Summary
Ici, nous décrivons une procédure optimisée et axée sur les Langendorff pour l’isolement des cardiomyocytes auriculaires cellule unique d’un modèle de rat de métabolique associés au syndrome d’une insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée. Une régulation manuelle de la pression intraluminale des cavités cardiaques est mis en œuvre pour produire des myocytes fonctionnellement intactes adaptés aux études couplage excitation-contraction.
Abstract
Dans cet article, nous décrivons une procédure optimisée et axée sur les Langendorff pour l’isolement des unicellulaires auriculaires cardiomyocytes (ACMs) d’un modèle de rat du syndrome métabolique (MetS)-liés à une insuffisance cardiaque avec fraction d’éjection préservée (HFpEF). Augmente la prévalence de HFpEF axés sur les MetS et auriculaires cardiomyopathies associées de remodelage de l’auriculaire et fibrillation auriculaire sont cliniquement très pertinents comme transformant auriculaire est un facteur prédictif indépendant de mortalité. Des études avec des cardiomyocytes isolés unicellulaires sont fréquemment utilisés pour corroborer et compléter en vivo résultats. Raréfaction du vaisseau circulatoire et fibrose du tissu interstitiel constituent un facteur potentiellement limitatif pour l’isolement de cellule unique succès de ACMs de modèles animaux de cette maladie.
Nous avons abordé cette question en employant un dispositif capable de réguler manuellement la pression intraluminale des cavités cardiaques au cours de la procédure d’isolement, d’augmenter considérablement le rendement de l’ACMs morphologiquement et fonctionnellement intactes. Les cellules acquis peuvent être utilisés dans une variété de différentes expériences, telles que la culture cellulaire et l’imagerie fonctionnelle de Calcium (c.-à-d., couplage excitation-contraction).
Nous fournissons un protocole étape par étape, une liste de solutions optimisées, approfondies instructions pour préparer le matériel nécessaire et un guide de dépannage complet le chercheur. Bien que l’implémentation initiale de la procédure peut être assez difficile, une adaptation réussie permettra au lecteur d’effectuer des isolations de ACM state-of-the-art dans un modèle de rat de HFpEF MetS liés pour un large éventail d’expériences.
Introduction
MetS décrit un ensemble de facteurs de risque de maladies cardiovasculaires et le diabète type 2 et comprend une augmentation tension artérielle, dyslipidémie (originaire de triglycérides et réduit le cholestérol des lipoprotéines de haute densité), augmenté de jeûne glucose et l’obésité centrale1. La prévalence dans le monde entier des MetS est estimée à 25 – 30 % et constante augmentation2. HFpEF est un syndrome clinique hétérogène, souvent associé aux MetS. Le remodelage cardiaque au cours de la HFpEF et ses phases précédentes (c'est-à-dire, cardiopathie hypertensive) est également accompagné d’un remodelage des oreillettes3. Contractilité réduite et des changements structurels de l’oreillette gauche ont été associés à une mortalité accrue, la fibrillation auriculaire et insuffisance cardiaque-apparition4. Remodelage de l’auriculaire se caractérise par des changements dans la fonction de canal d’ion, l’homéostasie de Ca2 + , structure auriculaire, activation de fibroblastes et de fibrose tissulaire5. Laissé remodelage auriculaire chez HFpEF axés sur les MetS et ses sous-jacent mécanismes pathologiques sont encore mal comprises et nécessitent une complément d’enquête approfondie. Modèles animaux se sont avérés être un outil précieux et conduire à nombreuses avancées dans le domaine des cardiomyopathies auriculaire6,7,8,9.
Des études avec des cardiomyocytes isolés unicellulaires sont fréquemment utilisés pour corroborer et compléter en vivo résultats. Un isolement et culture cellulaire ultérieure éventuelle, permettent pour l’étude de la signalisation des voies et courants des canaux ioniques-couplage excitation-contraction. Dans des conditions physiologiques, les cardiomyocytes ne prolifèrent pas. La fusion entre les séquences régulatrices transcriptionnelles du facteur natriurétique auriculaire et un antigène T grand 40 virus simien chez la souris transgéniques a conduit à la création de l’ACMs immortalisés premiers, nommé AT-110. La poursuite du développement des cellules AT-1 a donné naissance à des cellules HL-1, qui ne peut pas seulement être repiquées en série, mais également des ententes contractuelles spontanément11. Ils font, cependant, montrent des différences structurales et fonctionnelles par rapport à des cellules fraîchement isolées, comme une ultrastructure moins organisé, une fréquence élevée de myofibrilles11et un courant entrant activés par une hyperpolarisation12. L’isolement des cardiomyocytes ventriculaires (VCM) chez les rats et les souris d’une variété de modèles est bien établi13,14,15,16,17,18 , 19. en règle générale, le cœur excisé est monté sur un appareil de Langendorff et marqués perfusé avec un Ca2 +-tampons libres contenant des enzymes digestives, telles que des collagénases et des protéases. Calcium est ensuite réintroduit de façon progressive aux conditions physiologiques. Cependant, même si les protocoles dédiés à l’isolement de l’ACMs sont disponible20,21, en raison d’une augmentation de la fibrose et les différences liées à la pression, leur utilité dans les modèles de maladies avec remodelage auriculaire est limitée.
