Summary
Внутренняя площадь поверхности легких (ISA) является критическим критерием для оценки морфологии и физиологии легких при заболеваниях легких и вызванной травмой альвеолярной регенерации. Мы описываем здесь стандартизованный метод, который может минимизировать смещение измерения для ISA в моделях мышиной пневмоэктомии и имплантации протезов.
Introduction
Фундаментальной функцией легкого является обмен кислорода и углекислого газа между кровеносными сосудами и атмосферой. Болезни легких, такие как бронхолегочная дисплазия (БЛД), хроническая обструктивная болезнь легких (ХОБЛ) и острые респираторные инфекции, приводят к снижению ИСА 2 . Исследователи, изучающие болезнь легких, разработали несколько количественных методов для оценки морфологических изменений в легких, включая MLI, ILV, количество единиц газообмена, ISA и соответствие ткани легких 2 , 3 . Пионерские исследования Weibel et al. 4 и Duguid et al. 5 вместе установили, что ISA может использоваться как прямая мера способности газообмена легких в легких человека и может использоваться в качестве критерия для определения тяжести эмфиземы. В ряде исследований, опубликованных за последние пять лет, были использованы морфологические параметры легких ( например, 6 и во время восстановления после травмы PNX 1 , 7 . ISA рассчитывается с использованием уравнения 1 8 , 9 :
, Где ILV представляет собой внутренний объем легких, а MLI является промежуточным параметром, который представляет собой размер 10 периферического воздушного пространства легких.
Известно, что PNX, хирургическое удаление одной или нескольких легочных долей, индуцирует альвеолярную регенерацию у многих видов, включая людей 11 , мышей 1 , собак 12 , крыс 13 и кроликов 14 , 15 . Шпилькау мышей легких в течение четырнадцати дней после PNX показали , что как расширение уже существующих альвеол и формирование De Novo альвеол способствуют восстановлению ISA, РКН, а число альвеол в остальных тканях легкого 1. Мы и другие показали, что введение таких материалов, как губка, воск или протез произвольной формы в пустую грудную полость после PNX ( т. Е. Имплантацию протеза) ухудшает альвеолярную регенерацию. В настоящее время твердо установлено, что механическая сила функционирует как один из наиболее важных факторов для инициирования альвеолярной регенерации 1 , 16 , 17 . В таких исследованиях была подчеркнута эффективность использования значений ИСА из обработанных PNX и имплантированных протезами легких в качестве критерия количественной оценки альвеолярной регенерации.
Известно, что смещение наблюдателя оказывает значительное влияние на измеренные значения vaСифилиса для морфологических параметров легких ( например , MIL и ILV). Стандартизированные протоколы могут использоваться для устранения этого смещения при определении как ILV, так и MLI, которые являются двумя параметрами, используемыми при расчете ISA. Здесь мы предоставляем очень подробные, стандартизированные протоколы для измерения этих параметров легких. Важно отметить, что способность точно оценивать ISA обещает повысить надежность и воспроизводимость исследований функции легких в моделях альвеолярной регенерации, вызванных травмами, и должна способствовать механистическим открытиям при множественных легочных заболеваниях.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все процедуры, используемые в этом протоколе, проводились в соответствии с рекомендациями Руководства по уходу и использованию лабораторных животных Национального института биологических наук в Пекине. 8-недельные мыши-самки CD-1 помещались в специальную патогенную среду (SPF) до проведения экспериментов. Хирургии проводили с использованием полностью обезболивающих мышей ( т. Е. Без каких-либо пинч-ответов). После операции мышей содержали в теплой, влажной комнате с достаточным количеством пищи и пресной воды. Мышей умерщвляли с использованием передозировки анестетика, получаемого внутрибрюшинной инъекцией.
1. Мышиная хирургия PNX
- Полностью обезболивают мышей с фенобарбиталом натрия (120 мг / кг массы тела) и бупренорфином (0,1 мг / кг массы тела) с помощью внутрибрюшинной (IP) инъекции. Выполните операцию, когда мыши больше не реагируют на защемление пальцев.
- Удалите волосы на левой грудной клетке мышей химическим оттиском(Площадь 3 х 3 см 2 ).
- Закрепите каждую мышь на интубационной платформе с ее вентральной стороной, обращенной к оператору ( рис. 1A ).
