmonar murina.
Tentamos reduzir as fontes de viés de medição de várias maneiras à medida que desenvolvemos esse protocolo. Descobrimos que a variação nas medidas de ILV pode ser vermelhaEvitando fugas de fluido, assegurando que o tamanho da agulha inserida na traquéia seja adaptado de forma dimensional (descobrimos que as agulhas de calibre 18 acompanhavam as traqueias de ratos). Também descobrimos que a parede torácica do mouse precisa ser completamente removida antes da inflação do PFA, pois isso minimiza a influência potencial da parede torácica nas medições de ILV. Os valores de MLI dependem em grande parte da morfologia alveolar. Consequentemente, além da importância de usar camundongos adaptados à idade e sexo, a manutenção adequada da morfologia alveolar durante os procedimentos de fixação pulmonar é extremamente importante. Nós usamos um método de fixação amplamente adotado: inflamos pulmões a uma pressão transpulmonar de 25 cm H 2 O com PFA 4% recentemente preparado para dilatar completamente o tecido pulmonar. Na nossa experiência, as baixas pressões de distensão podem levar à contração do tecido, morfologia alveolar anormal e, em última análise, resultar em valores MLI mais baixos.
Observações emNossos estudos anteriores indicaram que o lobo acessório do pulmão restante exibe expansão volumétrica máxima, em comparação com os outros três lobos do pulmão direito, após a regeneração PNX; O lóbulo acessório do pulmão restante também exibe aumentos máximos no valor dos parâmetros morfológicos ( por exemplo, MLI) 21 , 22 , 23 , 24 . Portanto, analisamos apenas seções de lóbulos acessórios para evitar variações de diferentes lóbulos pulmonares. Para ajudar a reduzir a variação entre as várias seções utilizadas na quantificação do MLI, controlamos a orientação do lóbulo durante a incorporação: colocamos a maior superfície do lóbulo paralelo ao fundo do criomold. Também controlamos cuidadosamente a espessura das fatias de amostra, a seqüência de amostragem de seção e a posição de corte durante a seção. Além do processamento de amostras, outro importanO aspecto da padronização é que todas as artérias e veias, pleura, principais vias aéreas e ductos alveolares precisam ser excluídos das áreas de tecido que são avaliadas durante a quantificação de MLI. As artérias, as veias e os ductos alveolares são muito maiores do que os alvéolos (de 4 a 10 vezes), portanto, excluir essas grandes estruturas é importante para obter medições de interceptação confiáveis. Para cada grupo, 5 camundongos são adequados para a quantificação. Para cada mouse, um total de 15 vistas não sobrepostas (1000 μm x 1000 μm) foram selecionadas aleatoriamente nas áreas adequadas (sem artérias e veias, principais vias aéreas e ductos alveolares) das 3 seções do lobo acessório. O método de incorporação de amostras e a medição de MLI também podem ser aplicados em tecidos pulmonares tratados com parafina.
Enquanto outros definiram MLI como o comprimento total da linha dividido pelo número de interceptações com paredes alveolares cruzadas 25 , utilizamos uma intercepção linear como o comprimento linearEntre duas paredes epiteliais alveolares adjacentes nos cálculos MLI, desconsiderando a espessura do mesênquima dos dados MLI. Conseqüentemente, calculamos ISA usando o ILV, mas não o volume pulmonar total.
Para o PNX e os procedimentos de implantação da prótese, a taxa de sobrevivência de camundongos submetidos a PNX variou de 85% a 90%. A taxa de sobrevivência de ratos submetidos à implantação de prótese foi de cerca de ~ 80%. Durante todas as cirurgias, devem ser tomadas várias medidas para melhorar a sobrevivência dos ratos. 1) A inserção adequada do cateter na traquéia é um pré-requisito para uma operação PNX bem-sucedida. Com a orientação de um laringoscópio, a traqueia do mouse pode ser facilmente observada para facilitar a intubação endotraqueal segura e eficaz. 2) Não perfure os pulmões ou os corações durante o procedimento. Certifique-se de que o tórax do quinto espaço intercostal esquerdo é amplamente aberto e que o hilum do lobo esquerdo é claramente identificado antes da lobectomia. Ao executar lobo pulmonar esquerdo re, Assegure-se de que o lobo esquerdo esteja intacto através do uso de fórceps sem corte para evitar hemorragia pulmonar e / ou ruptura lobar. Durante o fechamento da ferida, mantenha a ponta da agulha cirúrgica afastada do coração e dos pulmões. 3) Seja gentil ao inserir a prótese na cavidade do tórax vazio, uma vez que uma força excessiva pode causar ruptura da pleura. 4) Os ratos devem ser colocados em uma camada térmica de 38 ° C e monitorados até que seus sentidos se recuperem, como a hipotermia pós-operatória é conhecida por aumentar a morbidade do mouse.