Dans cet article, nous avons mis en place un protocole pour l’isolement des auriculaires unicellulaires cardiomyocytes provenant d’animaux qui montrent auriculaire retouche (c'est-à-dire, en particulier pour le modèle de rat de ZFS1 pour HFpEF axés sur les MetS)22. Des protocoles d’isolement existant ont été optimisées et complétées par un dispositif simple, sur mesure, de contrôler et de modifier la pression intraluminale des cavités cardiaques, conduisant à des rendements plus élevés des cardiomyocytes morphologiquement et fonctionnellement intactes. Le protocole suivant fournit le chercheur avec un guide étape par étape, une description détaillée de l’équipement sur mesure, une liste de solutions, ainsi que d’un guide de dépannage complet.
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Protocol
Toutes les expériences ont été approuvés par le Comité d’éthique local (TVA T0060/15 et T0003-15) et interprétés en accord avec les directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire (National Institute of Health, U.S.A.).
NOTE : Un organigramme simplifié de la procédure est illustré à la Figure 1.
1. arrangements préalables
- Préparez les tampons selon le tableau 1.
| Solution | PB | CB | DB | SB | S1 | S2 | S3 | NT | |
| Réactif (mM) | |||||||||
| NaCl | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | 135 | |
| KCl | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4.7 | 4 | |
| KH2PO4 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | ||
| Na2HPO4 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | 0,6 | ||
| MgSO4 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | 1.2 | ||
| MgCl | 1 | ||||||||
| HEPES | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | |
| Taurine | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | 30 | ||
| Glucose | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| BDM | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | ||
| CaCl2 | 1 | 0,01 | 0,125 | 0.25 | 0,5 | 1 | |||
| BSA | 150 | 70 | 70 | 70 | |||||
| Enzyme purifiée se fondre (moyenne thermolysine) | 0,195 Wünsch unités/mL | ||||||||
| pH ajusté à | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | 7.4 | |
| pH ajusté à | 37 ° C | 4 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | 37 ° C | |
| pH ajusté avec | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH | NaOH |
Tableau 1 : liste des tampons. PB : perfusion tampon, ce qui peut être conservée pendant 3 jours à 4 ° C (300 mL par animal). CB : canulation tampon, ce qui peut être conservée pendant 3 jours à 4 ° C (200 mL par animal). DB : digestion tampon, ce qui doit être utilisé dans la journée (40 mL par animal). SB : arrêt tampon, qui doit être utilisé dans la journée (2 mL par animal). S1 : Étape 1 tampon, ce qui doit être utilisé dans la journée (2 mL par animal). S2 : Étape 2 tampon, ce qui doit être utilisé dans la journée (2 mL par animal). S3 : Étape 3 tampon, ce qui doit être utilisé dans la journée (2 mL par animal). NT : Tyrode normale, qui doit être utilisé dans la journée (50 mL / animal).
-
Préparer l’appareil Langendorff (Figure 2 a).
- Rincer le système avec 100 mL d’éthanol à 70 %, suivie de 2 bouffées de chaleur de 100 mL d’eau distillée. Remplir le système avec 200 mL de tampon de perfusion (PB).
- Régler le débit de la pompe péristaltique à 3 mL/min.
- Calibrer la température de la PB, laissant l’appareil Langendorff à 39 ° C.
- Placer la canule sur mesure [16 G, 25 mm de long, sharp pointe retiré (Figure 3 a)] sur le dessus de l’appareil de Langendorff et amorcer l’écoulement. Le module de chauffage et régler la valeur du module de chauffage à la température désirée du PB à l’extrémité de la canule. Une fois l’étalonnage de température est terminée, passer la canule sur mesure à la seringue utilisée pour la canulation (Figure 2 b).
- Préparer le dispositif de contrôle de pression (Figure 3) à côté du système de Langendorff. Monter l’aiguille à ailettes sur le collier de trépied et préparer 3 noeuds de blocage.