- Вытяните язычок мыши и осветите голосовые связки небольшим животным ларингоскопом, содержащим выемку для направляющих катетеров 18 ( рис. 1А ).
- Различают голосовые связки, наблюдая движения голосовых связок во время дыхания. Аккуратно вставьте внутривенную интубационную канюлю 20 G в трахею с передним углом 19 .
- Поместите мышей в правое боковое лежачее положение и соедините канюлю с механическим вентилятором ( например, с контролем давления, см. Таблицу материалов ). Проверьте вставку канюли в трахею, наблюдая за дыхательными движениями сундука для мыши ( рис. 1B ).
- Установите давление вдоха oF вентилятор до 12 см H 2 O и установите скорость дыхания до 120 вдохов в минуту ( рис. 1B ).
- Дезактивируйте кожу в хирургической области бетадином и 70% этанолом.
- Сделайте 2-3-сантиметровый разрез грудной торакотомии в пространстве на 5- м межреберном пространстве, прорезь через кожу и мышцы с помощью Ножницы Весенние ножницы (режущая кромка: 14 мм, диаметр наконечника: 0,275 мм) ( рисунок 2В , С ). Хирургические инструменты, используемые для процедуры торакотомии, стерилизуются перед использованием.
- Сделайте разрез 1,5 см на 5- м межреберье, чтобы выставить левое легкое ( рис. 2D , E ). Во время работы используйте высокотемпературный прижигатель, чтобы остановить кровотечение.
- Поднимите одну треть левой легочной доли от сундука с помощью тупых щипцов ( рис. 2F ), а затем используйте ватный тампон, чтобы вытащить весь левыйЛегких ( фиг. 2G ).
- Определите легочную артерию и бронхи левой легочной доли ( рис. 2G ).
- Плотно лигируйте бронхи и сосуды в hilum с помощью шелкового хирургического шва и вырежьте левый левый лепесток на 3 - 4 мм от лигирования ( рис. 2H , I ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Будьте осторожны, чтобы не обрезать узлы швов на левом холме, что может вызвать пневмоторакс ( т. Е. Воздух или газ в полости грудной клетки) . - Закройте грудную стенку 1 швом, а затем последовательно выровняйте мышечный слой и слой кожи, используя 5-6 прерывистых швов. Оставьте промежуток 3 - 4 мм между каждым швом ( рисунок 2M , 2N ).
ПРИМЕЧАНИЕ. Держите хирургическую иглу шва от сердца; Непреднамеренная сердечная пункция приведет к немедленной смерти. - Дезинфицируйте хирургическую зону повидон-йодом.
- AfteВ хирургической операции поместите мышь на термопластическую панель на 38 ° C и подключите мышь к вентилятору, пока не начнутся самопроизвольные дыхательные движения ( рисунок 2O ).
2. Имплантация протеза
- Выполните шаги 1.1-1.13 процедуры PNX (то есть до момента, когда левая левая доля мыши удалена).
- Закрепите центр силиконового протеза (заказчика, 12 мм в длину, 3 мм в толщину, 7 мм в ширину, 0,2 г, эллипсоидальной формы) с использованием тупых щипцов ( рис. 2J ). Перед вставкой стерилизовать силиконовый протез.
- Держите ребро с помощью щипцов одной рукой, чтобы выставить грудную полость, а затем вставьте протез в левую пустую грудную полость другой рукой.
ПРИМЕЧАНИЕ. Угол введения составляет приблизительно 45 градусов между фронтальной плоскостью протеза и грудной поверхностью ( рисунок 2K ,L). Будьте очень осторожны при вставке протеза. Чрезмерная сила приведет к разрыву плевры. - Отрегулируйте ориентацию протеза тупыми щипцами, чтобы протез занимал левую пустую грудную полость.
- Выполните шаги 1.14 - 1.16 процедуры PNX мыши.
3. Измерение ILV
- Подготовьте специальное устройство («инфляционную трубку»), состоящее из плунжера, удаляемого из одноразовой серологической пипетки (10 мл), гибкой трубки длиной 40 см с адаптером для иглы, регулирующего клапана расхода и иглы 18 G. После сборки закрепите пипетку на доске лентой ( рис. 3A ). Расстояние между вершиной пипетки и экспериментальной скамье должно составлять не менее 30 см.