Após a remoção do lobo do pulmão esquerdo, as unidades respiratórias pulmonares e a área interna de troca de gás pulmonar foram significativamente reduzidas. 14 dias após a cirurgia, o ILV, MLI e ISA no tecido pulmonar remanescente foram significativamente maiores no grupo de ratos tratados com PNX do que no grupo implantado na Prótese, sugerindo fortemente que a inserção de uma prótese bloqueou alveolar induzida por PNX regeneração. Assim, ambos PNX e prótese - modo de mouse de implantaçãoIsso pode ser usado como ferramentas poderosas para a investigação dos eventos celulares e moleculares que ocorrem durante a re-alveolarização induzida por força mecânica. Além disso, os valores ISA dos pulmões nulos de Yap AT2 foram significativamente menores do que os pulmões de controle no dia 14 1 pós-PNX, indicando que nosso protocolo também é adequado para detectar a regeneração prejudicada de camundongos mutantes genéticos. Os métodos quantitativos rigorosos e padronizados apresentados neste estudo podem ser aplicados para medir os parâmetros pulmonares e ISA em estudos de desenvolvimento e com modelos animais geneticamente modificados de múltiplas doenças, incluindo enfisema em doenças pulmonares obstrutivas crônicas, regeneração alveolar após lesões pulmonares e desenvolvimento pulmonar Defeitos.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Os autores gostariam de agradecer o Instituto Nacional de Ciências Biológicas, Pequim, pela assistência. Este trabalho foi apoiado pela Fundação Municipal de Ciências Naturais de Pequim (nº Z17110200040000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low cost cautery kit | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Noyes scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vessel clips | Fine Science Tools | 18374-44 | |
| I. V. Cannula-20 gauge | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | 29P0601 | |
| Surgical suture | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | F602 | |
| Mouse intubation platform | Penn-Century, Inc | Model MIP | |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century, Inc | Model LS-2-M | |
| TOPO Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RSP1006-05L | |
| Thermal pad | Stuart equipment | SBH130D | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| Hematoxylin Solution | Sigma | GHS132 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma | HT110116 | |
| 10 mL Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| cryosection machine | Leica | CM1950 | |
| Disposable Base Molds | Fisher HealthCare | 22-363-553 | |
| 18 gauge needle | Becton Dickinson | 305199 | |
| Povidone iodine | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Infusion sets for single use | Weigao | SFDA 2012 3661704 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | |
| Tapes | 3M Scotch | 8915 | |
| Cotton pad | Vinda | Dr.P | |
| Silicone prosthesis | Custom made | ||
| Brightfield microscope | Olympus | VS120 | |
| Ruler tool | Adobe Photoshop |
References
- Liu, Z., et al. MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration. Cell Rep. 16 (7), 1810-1819 (2016).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
- Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach. J Appl Physiol. 108 (2), 412-421 (2010).
- Weibel, E. R. Morphometry of the Human Lung. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).
- Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. The internal surface area of the lung in emphysema. J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).
- Branchfield, K., et al. Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response. Science. 351 (6274), 707-710 (2016).
- Ding, B. -S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147 (3), 539-553 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17 (4), 320-328 (1962).
- Weibel, E. R., Gomez, M. Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures. Science. 137 (3530), 577-585 (1962).
- Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. Am Rev Respir Dis. 95 (5), 765-773 (1967).
- Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367 (16), 244-247 (2012).
- Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy. J Clin Invest. 94 (1), 405-412 (1994).
- Thurlbeck, S. W. M. Pneumonectomy in Rats at Various Ages. Am Rev Respir Dis. 120 (5), 1125-1136 (1979).
- Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits. Pediatr Pulmonol. 5 (2), 92-95 (1988).
- Langston, C., et al. Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 7-13 (1977).
- Cohn, R. Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung. Anatomical Record. 75 (2), 195-205 (1939).
- Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281 (5), L1279-L1287 (2001).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth. J Vis Exp. (94), (2014).
- Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats. Am J Respir Crit Care Med. 158 (4), 1230-1234 (1998).
- Yilmaz, C., et al. Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography. J Appl Physiol. 107 (5), 1569-1578 (2009).
- Voswinckel, R., et al. Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice. Eur Respir J. 24 (4), 524-532 (2004).
- Ravikumar, P., et al. Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography. J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).
- Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI Res. 2 (1), (2012).
- Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema. Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).