Remarque : L’activité de l’enzyme collagénase varie avec la température. Il faut une surveillance de la température de l’oreillette gauche, ainsi qu’un ajustement dynamique, plus loin dans la procédure.
- Mettre en place l’équipement pour l’excision de l’orgue et la cannulation selon Figure 2 b. Remplir le bécher, la seringue et la boîte de Pétri avec un tampon de canulation glacee (CB) et préparer les noeuds de canulation.
-
Hépariner la rat avec 500 UI d’héparine par 100 g de poids de rat comme suit.
- Mettre 2 mL d’isoflurane 100 % dans une chambre d’induction de l’anesthésie adapté aux rongeurs. Transférer le rat obèse de 21 semaines ZFS-1 de la cage à la chambre de l’induction. Laissez le rat entrer une anesthésie profonde, indiquée par un ralentissement de la respiration à la moitié de sa fréquence initiale.
- Retirer le rat de la chambre de l’induction. Injecter 500 UI d’héparine par 100 g de poids de rat dans le péritoine, à l’aide d’une seringue d’héparine.
- Retourner le rat dans sa cage et permettent de se réveiller.
Remarque : Il n’est pas nécessaire de maintenir la stérilité au cours de l’étape 1.4. Attendre 20 min avant de passer à l’étape suivante. Une anticoagulation incomplète peut provoquer le sang de coagulation, entraînant des micro-infarctus, ce qui peuvent influer considérablement sur la qualité et le rendement des cardiomyocytes isolés.
2. préparation de coeur
- Mettre 2 mL d’isoflurane 100 % dans une chambre d’induction de l’anesthésie adapté aux rongeurs. Transférer le rat obèse de 21 semaines ZFS-1 de la cage à la chambre de l’induction. Laissez le rat entrer une anesthésie profonde, indiquée par un ralentissement de la respiration à la moitié de sa fréquence initiale.
- Euthanasier l’animal par décapitation à l’aide d’une guillotine adaptée aux rongeurs. Fixer les branches du rat sur une surface de mousse de polystyrène. Soulevez et retirez la peau recouvrant le processus xiphoïde avec ciseaux chirurgicaux. Ouvrir le péritoine sous les cages de côtes sur les deux faces et exposer le diaphragme.
- Ouvrir le diaphragme en effectuant une incision le long de l’arc antérieur à l’aide des ciseaux. Coupez les côtes des deux côtés le long de la linea mediaclavicularis jusqu'à l’OS claviculaires, à l’aide de ciseaux chirurgicaux, pour exposer le médiastin in situ.
- Supprimer les poumons à l’extrémité distale de la hila avec des ciseaux. Découper le thymus pour exposer la crosse aortique.
- Pincez la base du cœur à l’aide de pinces et tirer doucement vers le bas, vers la queue de l’animal. Recoupent l’aorte tout en maintenant une traction sur le cœur, laissant un long segment de 5 mm de l’aorte attaché au coeur. Transférer rapidement le cœur dans la CB glacée 50 mL dans le bécher de 50 ml (Figure 2 b).
Remarque : Au cours des étapes de 2,5 à 3,3, le coeur est effectivement en conditions ischémiques. Éviter de dépasser un total de 3 min pour les étapes suivantes pour ne pas endommager les cardiomyocytes.
3. canulation
- Attendre environ 10 s pour le cœur de refroidir et de saisir les contractions. Transférer le coeur dans une boîte de Pétri contenant 50 mL de produits frais, glacé CB. Retirer délicatement le tissu adipeux entourant l’aorte à l’aide de pinces et ciseaux.
- Insérer la canule sur mesure (le même que dans l’étape 1.2.3), qui est rattachée à la seringue de 10 mL remplie de CB glacée, 3 mm dans l’aorte. Fixer l’aorte sur la canule en liant l’un des deux nœuds canulation (Figure 3 b) dans l’indentation proximale jusqu'à l’extrémité de la canule.
NOTE : Veillez à ne pas endommager la valve aortique par une pénétration avec la canule. - Doucement, rincer l’aorte avec 5 mL de CB glacée à l’aide de la seringue, attachée à la canule jusqu'à ce que pas plus de sang n’est visible dans les artères coronaires. Doucement, massage de l’oreillette gauche avec une pincette et injecter le reste 5 mL de CB, permettant à n’importe quel excès sanguin à être retiré de la cavité dans la boîte de Pétri.
- Attacher le deuxième noeud cannulation (suture : USP 3/0, soie) dans l’indentation distale jusqu'à l’extrémité de la canule. Démonter la canule avec le coeur attaché de la seringue. Monter la canule avec le coeur attaché à la Langendorff à l’aide d’un adaptateur approprié.