- Подготовьте свежий раствор для фиксации 4% параформальдегида (PFA) путем растворения 20 г PFA в 500 мл предварительно нагретого 1x забуференного фосфатом физиологическом растворе (PBS) на водяной бане с температурой 55 ° C, встряхивая вручнуюКаждые 10 мин, пока раствор не станет прозрачным. После охлаждения до комнатной температуры фильтруйте раствор с помощью фильтра 0,45 мкм.
ПРЕДОСТЕРЕЖЕНИЕ: При обращении с PFA используйте соответствующие средства индивидуальной защиты (СИЗ). - Жертвенные мыши с передозировкой инъекции анестетика (0,8% фенобарбитала натрия, 1000 ед. / Мл гепарина).
- Закрепите каждую мышь на пластине для вскрытия полистирола и распылите ее на 70% спирта.
- Осторожно откройте мышь и вырежьте грудную клетку, используя ножницы, чтобы полностью обнажить легочные дольки.
- Удалите чрезмерную ткань, используя ножницы, чтобы выставить трахею. Обязательно отделите трахею от пищевода.
- Обрежьте брюшную аорту и вставьте иглу 25 калибра в правый желудочек сердца; Перед иглой присоедините иглу к 20 мл шприцу. Медленно подталкивайте 1x PBS в сердце, чтобы удалить клетки крови, пока легкие не станут белыми. Обычно для очистки легочных кровеносных сосудов требуется 5-10 мл PBS.
- ЗаполнитеИзготовленную по индивидуальному заказу инфузионную трубку с 4% свежего PFA и удалить все пузырьки из трубки для накачивания.
- Вставьте иглу 18-миллиметровой инфузионной трубки в трахею и закрепите трахею с помощью зажимов для сосудов, чтобы избежать утечки жидкости.
- Вздуйте легкие с 4% PFA при постоянном транспульмональном давлении 25 см / H 2 O 2 , 20 . Инкубируйте легкие при комнатной температуре в течение 2 ч для достижения полностью расширенных легких. Этот шаг «предварительной фиксации» имеет решающее значение для сохранения морфологии легких.
- Контролируя тюбик инфляции, запишите значение начального 4% объема PFA и запишите окончательный объем. Внутренний объем легких равен начальному объему PFA 4% минус окончательный объем PFA 4%.
- Лигируйте трахею и используя ножницы, аккуратно рассекайте легкие (сохраняя легкие в неповрежденном состоянии) из окружающих соединительных тканей. Будьте очень осторожны, чтобы не повредить легкие.
- INCUBate легкие в 50-миллилитровой конической трубке, заполненной 4% PFA в течение 12 ч при 4 ° C, с осторожным встряхиванием на шейкере (50 об / мин). Продолжайте обрабатывать и окрашивать ткани (см. Раздел 4).
4. Вложение тканей, секционирование и окрашивание гематоксилином и эозином (H & E)
- После фиксации используйте ножницы Noyes Spring Scissors для обрезания сердца и чрезмерных соединительных тканей с легких. Аккуратно отделите отдельные легочные лепестки, отрезав бронх, который соединяет легочные доли с трахеей.
- Экстенсивно мыть легочные доли 3 - 4 раза в 50 мл 1x PBS (30 мин / промывка) на орбитальном шейкере (50 об / мин).
- После окончательной промывки криопротектор легочных долей, погружая их в 30% -ный раствор сахарозы (в 1х PBS) при 4 ° C, пока ткань не опустится до нижней части 50-миллилитровых конических пробирок (приблизительно 12 часов).
- Перед встраиванием и криоселекцией тканей удалите образцы легких из труб с помощью щипцов, сохраните ихДолей для гистологического анализа, удалите оставшийся раствор сахарозы с поверхности образцов вспомогательных лепестков, а затем тщательно погрузите образец в чашку Петри, содержащую оптимальное значение температуры резания (OCT) в течение примерно 30 мин.
- Заморозьте образцы вспомогательных лепестков OCT в жидком азоте, используя криомодели. Расположите наибольшую площадь поверхности лопасти параллельно дну формы.