Remarque : Ce protocole emploie la tension élevée dans la cavité ventriculaire au cours de la perfusion à l’appareil de Langendorff. Le noeud de canulation supplémentaire est nécessaire pour maintenir cette pression en évitant toute fuite de mémoire tampon antérograde par l’intermédiaire de l’aorte.
4. pression de Manipulation et Digestion
- Démarrer la pompe péristaltique de l’appareil de Langendorff pour initier la perfusion du tissu cardiaque avec PB. Faire un noeud de pêcheur double (suture : USP 3/0, soie) autour de la base du cœur, à l’exclusion de l’aorte. Répétez cette étape jusqu'à ce qu’une inflation de l’oreillette droite et gauche, ainsi que le sinus coronaire, est remarqué.
- Percez l’atrium avec l’aiguille à ailettes de l’appareil de contrôle de pression (Figure 3D) et permettre à l’atrium dégonfler. Manipuler la pression intraluminale de l’atrium en ajustant la hauteur du tuyau papillon. Garder l’atrium légèrement gonflé pendant tout le reste de la procédure ; surveiller et ajuster en conséquence.
Remarque : Cette étape doit être effectuée rapidement, car une inflation prolongée de l’oreillette gauche se traduira par du cardiomyocyte. - Mesurer la température approximative de l’oreillette gauche en plaçant une sonde de température entre l’oreillette gauche et le ventricule gauche. Régler la température de la Langendorff module de chauffage en conséquence, ciblant une température environ de 37 ° C, de l’oreillette gauche.
- Perfuse le coeur avec PB pour un total de 3 min.
- Passer la perfusion à une mémoire tampon de la digestion (DB) pour environ 14 – 18 min.
Remarque : La digestion est terminée lorsque la structure auriculaire gauche s’effondre et le tissu acquiert une texture laiteuse. - Pincez l’atrium avec une pincette et édicter une légère traction. Retirez l’oreillette gauche à l’aide des ciseaux et transférer l’atrium dans un grand bateau de pesage contenant 2 mL de tampon (SB), immerger complètement le tissu d’arrêt.
- Jetez le tissu cardiaque reste suivant les directives du laboratoire où la procédure est effectuée.
5. traitement et réadaptation Calcium des cellules
- Émincer le tissu auriculaire en petits morceaux d’environ 2 x 2 mm à l’aide des ciseaux.
- Disperser les tissus par une légère succion et éjection du tissu en morceaux à l’aide d’une pipette de transfert. Continuez cette procédure pendant environ 5 min jusqu'à ce que l'on observe une dissociation macroscopique du tissu.
Remarque : Éviter les bulles d’air au cours de cette étape, comme exposant les cellules à air seront traduira par du cardiomyocyte. - Transférer les cellules dans un tube conique 15 mL. Laisser les morceaux de tissu se contenter de 30 s. transfert le surnageant dans un autre tube conique de 15 mL. Laissez les cellules à se contenter de 15 min.
- Retirer et jeter le surnageant. Ajouter 2 mL de tampon de l’étape 1 (voir tableau 1). Laissez les cardiomyocytes à se contenter de 10 min.
Remarque : Le liquide surnageant au rebut comprend également les fibroblastes et les cellules endothéliales. Veuillez vous référer à d’autres protocoles, si l'on souhaite utiliser ces cellules pour expériences14,23. Le culot contiendra principalement des cardiomyocytes auriculaires, qui peut être confirmés par microscopie. Les caractéristiques microscopiques des cardiomyocytes auriculaires sont discutées à l’étape 6.1. - Retirer et jeter le surnageant. Ajouter 2 mL de tampon de l’étape 2. Laissez les cardiomyocytes à se contenter de 10 min.
- Retirer et jeter le surnageant. Ajouter 2 mL de tampon de l’étape 3. Laissez les cardiomyocytes à se contenter de 10 min.
- Retirer et jeter le surnageant. Ajouter 250 µL de normal Tyrode (NT) contenant 1 mM Ca2 +.
- Transférer 50 µL de la Tyrode normale contenant des cardiomyocytes auriculaires sur un plateau de fond en verre, qui a été recouvert de laminine 25 % (et mis à sécher au préalable). Laissez les cardiomyocytes à se contenter de 10 min.
- Remplir un plat à fond en verre avec 500 µL de NT contenant 1 mM CaCl2.
6. fonctionnelle évaluation du couplage Excitation-contraction
- Évaluer la morphologie cellulaire et la viabilité dans un microscope optique avec un grossissement de X 20 (Figure 4 a et 4 b). Au hasard, sélectionnez environ 100 cellules et classer comme viables ou non viables afin d’estimer la viabilité de la technique d’isolation cellulaire.