- Подготовьте в общей сложности три участка толщиной 10 мкм для каждого образца во время криосекции для гистологического анализа. Отбросьте первые 1 мм ткани, соберите один участок толщиной 10 мкм, выбросьте 0,5 мм ткани, соберите еще одну секцию, выбросьте 0,5 мм ткани и соберите третью (конечную) секцию.
- Воздух высушите секции в течение 1 часа перед нанесением окрашивания H & E.
- Выполнение окрашивания H & E
- Промойте секции в 3 - 4 изменениях водопроводной воды, а затем окрасьте участки в свежий гематоксилин в течение 2 мин; Промыть участок под проточной водопроводной водой; Погрузите секцию два раза в 1% раствор HCl-70% этанола для удаления избытка гематоксилина.
- Окрасить участок свежим эозином в течение 3 мин; Обезвоживают секции с помощью двух последовательных 30-секундных промывок в 95% этаноле и двух 30-секундных промывках со 100% этанолом; Очистить секции в ксилоле в течение 30 с, повторить этап очистки один раз в свежем ксилоле; Монтируйте слайды с монтажной средой, используя покровные стекла.
5. Количественная оценка MLI
- Приобретайте цифровые изображения разделенных на H & E секций вспомогательных лепестков (увеличение 20X) с помощью микроскопа с ярким полем.
- Чтобы количественно определить MLI, выберите в общей сложности 15 неперекрывающихся представлений (1000 мкм х 1000 мкм) из подходящих областей (без артерий и вен, основных дыхательных путей и альвеолярных каналов) из трех секций.
- Поместите сетку с 10 равномерно распределенными вертикальными линиями и 10 равномерно распределенными горизонтальными линиями определенной длиныGth (1000 мкм) на выбранных областях с помощью инструмента линейки; Каждая линия, таким образом, расположена на расстоянии 100 мкм ( рис. 4B ).
- Определите значение одного перехвата как линейную длину между двумя соседними альвеолярными эпителиями. Измерьте значения всех перехватов вдоль каждой линии длины 1000 мкм.
- Для каждой сетки количественно оценивайте значения всех перехватов между 10 горизонтальными линиями длины 1000 мкм и 10 вертикальными линиями длины 1000 мкм.
ПРИМЕЧАНИЕ. MLI представляет собой среднее значение длины перехвата из 15 сеток, проанализированных из трех разделов, подготовленных для каждой из вспомогательных долей.
6. Расчет ISA
- Вычислить ISA, используя уравнение 1 (см. Введение ). См. Раздел 3 для измерения ILV и обратитесь к разделу 5 для количественной оценки MLI.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мы провели здесь эксперимент с группой, обработанной PNX, и имплантацией протеза (имплантированной протезом). Эти группировки такие же, как и группы, использованные в ранее опубликованном исследовании нашей исследовательской группы 14 .
Процедуры имплантации мыши PNX и протеза показаны на рисунке 2 . 8-недельные мыши-самки CD-1 используются для операций и для количественной оценки. В ПН-обработанной группы и Протез-имплантированного группы, левое легкое и лопасти иссекают (Рисунок 2A - 2I). В группе, имплантированной протезом, в грудную клетку был вставлен протез, который имитирует размер и форму левой легочной доли, после удаления левой легочной доли ( рис. 2J - 2L ).
_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Через 14 дней после операции для определения ILV оставшихся правых легких использовалась специальная инфузионная трубка ( рис. 3A ). Средний ILV оставшихся правых Легкие 5 мышей, обработанных PNX, были приблизительно 1,4 мл, что значительно выше, чем 1,05 мл ILV-значений правого легкого у 5 протестированных имплантатов ( рис. 3B , таблица 1 ).Для измерения MLI было проанализировано 15 просмотров из 3 разделов, подготовленных с каждой мыши. На рисунке 4А показано объединенное изображение из секции вспомогательной доли и морфологический стандарт для выбранной области ( например, вид 1 - 3) или не выбранная область ( например, вид 4-5), используемая для количественной оценки MLI. Здесь вид 3 из вспомогательной секции легочной доли в группе, обработанной PNX, был взят в качестве примера дляИзмерение MLI ( рисунок 4B ). Для иллюстрации также показано увеличенное изображение 3 ( рисунок 5A ). В качестве примера представлена линия 3: длина перехваченного альвеолярного воздушного пространства, обозначенного двуглавыми стрелочными линиями. Наш анализ показал, что значения MLI в оставшихся правых легких у мышей, обработанных PNX, были значительно больше, чем у остальных правых легких у мышей, перенесших протезирование ( рис. 5B , таблица 1 ). Все данные представлены как среднее ± SEM ( Рисунок 5B ).
МСА рассчитывали с использованием уравнения 1 . Таблица 1 показывает значения ILV, значения MLI и ISA всех легких. ISA у мышей, имплантированных с помощью протеза, была значительно меньше, чем у обработанных PNX мышей, демонстрируя, что вставкаN протеза нарушали индуцированную PNX регенерацию.
Рисунок 1: Эндотрахеальная интубация мышей и механическая вентиляция. ( А ) Эндотрахеальная интубация с помощью внутривенной интубационной канюли 20 г через ларингоскопию. ( B ) Подключите полностью обезболиваемую мышь к механическому вентилятору, контролируемому под давлением, перед операцией. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Пневмоэктомия мышей (PNX) и имплантация протеза. ( A - C ) Отрежьте кожу и мышечный слой; Остановить bС помощью высокотемпературного прижигателя во время хирургической операции. ( D - E ) Сделайте разрез 1,5 см на 5- м межреберье. ( F - H ) Выдвиньте левую левую лопасть тупыми щипцами и определите легочную артерию и бронхи, лигируйте в hilum. Стрелы представляют собой легочную артерию и бронхи левой легочной доли. ( I ) Левая легочная доля была отрезана на 3 - 4 мм от лигирования. ( J - L ) Вставьте протез в левую грудную полость. ( M, N ) Шовный сундук, мышечный слой и слой кожи. ( O ) Контролируйте мышей, пока не начнутся спонтанные дыхательные движения. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Измерение внутренних объемов легких (ILVs) оставшихся правых легких. ( A ) Пользовательское устройство («инфляционная трубка») для измерения внутренних объемов легких. ( B ) ILVs (среднее ± SEM) оставшихся правых легких группы, обработанной PNX, и группой, имплантированной протезом, измеряли через 14 дней после PNX. **, p <0,01, t- критерий ученика. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Количественная оценка среднего линейного перехвата (MLI) вспомогательных лепестков в оставшихся правых легких. ( A ) Объединенный имВозраст секции вспомогательной доли. Примеры выбранных областей ( например, вид 1 - 3) и не выбранные области ( например, вид 4-5), используемые для количественной оценки MLI. ( В ) 10 расположенных по вертикали вертикальных линий и 10 равномерно расположенных горизонтальных линий определенной длины (1000 мкм) были помещены на выбранную область. Шкала шкалы = 1 мм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 5: Количественная оценка MLI в обработанных PNX легких и имплантированных протезами легких. ( A ) Отображено увеличенное изображение вида 3 на рисунке 4B . Красные линии с двойными стрелками представляют собой длину одного линейного перехвата. ( B ) Значения MLI (среднее ± SEM.) вспомогательных долей мышей, обработанных PNX, и мышей, которым вводили протез, были измерены через 14 дней после PNX. *, P <0,05, t- критерий ученика. Шкала шкалы: 100 мкм. Нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
| Через 14 дней после операции | Внутренний объем легких (мл) | Средний линейный перехват (мм) | Внутренняя площадь поверхности легких = 4ILV / MLI (см 2 ) |
| PNX обработанными | 1,5 | 57,8 | 1038,06 |
| 1,35 | 49,6 | 1088,71 | |
| 1,42 | 48,5 | 1171,13 | |
| 1.4 | 51,5 1087,38 | ||
| 1.4 | 54,6 | 1025,64 | |
| Протез-имплантированных | 1,1 | 49,6 | 887,10 |
| 1 | 50,5 | 792,08 | |
| 1,1 | 47,3 | 930,23 | |
| 1,15 | 44,8 | 1026,79 | |
| 0,86 | 46,3 | 742,98 |
Таблица 1: Расчет значений ISA у мышей, перенесших PNX и протезирование. Значения ILV, MLI и ISA вспомогательных лепестков в 14 дней после PNX.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
В этом протоколе мы приводим подробные описания измерения легочных параметров после введения легкого PNX и имплантации протеза. МСА теперь считается ключевым показателем для оценки функции дыхания при многих заболеваниях легких и вызванной травмой альвеолярной регенерации. Однако, хотя исследовательское сообщество легочной артерии соглашается с полезностью ИСА как полезной метрикой, на сегодняшний день мало внимания было уделено стандартизации измерения ILV и MLI, двух параметров, используемых для расчета ISA. Очевидно, что, как и при любом измерении, важно попытаться получить объективные данные. Основной целью настоящих исследований является установление стандартизованного протокола для использования сообществом легочных исследований мыши.