Remarque : Des cellules viables sont caractérisés par la structure du sarcomère symétrique, l’absence de bulles de la membrane et une forme de tige. -
Charger les cellules avec le Ca2 +-colorant fluorescent sensible à 20 min d’achever l’étape 5,9.
- Ajouter 10 µM Fluo4-AM à 500 µL de NT. Enlever le surnageant de la capsule de fond en verre (de l’étape 5,9). Ajouter le nouveau testament contenant Fluo4-AM dans le plat à fond en verre. Incuber le mélange pendant 20 min à température ambiante. Retirer et jeter le surnageant. Laver l’échantillon 2 x avec 500 µL de NT.
-
Visualiser le Ca2 +-excitation avec un microscope confocal comme suit.
- Placer la capsule de fond en verre à un microscope confocal et visualiser le Ca2 +-excitation avec un microscope confocal (laser intensité à 5,8 %, excitation à 488 nm ; émission à 515 nm) à l’aide d’un grossissement de X 40.
- Perfuse les cellules avec NT chauffé à 37 ° C à l’aide d’un dispositif approprié de superfusion. Vous pouvez également réchauffer les cellules à l’aide d’un incubateur de microscope-monté de chaleur.
- Stimuler les cardiomyocytes dans un champ électrique avec électrodes stimulateur disponibles dans le commerce, microscope monté à une fréquence de 1 Hz et un courant électrique de 24 a. Attendez 1 min pour permettre les cellules atteindre un état stable de Ca2 + manutention.
- Placez la ligne de balayage parallèle à l’axe transversal, à mi-chemin entre le noyau et le bord d’un choisis au hasard, macroscopiquement contractantes cellulaire. Acquérir des images à balayage ligne par balayage répétitif.
- Utiliser un logiciel d’imagerie librement disponible pour estimer l’intensité du signal immédiatement avant une stimulation électrique (F0) à travers toute la cellule. Tracer l’intensité du signal à travers toute la cellule au cours du cycle de 1 stimulation (F). Diviser (F) par (F0) afin d’obtenir le respectifs Ca2 + transitoire.
Figure 1 : organigramme simplifié de la procédure d’isolement. La procédure est très sensible au temps avant d’avoir terminé la digestion enzymatique des myocytes. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 2 : préparation du matériel avant l’isolement précédant. (A), ce panneau indique un appareil de Langendorff self-made : (1) une cuve double enveloppe avec PB ; (2) une cuve double enveloppe avec CB ; (3) un robinet à 3 voies ; (4) une seringue ; (5) une pompe péristaltique ; (6) une immersion de chauffage ; (7) un barboteur chemisé ; et (8) la canule et le cœur. (B), ce panneau montre la mise en place pour l’excision canulation et orgue pour un flux de travail optimisé : (1) un bécher de 100 mL avec 50 mL de CB glacée ; (2) une seringue de 10 mL avec CB glacée ; (3) une boîte de Pétri avec CB glacée ; (4) une source de lumière ; (5) la canule sur mesure avec une canulation noeud (voir aussi Figure 3 a et 3 b) ; (6) pinces fine, courbé ; (7) pinces à tissus ; pince fine (8), inclinée à 45° ; (9) ciseaux chirurgicaux abdominale ; (10) des ciseaux chirurgicaux ; (11) 4 x 30 G aiguilles ; et (12) une aiguille de 15 G. (C), ce panneau indique l’équipement monté sur microscope pour l’imagerie confocale : électrodes électrostimulateur (1) ; (2) un stylo superfusion ; (3) un plat de fond en verre avec l’ACMs ; et (4) électrodes électrostimulateur platine immergées. (D) ce panneau montre la mise en place de microscope pour l’imagerie confocale : (1) la microscopie confocale ; (2) un stylo superfusion ; (3) un réservoir tampon superfusion ; (4) un régulateur de débit superfusion ; (5) une superfusion chauffage module ; (6) un poste de travail informatique ; et (7) un stimulateur électrique. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 3 : équipement fait sur commande. (A), ce panneau montre la manipulé 15 G canule avec un raccord Luer lock. Les flèches indiquent les deux encoches pour les noeuds de canulation. (B), ce sont les noeuds de canulation, deux doubles noeuds de pronation placés au-dessus de l’autre pour le serrage rapide. Les flèches indiquent où et dans laquelle ordonnance le noeud doit être resserrée. (C), ce panneau indique le dispositif de commande de pression assemblés. Une aiguille à ailettes 21 G est accrochée dans un collier de trépied. Le tuyau est maintenue à la même hauteur que l’aiguille. La vis supérieure est ouverte. L’élévation du tuyau papillon peut être modifiée comme indiqué par les flèches afin de changer la pression intraluminale de l’oreillette gauche. Atrium (D), la gauche est percé avec le dispositif de réglage de pression. Cette photo montre une oreillette gauche idéalement gonflé. L’ellipse marque l’emplacement de la demi-nœud. Atrium (E), la gauche est percé avec le dispositif de réglage de pression. Cette photo montre une oreillette gauche trop gonflé, qui donnera lieu à un rendement inférieur de ACMs viables. L’ellipse marque l’emplacement de la demi-nœud. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Representative Results
À 21 semaines d’âge, 60 à 90 % de l’ACMs viables (estimé comme décrit à l’étape 6.1), après la réadaptation calcium (étape 5.4 – 5,7), peuvent être isolé des rats obèses ZSF-1 par cette méthode (Figure 4 a). Chez le rat, ACMs sont caractérisés par un autre et plus phénotype hétérogène par rapport aux versions24,25. Figure 4 b montre un ACM individuel avec membranes préservés et structure du sarcomère, les deux indicateurs forts d’une cellule fonctionnellement intégrée.
L’ACMs acquises peuvent être traitées dans une variété de façons. Comme illustré à la Figure 5, les cellules pourraient être chargés avec des colorants fluorescents utilisés pour étudier la morphologie ou la fonction. Par exemple, di-8-ANEPPS a été utilisé pour délimiter le système tubulaire dans une cellule de rat auriculaire (Figure 5 a). Dans une autre série d’expériences, mitochondries-coloration loin-fluorescence rouge colorant (p. ex., mitotracker-rouge-FM) est employée pour détecter des mitochondries cytosoliques (Figure 5 b) dans le remodelage de l’auriculaire. Comme illustré à la Figure 5, ACMs isolés avec ce protocole conviennent également aux cellules vivantes Ca2 + imagerie et montrent intact excitation-contraction de couplage avec un 1 Hz champ-stimulation. Toutes les images peuvent être utilisées pour une analyse ultérieure en utilisant une variété d’algorithmes disponibles pour le chercheur6,7 (Figure 5).
Figure 4 : rendement respectif de viable, monocellulaires am (A), ce panneau affiche le rendement d’un isolement après la réadaptation de l’ACMs au 1 mM Ca2 + dans NT. (B), ce panneau affiche un cardiomyocyte auriculaire isolée, unicellulaires. La structure du sarcomère, membrane cellulaire et noyau sont clairement visibles. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
Figure 5 : coloration de rat ACMs avec les colorants fluorescents. (A) ce panneau montre la coloration d’une membrane cellulaire et réseau tubulaire avec le colorant fluorescent Di8ANNEPS. (B), ce panneau affiche la coloration des mitochondries avec le colorant fluorescent mitotracker-rouge-FM (C), ce panneau affiche le balayage ligne transversale d’un Ca2 +-excitation avec le colorant fluorescent Fluo4-AM sur une seule cellule. Les flèches indiquent la stimulation électrique, réalisée à 1 Hz. (D) ce panneau montre les longitudenal Ca2 + transitoires dérivées de panel C. S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.
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Discussion
Ici, nous avons tout d’abord décrit un protocole pour l’isolement de l’ACMs cellule unique d’un modèle de rat de MetS liés HFpEF qui montre marqué auriculaire retouche22. La procédure est particulièrement difficile car l’excès de tissu graisseux peut faire la préparation chirurgicale, ainsi que la canulation de l’aorte, de plus en plus difficile. Le guide de dépannage fourni dans le tableau 2 adresses les questions les plus courantes de la technique d’isolation.