Мы попытались уменьшить источники смещения измерений несколькими способами, когда мы разработали этот протокол. Мы обнаружили, что изменение в измерениях ILV может быть краснымПредотвращая утечку жидкости, гарантируя, что размер иглы, вставленной в трахею, согласован по размеру (мы обнаружили, что иглы 18-го калибра тесно связаны с мышами трахеи). Мы также обнаружили, что стенку грудной клетки мыши необходимо тщательно удалить до инфляции PFA, так как это минимизирует потенциальное влияние стенки грудной клетки на измерения ILV. Значения MLI во многом зависят от альвеолярной морфологии. Соответственно, помимо важности использования совпадающих по возрасту и поведенческих совпадений мышей, правильное поддержание альвеолярной морфологии во время процедур фиксации легких является критически важным. Здесь мы использовали широко применяемый метод фиксации: мы раздували легкие при транспульмональном давлении 25 см H 2 O с свежеприготовленным 4% PFA для полного расширения ткани легкого. По нашему опыту, более низкие растягивающие давления могут привести к сокращению ткани, аномальной альвеолярной морфологии и, в конечном счете, привести к снижению значений MLI.
Наблюдения вНаши предыдущие исследования показали, что вспомогательная доля оставшегося легкого проявляет максимальное объемное расширение по сравнению с другими тремя долями правого легкого после регенерации PNX; Вспомогательная доля оставшегося легкого также демонстрирует максимальное увеличение значения морфологических параметров ( например, MLI) 21 , 22 , 23 , 24 . Поэтому мы проанализировали разделы из вспомогательных долей, чтобы избежать изменения от разных легочных долей. Чтобы помочь уменьшить различия между различными разделами, используемыми при количественной оценке MLI, мы контролировали ориентацию лепестка во время внедрения: мы поместили наибольшую поверхность лопасти параллельно дну криомодели. Мы также тщательно контролировали толщину срезов образца, последовательность отбора проб сечения и положение резания во время секционирования. В дополнение к обработке образцов другой импортОдним из аспектов стандартизации является то, что все артерии и вены, плевра, основные дыхательные пути и альвеолярные протоки должны быть исключены из областей ткани, которые оцениваются во время количественной оценки MLI. Артерии, вены и альвеолярные протоки намного больше альвеол (в 4 - 10 раз), поэтому исключение этих больших структур важно для получения надежных измерений перехвата. Для каждой группы 5 мышей адекватны для количественной оценки. Для каждой мыши в общей сложности 15 неперекрывающихся представлений (1000 мкм × 1000 мкм) были выбраны случайным образом из подходящих областей (без артерий и вен, крупных дыхательных путей и альвеолярных каналов) из трех секций вспомогательной доли. Метод внедрения образца и измерение MLI могут также применяться к парафиновым легочным тканям.
В то время как другие определили MLI как общую длину линии, деленную на количество перехватов со скрещенными альвеолярными стенками 25 , здесь мы использовали линейный перехват как линейную длинуМежду двумя соседними альвеолярными эпителиальными стенками в расчетах MLI, без учета толщины мезенхимы из данных MLI. Соответственно, мы вычислили ИСА с использованием ILV, но не общий объем легких.