| Problème | Cause possible | Solution |
| Circule pas dans le tuyau de papillon | Une mauvaise fermeture de l’aorte avec les noeuds de canulation | Enlever du tissu graisseux avant de serrer |
| Ajouter le 3ème noeud de canulation avec échancrure respectif | ||
| Insérer le noeud avec la main pour une force accrue | ||
| Aiguille bloquée | Réajustez la position dans la lumière | |
| Débloquer par traction douce avec seringue | ||
| Oreillette droite / sinus coronaire non gonflé | Une mauvaise fermeture de la base de coeur | Flux de bloc avec des nœuds supplémentaires |
| Oreillette droite endommagée au cours de la préparation | Fermer la fuite avec clips/noeuds | |
| Mauvaise digestion / atrium ne pas adoucir | Activité enzymatique réduite grâce à mauvaise température | Ajuster la température à 37 ° C |
| Enzyme inactive/dégradés | Remplacer | |
| Vieux/trop fibreuse atrium | Augmenter le temps de digestion (par incréments de + 50 %) | |
| Valve aortique endommagée | Pénétration peu profonde au cours de la canulation | |
| Rendement des cellules pauvres | Atrium trop digéré | Diminuer le temps de digestion (par incréments de + 25 %) |
| Réduire la pression intraluminale en abaissant le tuyau de papillon | ||
| Atrium digérés sous | Augmenter le temps de digestion (par incréments de 25 %) | |
| Augmentation de la pression intraluminale en soulevant le tuyau de papillon | ||
| Dispersion de cellule trop agressif | Soyez plus doux |
Tableau 2 : guide de dépannage. Ce tableau affiche les problèmes courants de la technique d’isolation et de leurs solutions respectives.
Dans une étude récente, nous avons montré que le modèle de rat obèse ZFS-1 montre un remodelage massif d’auriculaire avec une augmentation de la taille auriculaire22. Une augmentation de la taille de l’auriculaire gauche a été reconnue comme un important marqueur pronostique pour la dysfonction diastolique26 et provoque une raréfaction des vaisseaux microvasculaires par rapport au tissu. Cela conduit à une distribution réduite du tampon digestif par le biais de la perfusion rétrograde de l’aorte pendant la procédure d’isolement, rendant l’isolement de cellules individuelles dans ce modèle particulièrement difficile. Autres caractéristiques de la marque de remodelage de l’auriculaire, fibrose auriculaire et une augmentation de la fibrose ont été démontrés pour rats ZDF — un modèle de rat pour diabète métabolique et une souche de la ZFS1 les rats27. Les dépôts de collagène nuire à l’efficacité des enzymes digestives pour libérer les cardiomyocytes de la matrice extracellulaire et, par conséquent, besoin de plus amples ajustements de la cellule d’isolement procédure28.
Le mécanisme par lequel le dispositif facilite les résultats de l’isolement améliorée dans ce modèle de remodelage auriculaire est probablement lié à un affaiblissement localisé du débit sanguin coronaire de l’oreillette gauche. Une composante importante du débit sanguin coronaire est la pression de perfusion coronaire, qui est définie comme la différence entre la pression de l’artère coronaire et la pression télédiastolique du cavité respectifs29. Au cours de la procédure décrite, un blocage de la base du cœur entraîne une augmentation globale de la pression de l’artère coronaire et la pression intraluminale dans le cœur. La ponction ultérieure de l’oreillette gauche facilite une goutte locale et sélective de la pression intraluminale dans la cavité auriculaire gauche. Ainsi, non seulement un gradient de pression de perfusion coronaire grand est établi, mais le volume de perfusion est également augmenté par la solution de digestion détournés du ventricule gauche encombrée à l’oreillette gauche.
En outre, le choix des enzymes de digestion est crucial pour l’isolement de l’ACM : purifié des mélanges d’enzymes de collagénase I et II a été montré supérieur au moins ciblées et moins pures enzymes comme collagénases30. Cette enzyme ne permet pas seulement d’un rendement plus élevé des cardiomyocytes morphologiquement et fonctionnellement intactes, mais permet également de réduire toute agglutination des cellules individuelles après leur isolement31. Enzyme purifiée des mélanges de collagénases avec une supplémentaire a élevé ou moyen thermolysine contenu sont plus couramment utilisés pour des isolations de cardiomyocyte rat. Tandis que les versions sont mieux isolées à des concentrations plus élevées, les meilleurs résultats des myocytes auriculaires ont été acquis avec une concentration de 0,195 Wünsch unités/mL en utilisant ce protocole32.
Comme augmente la prévalence de HFpEF axés sur les MetS2 et cardiomyopathies auriculaires menant à un remodelage auriculaire et auriculaires, fibrillation sont cliniquement très pertinent, les recherches dans ce domaine est d’un intérêt crucial. Beaucoup de nouveaux modèles animaux pour HFpEF voient le jour33,34 et auriculaires de retouche en ligne avec une augmentation de l’incidence des troubles du rythme auriculaire sont caractéristiques de la marque distinctive de la maladie. La méthode décrite permet aux chercheurs d’isoler des cardiomyocytes seul viables de modèles de rat avec un remodelage auriculaire pour un complément d’étude avec un rendement exceptionnel et préservé la fonction mécanique et électrique.