Для процедур имплантации PNX и протезов выживаемость мышей, подвергающихся PNX, варьировалась от 85% до 90%. Выживаемость мышей, подвергшихся имплантации протезов, составляла около 80%. Во время всех операций необходимо предпринять несколько шагов для улучшения выживаемости мышей. 1) Правильная установка катетера в трахею является необходимым условием для успешной операции PNX. С помощью ларингоскопа можно легко наблюдать трахею мыши, чтобы облегчить безопасную и эффективную эндотрахеальную интубацию. 2) Не проколовайте легкие или сердца во время процедуры. Убедитесь, что грудная клетка пятого левого межреберного пространства широко открыта и что hilum левой доли четко идентифицирован до лобэктомии. При выполнении левой легочной долиУбедитесь, что левая лепесток неповрежден с использованием тупых щипцов, чтобы избежать кровоизлияния в легкие и / или разрыв лоб. Во время закрытия раны держите кончик хирургической иглы подальше от сердца и легких. 3) Будьте осторожны при установке протеза в пустую грудную полость, поскольку чрезмерная сила может вызвать разрыв плевры. 4) Мышей следует помещать на термопластину 38 ° С и контролировать до тех пор, пока их чувства не восстановятся, поскольку послеоперационная гипотермия, как известно, увеличивает мышечную заболеваемость.
После удаления левой легочной доли, как легочные респираторные единицы, так и внутренняя область обмена легкого газа были значительно уменьшены. Через 14 дней после операции ILV, MLI и ISA в остальной легочной ткани были значительно больше у обработанных PNX групп мышей, чем в группе, имплантированной в протезирование, что сильно указывает на то, что введение протеза блокирует индуцированную PNX альвеолярную регенерации. Таким образом, как режим PNX, так и протез-имплантация мышиLs могут быть использованы в качестве мощных инструментов для исследования клеточных и молекулярных событий, возникающих при повторной альвеолизации. Кроме того, значения ISA Яп АТ2 нулевых легких были значительными меньше , чем у контрольных легких при пост-PNX 14 -й день 1, что свидетельствует о том , что наш протокол также подходит для обнаружения нарушенной регенерации генетических мутантных мышей. Строгие и стандартизированные количественные методы, представленные в этом исследовании, могут быть применены для измерения параметров легких и ИСА в исследованиях развития и с генетически модифицированными животными образцами множественных заболеваний, включая эмфизему при хронических обструктивных заболеваниях легких, альвеолярную регенерацию после травм легких и развитие легких дефекты.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Авторы хотели бы поблагодарить Национальный институт биологических наук, Пекин за помощь. Эта работа была поддержана Муниципальным научным фондом Пекина (№ Z17110200040000).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Low cost cautery kit | Fine Science Tools | 18010-00 | |
| Noyes scissors | Fine Science Tools | 15012-12 | |
| Standard pattern forceps | Fine Science Tools | 11000-12 | |
| Castroviejo Micro Needle Holders | Fine Science Tools | 12060-01 | |
| Vessel clips | Fine Science Tools | 18374-44 | |
| I. V. Cannula-20 gauge | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | 29P0601 | |
| Surgical suture | Jinhuan Medical Product Co., LTD. | F602 | |
| Mouse intubation platform | Penn-Century, Inc | Model MIP | |
| Small Animal Laryngoscope | Penn-Century, Inc | Model LS-2-M | |
| TOPO Small Animal Ventilator | Kent Scientific | RSP1006-05L | |
| Thermal pad | Stuart equipment | SBH130D | |
| Pentobarbital sodium salt | Sigma | P3761 | |
| Heparin sodium salt | Sigma | H3393 | |
| Hematoxylin Solution | Sigma | GHS132 | |
| Eosin Y solution, alcoholic | Sigma | HT110116 | |
| 10 mL Pipette | Thermo Scientific | 170356 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| O.C.T Compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| cryosection machine | Leica | CM1950 | |
| Disposable Base Molds | Fisher HealthCare | 22-363-553 | |
| 18 gauge needle | Becton Dickinson | 305199 | |
| Povidone iodine | Fisher Scientific | 19-027132 | |
| 70% ethanol | Fisher Scientific | BP82011 | |
| Infusion sets for single use | Weigao | SFDA 2012 3661704 | |
| Phosphate buffered saline | Gibco | 10010023 | |
| Tapes | 3M Scotch | 8915 | |
| Cotton pad | Vinda | Dr.P | |
| Silicone prosthesis | Custom made | ||
| Brightfield microscope | Olympus | VS120 | |
| Ruler tool | Adobe Photoshop |
References
- Liu, Z., et al. MAPK-Mediated YAP Activation Controls Mechanical-Tension-Induced Pulmonary Alveolar Regeneration. Cell Rep. 16 (7), 1810-1819 (2016).
- Thurlbeck, W. M. Internal surface area and other measurements in emphysema. Thorax. 22 (6), 483-496 (1967).
- Knudsen, L., Weibel, E. R., Gundersen, H. J. G., Weinstein, F. V., Ochs, M. Assessment of air space size characteristics by intercept (chord) measurement: an accurate and efficient stereological approach. J Appl Physiol. 108 (2), 412-421 (2010).
- Weibel, E. R. Morphometry of the Human Lung. , Springer-Verlag. Berlin Heidelberg. (1963).
- Duguid, J. B., Young, A., Cauna, D., Lambert, M. W. The internal surface area of the lung in emphysema. J Pathol Bacteriol. 88, 405-421 (1964).
- Branchfield, K., et al. Pulmonary neuroendocrine cells function as airway sensors to control lung immune response. Science. 351 (6274), 707-710 (2016).
- Ding, B. -S., et al. Endothelial-derived angiocrine signals induce and sustain regenerative lung alveolarization. Cell. 147 (3), 539-553 (2011).
- Dunnill, M. S. Quantitative methods in the study of pulmonary pathology. Thorax. 17 (4), 320-328 (1962).
- Weibel, E. R., Gomez, M. Architecture of the human lung. Use of quantitative methods establishes fundamental relations between size and number of lung structures. Science. 137 (3530), 577-585 (1962).
- Thurlbeck, W. M. The internal surface area of nonemphysematous lungs. Am Rev Respir Dis. 95 (5), 765-773 (1967).
- Butler, J. P., et al. Evidence for adult lung growth in humans. N Engl J Med. 367 (16), 244-247 (2012).
- Hsia, C. C. W., Herazo, L. F., Fryder-Doffey, F., Weibel, E. R. Compensatory lung growth occurs in adult dogs after right pneumonectomy. J Clin Invest. 94 (1), 405-412 (1994).
- Thurlbeck, S. W. M. Pneumonectomy in Rats at Various Ages. Am Rev Respir Dis. 120 (5), 1125-1136 (1979).
- Cagle, P. T., Langston, C., Thurlbeck, W. M. The Effect of Age on Postpneumonectomy Growth in Rabbits. Pediatr Pulmonol. 5 (2), 92-95 (1988).
- Langston, C., et al. Alveolar multiplication in the contralateral lung after unilateral pneumonectomy in the rabbit. Am Rev Respir Dis. 115 (1), 7-13 (1977).
- Cohn, R. Factors Affecting The Postnatal Growth of The Lung. Anatomical Record. 75 (2), 195-205 (1939).
- Hsia, C. C., Wu, E. Y., Wagner, E., Weibel, E. R. Preventing mediastinal shift after pneumonectomy impairs regenerative alveolar tissue growth. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 281 (5), L1279-L1287 (2001).
- Das, S., MacDonald, K., Chang, H. -Y. S., Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. J Vis Exp. (73), e50318 (2013).
- Liu, S., Cimprich, J., Varisco, B. M. Mouse pneumonectomy model of compensatory lung growth. J Vis Exp. (94), (2014).
- Silva, M. F. R., Zin, W. A., Saldiva, P. H. N. Airspace configuration at different transpulmonary pressures in normal and paraquat-induced lung injury in rats. Am J Respir Crit Care Med. 158 (4), 1230-1234 (1998).
- Yilmaz, C., et al. Noninvasive quantification of heterogeneous lung growth following extensive lung resection by high-resolution computed tomography. J Appl Physiol. 107 (5), 1569-1578 (2009).
- Voswinckel, R., et al. Characterisation of post-pneumonectomy lung growth in adult mice. Eur Respir J. 24 (4), 524-532 (2004).
- Ravikumar, P., et al. Regional Lung Growth and Repair Regional lung growth following pneumonectomy assessed by computed tomography. J Appl Physiol. 97, 1567-1574 (2004).
- Gibney, B. C., et al. Detection of murine post-pneumonectomy lung regeneration by 18FDG PET imaging. EJNMMI Res. 2 (1), (2012).
- Muñoz-Barrutia, A., Ceresa, M., Artaechevarria, X., Montuenga, L. M., Ortiz-De-Solorzano, C. Quantification of lung damage in an elastase-induced mouse model of emphysema. Int J Biomed Imaging. 2012, (2012).