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Disclosures
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Acknowledgments
Cette recherche a été financée par le DZHK (Centre allemand de recherche cardiovasculaire, D.B.), le EKFS (Stiftung Else-Kröner-Fresenius, F.H.) et par le BMBF (ministère allemand de l’éducation et la recherche), ainsi que la Bosnie-Herzégovine-Charité cliniciens programme financé de la Charité - Universitätsmedizin Berlin et l’Institut de santé de Berlin (F.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| ZSF-1 Obese rat | Charles River Laboratories, Inc. | 21 weeks old | |
| Fine Iris Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14094-11 | |
| Surgical Scissors | Fine Science Tools GmbH | 14001-18 | |
| Micro Dressing Forceps (curved, serrated) | Aesculap, Inc. | BD312R | |
| Tissue Forceps (straight, 1 x 2 teeth) | Aesculap, Inc. | BD537R | |
| Tying Forceps (angled) | Aesculap, Inc. | MA624R | |
| Rodent and Small Animal Guillotine | Kent Scientific Corp. | DCAP | |
| Low Cost Induction Chamber 3.0 L | Kent Scientific Corp. | SOMNO-0730 | |
| Butterfly Winged Infusion Set 21 G | Hospira, Inc. | 181106101 | |
| Abbocath 16 G | Hospira, Inc. | 0G7149702 | |
| Microlance Hypodermic Needle | Becton Dickinson GmbH | 301300 | modify needle to make cannula |
| Braun Original Perfusor Syringe 50 ml | B. Braun Melsungen AG | 8728810F | |
| Braun Inject Solo Syringe 10 ml | B. Braun Melsungen AG | 2057926 | |
| Beaker 50ml | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 106 17 | |
| Duroplan petri dish (100 x 20 mm) | Duran Group (DWK Life Sciences GmbH) | 21 755 48 | |
| Seraflex Suture USP 3/0 | SERAG-WIESSNER GmbH & Co. KG | IC208000 | |
| VWR disposable Square Weighin Boats 100ml | VWR, Inc. | 10803-148 | |
| Styrofoam surface | |||
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | 71380 | |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | P4504 | |
| Potassium phosphate monobasic | Sigma-Aldrich, Inc. | P5379 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich, Inc. | S0876 | |
| Magensium sulfate heptahydrate | Sigma-Aldrich, Inc. | 230391 | |
| Magensium chloride | Sigma-Aldrich, Inc. | M8266 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich, Inc. | H3375 | |
| Taurine | Sigma-Aldrich, Inc. | T0625 | |
| Glucose | Sigma-Aldrich, Inc. | G7528 | |
| 2,3-Butanedione monoxime | Sigma-Aldrich, Inc. | B0753 | |
| Calcium chloride solution (1 M) | Sigma-Aldrich, Inc. | 21115 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma-Aldrich, Inc. | A9647 | |
| Liberase | Roche (Sigma-Aldrich, Inc.) | LIBTM-RO | |
| Heparin | Rotexmedica GmbH | 3862357 | |
| Forene (Isoflurane) | Abbvie Deutschland GmbH & Co. KG | 10182054 | |
| Laminin from Engelbreth-Holm-Swarm murine sarcoma basement membrane | Sigma-Aldrich, Inc. | L2020 | |
| WillCo glass-bottom dish 500µl 0.005mm | WillCo Wells B.V. | HBST-3522 | |
| Fluo4 AM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | F14201 | 5µM for 20min at RT |
| Di-8-ANNEPS | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | D3167 | 10µM for 45 min at 37° C |
| Mitotracker RED FM | Invitrogen (Thermo Fisher Scientific, Inc.) | M22425 | 20nM for 30 min at 37° C |
| Jacketed reaction vessel 500 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107024414 | |
| Jacketed reaction vessel 1000 ml | Gebr. Rettberg GmbH | 107025414 | |
| Jacketed bubble trap | Gebr. Rettberg GmbH | 134720001 | |
| ED heating immersion circulator | Julabo GmbH | 9116000 | |
| Reglo Digital MS-2/6 peristaltic pump | Ismatec (Cole-Parmer Gmbh) | ISM 831 | |
| Voltcraft Thermometer 302 K/J | Conrad Electronic SE | 030300546 | |
| Tubing | |||
| LSM 700 microscope | Carl Zeiss, Inc. | ||
| ZEN 2.3 imaging software | Carl Zeiss, Inc. | 410135-1011-240 | |
| Single channel heater controller TC-324B | Warner Instruments, LLC | 64-2400 | |
| 8 channel perfusion system | Warner Instruments, LLC | 64-0185 | |
| 8 channel Multi-Line In-Line Solution Heaters | Warner Instruments, LLC | 64-0105 |
References
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